Rozdział substancji następuje w wyniku przepuszczenia
roztworu badanej mieszaniny przez specjalnie spreparowaną
fazę rozdzielczą (złoże), zwaną też fazą stacjonarną. Fazą
rozdzielczą są substancje wykazujące zdolności sorpcyjne lub
zdolne do innych oddziaływań na substancje przepływające.
Podczas przepływu eluenta (fazy ruchomej) przez fazę
rozdzielczą następuje proces wymywania zaadsorbowanych
(lub związanych) substancji. Intensywność tego procesu jest
różna dla poszczególnych składników mieszaniny.

W zależności od rodzaju eluentu czyli substancji w której
rozpuszcza się badaną mieszaninę rozróżnia się następujące
techniki chromatograficzne:

* chromatografia cieczowa - eluentem jest jakiś ciekły
rozpuszczalnik
* chromatografia gazowa - eluentem jest gaz (zwykle wodór
lub hel).

Chromatografia

Złoża chromatograficzne

Sepharose

Mono beads

W zależności od parametrów procesu:

Chromatograficzne systemy niskociśnieniowe

Chromatograficzne systemy niskociśnieniowe – przepływ
eluentu wymuszany jest grawitacyjnie lub z wykorzystaniem
prostych

pomp

pracujących

przy

ciśnieniach

nie

przekraczających 0,5 MPa

HPLC

HPLC - high performance/pressure liquid chromatography,
wysoko-sprawna/-ciśnieniowa chromatografia cieczowa -
odmiana cieczowej chromatografii kolumnowej z użyciem
eluenta pod wysokim ciśnieniem (powyżej 5 MPa);

FPLC

FPLC - fast protein liquid chromatography – szybka białkowa
chromatografia cieczowa - odmiana HPLC działająca na
niższych ciśnieniach (do 5 MPa), stosująca prócz złóż
sorpcyjnych, także zwykłe złoża typu sit molekularnych,
służąca głównie do rozdziału białek i polipeptydów.

Chromatografia

W zależności od rodzaju i sposobu przygotowania fazy rozdzielczej:

*

TLC - thin layer chromatography

TLC - thin layer chromatography, chromatografia

cienkowarstwowa - w której fazę rozdzielczą stanowi cienka
warstwa żelu naniesiona na sztywną płytkę.Na tak spreparowaną
płytkę nanosi się próbkę roztworu, po czym na skutek działania sił
kapilarnych, grawitacji lub pola elektrycznego następuje przepływ
i rozdział mieszaniny;

*

chromatografia bibułowa

chromatografia bibułowa - w której fazę rozdzielczą stanowi

pasek lub arkusz bibuły filtracyjnej lub specjalnego typu bibuły
chromatograficznej;

* chromatografia kolumnowa - w której faza rozdzielcza jest
umieszczona w specjalnej kolumnie, przez którą przepuszcza się
następnie roztwór badanej mieszaniny. Przepływ roztworu przez
kolumnę można wymuszać grawitacyjnie lub stosując różnicę
ciśnień na wlocie i wylocie kolumny;

Chromatografia

Three Phase Strategy

For Membrane Proteins

(www.amershambiosciences.com)

Fast Protein Liquid Chromatograph (FPLC)

1

2

3

5

4

• pompy

Zawór injekcyjny

Wlot kolumny

Detektor

Kolektor frakcji

(www.pharmacia.com)

Chromatoogniskowanie

-technika chromatograficzna pozwalająca rozdzielić
molekuły ze
względu na wartość punktu izoelektrycznego

Złoże używane do chromatoogniskowania jest słabym
anionitem.
W pierwszym etapie złoże jest ekwilibrowane buforem o
wartości pH równej ustalonej górnej granicy pH, w jakiej ma
przebiegać rozdział (np. bufor startowy musi mieć pH = 9,0
jeżeli gradient chromatoogniskowania ustaliliśmy na 9,0 –
6,0). Po ekwilibracji nanoszona jest próba, a elucję
przeprowadza się rozcieńczonym 10-krotnie Polybuffer.
Polybuffer – licencjonowana mieszanina
niskocząsteczkowych molekuł charakteryzujących się
zróżnicowanymi wartościami pI. Roztwór bardzo złożony, na
jedną jednostkę pH, którą ma buforować wykorzystywane
jest około 200 różnych związków.
Białka wypływają z kolumny w roztworze odpowiadającym
pI.

Chromatoogniskowanie – zalety i wady:

Zalety:

Zalety:

- możliwa do uzyskania bardzo wysoka rozdzielczość (nawet 0,02
jednostki pH)
- przeprowadzenie rozdziału nie wymaga dysponowania
skomplikowanymi systemami chromatograficznymi

Wady:

Wady:

- technika jest kosztowna, koszt Polybuffer jest wysoki; nie ma
możliwości zastosowania tańszych odczynników,
- składniki Polybuffer muszą zostać usunięte przez kolejnymi analizami
(sekwencjonowanie, immunizacja, pomiar aktywności enzymatycznej),
a to jest często kłopotliwe i nie zawsze skuteczne

Rozdział białek techniką chromatoogniskowania

Chromatografia interakcji

hydrofobowych

-

aminokwasy hydrofobowe (leucyna, izoleucyna, walina,

fenyloalanina, tyrozyna) tworzą w obrębie cząsteczki białka
tzw. domeny hydrofobowe. Zarówno ilość takich obszarów,
jak i ich umiejscowienie stanowi indywidualną cechę białka i
może być wykorzystane do jego izolacji.

Interakcje hydrofobowe

Ligand

-

łańcuchy alkilowe lub aromatyczne grupy arylowe unieruchomione na nośniku,

- im większa długość łańcucha węglowodorowego, tym silniejsze oddziaływania
hydrofobowe

Czynniki wpływające na przebieg

separacji z wykorzystaniem HIC:

- właściwości hydrofobowe białek

- rodzaj i gęstość powierzchniowa liganda,

- rodzaj i stężenie soli
Na

2

SO

4

>K

2

SO

4

>(NH

4

)

2

SO

4

>Na

2

HPO

4

>NaCl>KCl>LiCl>NaBr>KBr

- wartość pH – siła oddziaływań hydrofobowych jest wyższa w niższym pH.
Z drugiej strony, niskie wartości pH mogą denaturować białka i wpływać
na właściwości buforów. Z reguły rozdziały przeprowadza się w zakresie
pH 6,0 – 8,5

- temperatura – im wyższa temperatura tym oddziaływania hydrofobowe
są silniejsze

- skład solwentów – obecność alkoholi i detergentów obniżają siłę wiązania
ligandów z białkiem konkurując o miejsca wiązania na złożu

Przykładowe zastosowanie techniki HIC do izolacji

przeciwciał monoklonalnych

Rozdział techniką chromatografii odwróconej fazy

Chromatografia

powinowactwa

jest

odmianą

chromatografii adsorpcyjnej, w której wykorzystuje się wzajemne

powinowactwo (interakcję) dwóch substancji.

Ze względu na swe unikalne właściwości metoda ta

pozwala znacznie uprościć procedurę izolacji wybranych molekuł,

przy jednoczesnym zachowaniu ich biologicznej aktywności

.

Chromatografia powinowactwa

Chromatografia powinowactwa

Oddziaływać między sobą mogą:
- hormon i receptor,
- enzym i substrat,
- enzym i inhibitor,
- przeciwciało i antygen,
- komplementarnei odcinki kwasów nukleinowych,
- kwasy nukleinowe i białka,
- lektyny i glikoproteiny,
- dopełniacz i przeciwciało z grupy IgG.

Interakcja substancji rozpuszczonej w fazie

Interakcja substancji rozpuszczonej w fazie

ruchomej z unieruchomionym ligandem

ruchomej z unieruchomionym ligandem

może mieć różny charakter

może mieć różny charakter

I.

Przez kolumnę przepuszcza się materiał zawierający molekuły

komplementarne do liganda. Przemieszczające się w obrębie

złoża molekuły odnajdują unieruchomiony ligand i wiążą się z
nim.

Chromatografię powinowactwa

Chromatografię powinowactwa

przeprowadza się

przeprowadza się

etapami

etapami

(1)

(1)

II. Odmycie nieswoiście zaadsorbowanych molekuł

Chromatografię powinowactwa

Chromatografię powinowactwa

przeprowadza się

przeprowadza się

etapami

etapami

(2)

(2)

III. Dysocjacja powstałych kompleksów i elucji swoiście
związanych
makromolekuł.

Chromatografię powinowactwa

Chromatografię powinowactwa

przeprowadza się

przeprowadza się

etapami

etapami

(3)

(3)

Chromatografia powinowactwa

Chromatografia powinowactwa

Można zastosować specyficzny eluent, zawierający kompetytor
współzawodniczący o miejsca wiążące z ligandem.
Można eluować związane substancje w sposób niespecyficzny,
za
pomocą
- buforów o niskiej lub wysokiej wartości pH (np. bufor
octanowy,
bufor węglanowy, itp.),
- roztworów o wysokiej sile jonowej (2,5M NaCl),
- rozworów związków rozrywających wiązania wodorowe (4-8 M
mocznik, 6M guanidyna).

Dysocjację kompleksów przeprowadza się

różnymi metodami

Po zakończeniu elucji należy usunąć zastosowane w tym

celu substancje od wyizolowanych makromolekuł. Można to zrobić
różnymi metodami, np.stosując dializę, ultrafiltrację lub filtrację
żelową.

+

brak ograniczeń w stosunku do objętości nanoszonej na

kolumnę
próbki oraz do stężenia separowanego materiału w próbce

+

możliwość silnego zatężenia izolowanej molekuły

+

bardzo wysoka specyficzność

+

możliwość uzyskania w czystej postaci molekuł, które często

nie
mogą być izolowane innymi metodami

+

wyizolowany materiał charakteryzuje się bardzo wysokim

stopniem
czystości pomimo zastosowania tylko jednego kroku
preparatywnego.

Zalety i wady metody chromatografii

Zalety i wady metody chromatografii

powinowactwa

powinowactwa

-

trudności z uzyskaniem niektórych specyficznych ligandów

-

częsta konieczność przygotowania złoża we własnym zakresie

-

niska trwałość niektórych ligandów

Jako nośniki w chromatografii powinowactwa stosowane

są złoża, które tradycyjnie wykorzystuje się do filtracji żelowej, z

tym, że przed użyciem wymagają one odpowiedniej aktywacji. Są

to

pochodne

dekstranowe

(Sephadex),

agarozowe

(Sepharose), rzadko poliakryloamidowe.

Oprócz nośników, które można przygotować do

chromatografii powinowactwa we własnym zakresie, dostępne są

również złoża przystosowane już do chemicznego wiązania

liganda.

Złoża stosowane w chromatografii powinowactwa

Złoża do samodzielnego wiązania ligandów

Złoża do samodzielnego wiązania ligandów

oferowane przez

oferowane przez

Amersham PharmaciaBiotech

Amersham PharmaciaBiotech

Wprowadzenie grup dystansowych pomiędzy ligandem

separowanymi molekułami pozwala zwiększyć możliwość
wiązania makromolekuł do niskocząsteczkowych ligandów.
Eliminuje się w ten sposób efekty reszt cukrowych nośnika
podczas sorpcji makromolekuł.

Jest to szczególnie istotne wówczas, gdy ligandem jest

krótki peptyd, a substancja izolowana przy jego pomocy jest
znacznie większa i może mieć przysłonięte przestrzennie miejsce
wiążące ligand. Można w takich sytuacjach zastosować
odpowiednio zmodyfikowane nośniki, które mają wbudowane
kilkuwęglowe (najczęściej 6-cio atomowe) łańcuchy alifatyczne.
Za ich pośrednictwem dochodzi dowiązania liganda z nośnikiem.