Rozdział substancji następuje w wyniku przepuszczenia
roztworu badanej mieszaniny przez specjalnie spreparowaną
fazę rozdzielczą (złoże), zwaną też fazą stacjonarną. Fazą
rozdzielczą są substancje wykazujące zdolności sorpcyjne lub
zdolne do innych oddziaływań na substancje przepływające.
Podczas przepływu eluenta (fazy ruchomej) przez fazę
rozdzielczą następuje proces wymywania zaadsorbowanych
(lub związanych) substancji. Intensywność tego procesu jest
różna dla poszczególnych składników mieszaniny.
W zależności od rodzaju eluentu czyli substancji w której
rozpuszcza się badaną mieszaninę rozróżnia się następujące
techniki chromatograficzne:
* chromatografia cieczowa - eluentem jest jakiś ciekły
rozpuszczalnik
* chromatografia gazowa - eluentem jest gaz (zwykle wodór
lub hel).
Chromatografia
Złoża chromatograficzne
Sepharose
Mono beads
W zależności od parametrów procesu:
Chromatograficzne systemy niskociśnieniowe
Chromatograficzne systemy niskociśnieniowe – przepływ
eluentu wymuszany jest grawitacyjnie lub z wykorzystaniem
prostych
pomp
pracujących
przy
ciśnieniach
nie
przekraczających 0,5 MPa
HPLC
HPLC - high performance/pressure liquid chromatography,
wysoko-sprawna/-ciśnieniowa chromatografia cieczowa -
odmiana cieczowej chromatografii kolumnowej z użyciem
eluenta pod wysokim ciśnieniem (powyżej 5 MPa);
FPLC
FPLC - fast protein liquid chromatography – szybka białkowa
chromatografia cieczowa - odmiana HPLC działająca na
niższych ciśnieniach (do 5 MPa), stosująca prócz złóż
sorpcyjnych, także zwykłe złoża typu sit molekularnych,
służąca głównie do rozdziału białek i polipeptydów.
Chromatografia
W zależności od rodzaju i sposobu przygotowania fazy rozdzielczej:
*
TLC - thin layer chromatography
TLC - thin layer chromatography, chromatografia
cienkowarstwowa - w której fazę rozdzielczą stanowi cienka
warstwa żelu naniesiona na sztywną płytkę.Na tak spreparowaną
płytkę nanosi się próbkę roztworu, po czym na skutek działania sił
kapilarnych, grawitacji lub pola elektrycznego następuje przepływ
i rozdział mieszaniny;
*
chromatografia bibułowa
chromatografia bibułowa - w której fazę rozdzielczą stanowi
pasek lub arkusz bibuły filtracyjnej lub specjalnego typu bibuły
chromatograficznej;
* chromatografia kolumnowa - w której faza rozdzielcza jest
umieszczona w specjalnej kolumnie, przez którą przepuszcza się
następnie roztwór badanej mieszaniny. Przepływ roztworu przez
kolumnę można wymuszać grawitacyjnie lub stosując różnicę
ciśnień na wlocie i wylocie kolumny;
Chromatografia
Three Phase Strategy
For Membrane Proteins
(www.amershambiosciences.com)
Fast Protein Liquid Chromatograph (FPLC)
1
2
3
5
4
• pompy
Zawór injekcyjny
Wlot kolumny
Detektor
Kolektor frakcji
(www.pharmacia.com)
Chromatoogniskowanie
-technika chromatograficzna pozwalająca rozdzielić
molekuły ze
względu na wartość punktu izoelektrycznego
Złoże używane do chromatoogniskowania jest słabym
anionitem.
W pierwszym etapie złoże jest ekwilibrowane buforem o
wartości pH równej ustalonej górnej granicy pH, w jakiej ma
przebiegać rozdział (np. bufor startowy musi mieć pH = 9,0
jeżeli gradient chromatoogniskowania ustaliliśmy na 9,0 –
6,0). Po ekwilibracji nanoszona jest próba, a elucję
przeprowadza się rozcieńczonym 10-krotnie Polybuffer.
Polybuffer – licencjonowana mieszanina
niskocząsteczkowych molekuł charakteryzujących się
zróżnicowanymi wartościami pI. Roztwór bardzo złożony, na
jedną jednostkę pH, którą ma buforować wykorzystywane
jest około 200 różnych związków.
Białka wypływają z kolumny w roztworze odpowiadającym
pI.
Chromatoogniskowanie – zalety i wady:
Zalety:
Zalety:
- możliwa do uzyskania bardzo wysoka rozdzielczość (nawet 0,02
jednostki pH)
- przeprowadzenie rozdziału nie wymaga dysponowania
skomplikowanymi systemami chromatograficznymi
Wady:
Wady:
- technika jest kosztowna, koszt Polybuffer jest wysoki; nie ma
możliwości zastosowania tańszych odczynników,
- składniki Polybuffer muszą zostać usunięte przez kolejnymi analizami
(sekwencjonowanie, immunizacja, pomiar aktywności enzymatycznej),
a to jest często kłopotliwe i nie zawsze skuteczne
Rozdział białek techniką chromatoogniskowania
Chromatografia interakcji
hydrofobowych
-
aminokwasy hydrofobowe (leucyna, izoleucyna, walina,
fenyloalanina, tyrozyna) tworzą w obrębie cząsteczki białka
tzw. domeny hydrofobowe. Zarówno ilość takich obszarów,
jak i ich umiejscowienie stanowi indywidualną cechę białka i
może być wykorzystane do jego izolacji.
Interakcje hydrofobowe
Ligand
-
łańcuchy alkilowe lub aromatyczne grupy arylowe unieruchomione na nośniku,
- im większa długość łańcucha węglowodorowego, tym silniejsze oddziaływania
hydrofobowe
Czynniki wpływające na przebieg
separacji z wykorzystaniem HIC:
- właściwości hydrofobowe białek
- rodzaj i gęstość powierzchniowa liganda,
- rodzaj i stężenie soli
Na
2
SO
4
>K
2
SO
4
>(NH
4
)
2
SO
4
>Na
2
HPO
4
>NaCl>KCl>LiCl>NaBr>KBr
- wartość pH – siła oddziaływań hydrofobowych jest wyższa w niższym pH.
Z drugiej strony, niskie wartości pH mogą denaturować białka i wpływać
na właściwości buforów. Z reguły rozdziały przeprowadza się w zakresie
pH 6,0 – 8,5
- temperatura – im wyższa temperatura tym oddziaływania hydrofobowe
są silniejsze
- skład solwentów – obecność alkoholi i detergentów obniżają siłę wiązania
ligandów z białkiem konkurując o miejsca wiązania na złożu
Przykładowe zastosowanie techniki HIC do izolacji
przeciwciał monoklonalnych
Rozdział techniką chromatografii odwróconej fazy
Chromatografia
powinowactwa
jest
odmianą
chromatografii adsorpcyjnej, w której wykorzystuje się wzajemne
powinowactwo (interakcję) dwóch substancji.
Ze względu na swe unikalne właściwości metoda ta
pozwala znacznie uprościć procedurę izolacji wybranych molekuł,
przy jednoczesnym zachowaniu ich biologicznej aktywności
.
Chromatografia powinowactwa
Chromatografia powinowactwa
Oddziaływać między sobą mogą:
- hormon i receptor,
- enzym i substrat,
- enzym i inhibitor,
- przeciwciało i antygen,
- komplementarnei odcinki kwasów nukleinowych,
- kwasy nukleinowe i białka,
- lektyny i glikoproteiny,
- dopełniacz i przeciwciało z grupy IgG.
Interakcja substancji rozpuszczonej w fazie
Interakcja substancji rozpuszczonej w fazie
ruchomej z unieruchomionym ligandem
ruchomej z unieruchomionym ligandem
może mieć różny charakter
może mieć różny charakter
I.
Przez kolumnę przepuszcza się materiał zawierający molekuły
komplementarne do liganda. Przemieszczające się w obrębie
złoża molekuły odnajdują unieruchomiony ligand i wiążą się z
nim.
Chromatografię powinowactwa
Chromatografię powinowactwa
przeprowadza się
przeprowadza się
etapami
etapami
(1)
(1)
II. Odmycie nieswoiście zaadsorbowanych molekuł
Chromatografię powinowactwa
Chromatografię powinowactwa
przeprowadza się
przeprowadza się
etapami
etapami
(2)
(2)
III. Dysocjacja powstałych kompleksów i elucji swoiście
związanych
makromolekuł.
Chromatografię powinowactwa
Chromatografię powinowactwa
przeprowadza się
przeprowadza się
etapami
etapami
(3)
(3)
Chromatografia powinowactwa
Chromatografia powinowactwa
Można zastosować specyficzny eluent, zawierający kompetytor
współzawodniczący o miejsca wiążące z ligandem.
Można eluować związane substancje w sposób niespecyficzny,
za
pomocą
- buforów o niskiej lub wysokiej wartości pH (np. bufor
octanowy,
bufor węglanowy, itp.),
- roztworów o wysokiej sile jonowej (2,5M NaCl),
- rozworów związków rozrywających wiązania wodorowe (4-8 M
mocznik, 6M guanidyna).
Dysocjację kompleksów przeprowadza się
różnymi metodami
Po zakończeniu elucji należy usunąć zastosowane w tym
celu substancje od wyizolowanych makromolekuł. Można to zrobić
różnymi metodami, np.stosując dializę, ultrafiltrację lub filtrację
żelową.
+
brak ograniczeń w stosunku do objętości nanoszonej na
kolumnę
próbki oraz do stężenia separowanego materiału w próbce
+
możliwość silnego zatężenia izolowanej molekuły
+
bardzo wysoka specyficzność
+
możliwość uzyskania w czystej postaci molekuł, które często
nie
mogą być izolowane innymi metodami
+
wyizolowany materiał charakteryzuje się bardzo wysokim
stopniem
czystości pomimo zastosowania tylko jednego kroku
preparatywnego.
Zalety i wady metody chromatografii
Zalety i wady metody chromatografii
powinowactwa
powinowactwa
-
trudności z uzyskaniem niektórych specyficznych ligandów
-
częsta konieczność przygotowania złoża we własnym zakresie
-
niska trwałość niektórych ligandów
Jako nośniki w chromatografii powinowactwa stosowane
są złoża, które tradycyjnie wykorzystuje się do filtracji żelowej, z
tym, że przed użyciem wymagają one odpowiedniej aktywacji. Są
to
pochodne
dekstranowe
(Sephadex),
agarozowe
(Sepharose), rzadko poliakryloamidowe.
Oprócz nośników, które można przygotować do
chromatografii powinowactwa we własnym zakresie, dostępne są
również złoża przystosowane już do chemicznego wiązania
liganda.
Złoża stosowane w chromatografii powinowactwa
Złoża do samodzielnego wiązania ligandów
Złoża do samodzielnego wiązania ligandów
oferowane przez
oferowane przez
Amersham PharmaciaBiotech
Amersham PharmaciaBiotech
Wprowadzenie grup dystansowych pomiędzy ligandem
separowanymi molekułami pozwala zwiększyć możliwość
wiązania makromolekuł do niskocząsteczkowych ligandów.
Eliminuje się w ten sposób efekty reszt cukrowych nośnika
podczas sorpcji makromolekuł.
Jest to szczególnie istotne wówczas, gdy ligandem jest
krótki peptyd, a substancja izolowana przy jego pomocy jest
znacznie większa i może mieć przysłonięte przestrzennie miejsce
wiążące ligand. Można w takich sytuacjach zastosować
odpowiednio zmodyfikowane nośniki, które mają wbudowane
kilkuwęglowe (najczęściej 6-cio atomowe) łańcuchy alifatyczne.
Za ich pośrednictwem dochodzi dowiązania liganda z nośnikiem.
Document Outline
