LIMFOCYTY

LIMFOCYTY

TYPOWANIE KOMÓREK

TYPOWANIE KOMÓREK

ODPOWIEDZI SWOISTEJ

ODPOWIEDZI SWOISTEJ

Odporność organizmu:

Odporność organizmu:



komórkowa

komórkowa





charakteryzuje się gromadzeniem

charakteryzuje się gromadzeniem

wokół antygenu komórek, głównie limfocytów T,

wokół antygenu komórek, głównie limfocytów T,

które bezpośrednio reagują z antygenem, a

które bezpośrednio reagują z antygenem, a

poprzez m.in. wydzielanie substancji zwanych

poprzez m.in. wydzielanie substancji zwanych

limfokininami wciągają do odpowiedzi

limfokininami wciągają do odpowiedzi

immunologicznej także makrofagi oraz granulocyty.

immunologicznej także makrofagi oraz granulocyty.



humoralna

humoralna





polega na wytwarzaniu i uwalnianiu

polega na wytwarzaniu i uwalnianiu

do płynów środowiska organizmu przeciwciał;

do płynów środowiska organizmu przeciwciał;

wiąże się ona z czynnością limfocytów B.

wiąże się ona z czynnością limfocytów B.

Odporność

Odporność

organizmu

organizmu

Różne rodzaje odporności

Różne rodzaje odporności

swoistej

swoistej

czynna

biern
a

natural
na

sztuczn
a

natural
na

sztuczn
a

(przebyte

choroby

i

zakażenia)

(szczepienia

ochronne)

(przeciwciała

matki

przekazywan

e przez

łożysko

matki)

(surowice

odpornościowe

np.

przeciwtężcow

a,

przeciwjadowa

)

Populacje

Populacje

limfocytów

limfocytów

20-40% leukocytów krwi

20-40% leukocytów krwi

obwodowej

obwodowej

Identyfikacja limfocytów

Identyfikacja limfocytów

T i B

T i B

za pomocą

za pomocą

receptorów, antygenów różnicowania-

receptorów, antygenów różnicowania-

CD

CD

T

T

B

B

TCR

CD2
CD3
CD4+
CD8+
CD28
CD40L

MHC kl.I i II

BCR

CD19
CD20
CD32
CD35
CD40
CD80

MHC kl.I i II

6-10m

Rozwój limfocytów T

Rozwój limfocytów T



Powstają w

Powstają w

czerwonym szpiku kostnym

czerwonym szpiku kostnym

-

-

wędrują do

wędrują do

grasicy,

grasicy,

gdzie ulegają proliferacji

gdzie ulegają proliferacji



Grasica

Grasica

jest narządem, w którym dojrzewające

jest narządem, w którym dojrzewające

limfocyty T (

limfocyty T (

tymocyty

tymocyty

)

)



przechodzą

przechodzą

selekcję grasiczą

selekcję grasiczą

(selekcja mającą na celu wyeliminowanie

(selekcja mającą na celu wyeliminowanie

autoreaktywnych

autoreaktywnych

limfocytów

limfocytów

,

,

mogące uszkodzić

mogące uszkodzić

własne tkanki

własne tkanki



występujące w organizmie niewielkie ilości

występujące w organizmie niewielkie ilości

limfocytów

limfocytów

T γδ

T γδ

przechodzą słabo zbadane

przechodzą słabo zbadane

procesy

procesy

selekcji pozagrasiczej

selekcji pozagrasiczej

umiejscowione

umiejscowione

w skórze oraz błonach śluzowych jelit i jamy

w skórze oraz błonach śluzowych jelit i jamy

otrzewnej.

otrzewnej.

Funkcje limfocytów

Funkcje limfocytów

T

T



Odgrywają trzy zasadnicze funkcje:

Odgrywają trzy zasadnicze funkcje:



wspomagają

wspomagają

odpowiedź odpornościową -

odpowiedź odpornościową -

subpopulacja limfocytów

subpopulacja limfocytów

Th

Th

(CD2+,CD3+,CD4+)

(CD2+,CD3+,CD4+)



pełnią funkcję

pełnią funkcję

cytotoksyczną

cytotoksyczną

-

-

subpopulacja limfocytów

subpopulacja limfocytów

Tc

Tc

(CD2+,CD3+,CD8+)

(CD2+,CD3+,CD8+)



regulują

regulują

odpowiedź odpornościową-

odpowiedź odpornościową-

hamując - subpopulacja limfocytów

hamując - subpopulacja limfocytów

Treg,

Treg,

dawniej (Ts)

dawniej (Ts)

(CD2+,CD3+,CD4+ ,CD25+,CD8+)

(CD2+,CD3+,CD4+ ,CD25+,CD8+)



Powstają i dojrzewają w szpiku czerwonym

Powstają i dojrzewają w szpiku czerwonym



Subpopulacje:

Subpopulacje:

- B1a, B1b

- B1a, B1b

- B2

- B2

Funkcja:

Funkcja:

-

- wytwarzają przeciwciała (immunoglobuliny),

które łączą się z antygenem

LIMFOCYTY B

LIMFOCYTY B

Testy rozetowe

Testy rozetowe



Wykonanie testu

Wykonanie testu



Rozetki E

Rozetki E

-

-

Limfocyty T wiążą erytrocyty barana i

Limfocyty T wiążą erytrocyty barana i

tworza formy rozetowe E. Izolowane limfocyty inkubuje się

tworza formy rozetowe E. Izolowane limfocyty inkubuje się

z 0,5% zawiesiną erytrocytów barana w czasie 30-60min

z 0,5% zawiesiną erytrocytów barana w czasie 30-60min

w temperaturze pokojowej. Rozetki liczymy pod

w temperaturze pokojowej. Rozetki liczymy pod

mikroskopem.

mikroskopem.



Rozetki wczesne

Rozetki wczesne

- dla limfocytów bardzo szybko

- dla limfocytów bardzo szybko

wiążących

wiążących



Rozetki późne

Rozetki późne

–

–

powstające po paru godzinach

powstające po paru godzinach



Rozetki EA

Rozetki EA

- do limfocytów dodajemy erytrocyty

- do limfocytów dodajemy erytrocyty

baranie, surowicę, wykonanie w podobnych warunkach

baranie, surowicę, wykonanie w podobnych warunkach



Rozetki EAC

Rozetki EAC

-

-

zastosowanie amboceptora

zastosowanie amboceptora

hemolitycznego, krwinek barana i dopełniacza/mysi/,

hemolitycznego, krwinek barana i dopełniacza/mysi/,

wykonanie w podobnych warunkach

wykonanie w podobnych warunkach



Test rozet E

Test rozet E

– wykrywanie receptorów dla

– wykrywanie receptorów dla

krwinek barana,

krwinek barana,

CD2 na limfocytach T

CD2 na limfocytach T



Test rozet EA

Test rozet EA

– wykrywanie receptorów

– wykrywanie receptorów

dla fragmentu Fc IgG,

dla fragmentu Fc IgG,

Fc

Fc

γ

γ

RII na

RII na

limfocytach T i B

limfocytach T i B



Test rozet EAC

Test rozet EAC

– wykrywanie receptorów

– wykrywanie receptorów

dla składników dopełniacza,

dla składników dopełniacza,

CR1 i CR2

CR1 i CR2

na limfocytach B

na limfocytach B

Testy rozetowe

Testy rozetowe

Testy rozetowe

Testy rozetowe

Rozetki –

Rozetki –

normy

normy

Rozetki E wczesne

Rozetki E wczesne

-

-

18%

18%

„

„

E późne

E późne

-

-

60-70%

60-70%

„

„

EA

EA

-

-

20-23%

20-23%

„

„

EAC

EAC

-

-

25%

25%

Technika fluorescencji

jest powszechnie stosowana do

różnicowania komórek na bazie ich immunofenotypu.

Sygnał z detektora

rejestrującego fluorescencję jest prosty do

interpretacji -

obecność fluorescencji

świadczy o obecności na

komórce konkretnego białka

-markery CD

- Cluster Differential.

Uznaje się, że sygnały pochodzące z detektorów
rejestrujących światło rozproszone pod różnym kątem są
źródłem informacji o:
-

0 stopni -

wielkość komórki

- 7-10 stopni -

złożoność komórki

- 90 stopni -

budowa jądra komórkowego

- 90 D -

budowa i gęstość ziarnistości cytoplazmatycznych

Pomiary metodami optycznymi

Cytometria przepływowa

Cytometria przepływowa

Cytometria przepływowa

bazuje na zjawisku rozpraszania światła

laserowego przez komórki oraz ich struktury i/lub zjawisku fluorescencji
barwników związanych z przeciwciałami

- w przypadku zastosowania

przeciwciał monoklonalnych sprzężonych z fluorochromem światło lasera o
ściśle określonej długości fali wzbudza konkretny fluorochrom.

Stosując

kilka

długości

fal

i

kilka

przeciwciał

monoklonalnych z fluorochomami (sondy)

można

jednocześnie dokonywać analizy obecności oraz rozmieszczenia konkretnych
struktur komórki. Elementy optoelektroniczne dokonują transformację fal
świetlnych na wartości potencjału, którego wielkość jest wprost
proporcjionalna do intensywności fluorescencji (i gęstości struktur). Inne
elementy optoelektroniczne rejestrują światło rozproszone (światło lasera, nie
fluorescencję) pod różnymi kątami pozwalając na jednoczesną analizę
wielkości struktur oraz ich strukturę (dochodzą tu zjawiska załamania się i
odbicia światła które w przypadku małych kątów - 0-10
stopni są marginalne a pod większymi - 90 stopni grają dużą rolę).

Rejestruje się również światło rozproszone

pod kątem 90 stopni

i o zmienionej polaryzacji w stosunku do pierwotnej polaryzacji światła lasera
- 90 D (analiza powierzchni struktur). Jest to technika MAPSS(TM) - Multi
Angle

Polarized

ScatterSeparation.

Cytometr przepływowy

Cytometr przepływowy

 

                                                                                                                              

XE-2100

Histogramy

Histogramy

CF

CF

Histogram jednowymiarowy

Wykres rozproszenia

Histogram trójwymiarowy

Histogramy

Histogramy

CF

CF