DIAGNOSTYKA

MIKROBIOLOGICZNA

GRUŹLICY

Dorota Krawiecka, Renata Żebracka

Zakład Diagnostyki Mikrobiologicznej

Ogólna charakterystyka

rodzaju Mycobacterium

• Wszechobecne w otoczeniu człowieka

• Bakterie wolno rosnące, czas generacji komórek wynosi 18 godzin

• Ściśle tlenowe

• Nieruchliwe

• Nie wytwarzają form przetrwalnikowych

• Bogate w substancje tłuszczowe

• Trudne do barwienia metodą Grama

• Wykazują cechę kwasooporności (AFB)

• Oporne na działanie wielu związków chemicznych, również

antybiotyków

• Wytrzymałe na działanie niskich temperatur, wysuszenie

• Miesiącami mogą zachowywać żywotność w wodzie, glebie, kurzu –

jeśli nie są narażone na działanie światła

• Tracą żywotność w temperaturze 60

0

C po 20 minutach, po 2

minutach w temperaturze 100

0

C

• Wrażliwe na działanie kwasów, związków chloru, fenolowe, alkohol,

promieniowanie UV

PRĄTKI KWASOOPORNE - AFB

Mycobacterium

tuberculosis complex

MOTT – Mycobacteria Other Than

Tuberculosis (grupy wg Runyona)

M.tuberculosis
M.bovis
M.bovis BCG
M.microti
M.africanum

I grupa - fotochromogenne

M.kansasi, M.marinum, M.simiae

II grupa - skotochromogenne

M.scrofulaceum, M.gordonae, M.szulgai,

M.flavescens, M.xenopi

III grupa - niechromogenne

M.avium, M.intracellulare (MAC),

M.malmoense, M.gastri, M.haemophilum,

M.terrae, M.ulcerans

IV grupa - szybko rosnące

M.fortuitum, M.chelonae, M.smegmatis,

M.vaccae

GRUŹLICA

Gatunki saprofityczne. U osób z

obniżoną opornością bywają

przyczyną

MYKOBAKTERIOZY

Diagnostyka mikrobiologiczna

gruźlicy

Podejrzenie gruźlicy jest oparte na obserwacjach

objawów klinicznych u chorego takich jak: przewlekły

kaszel, gorączka, utrata wagi. Potwierdzenie

podejrzenia gruźlicy można uzyskać w badaniu

radiologicznym i po wykonaniu testu

tuberculinowego, ale ostateczną diagnozę uzyskuje

się dzięki izolacji i identyfikacji czynnika sprawczego

gruźlicy – Mycobacterium tuberculosis.

Stwierdzenie prątków gruźlicy w materiale

pobranym od chorego jest najbardziej

obiektywnym dowodem istniejącego procesu

chorobowego.

Wybór materiału do badania

Wybór materiału klinicznego do badania

zależy od umiejscowienia zmian
chorobowych oraz objawów.

Gruźlica jest chorobą skąpobakteryjną,

dlatego ilość pobieranego materiału oraz
czas transportu mają istotny wpływ na
czułość badania. Zbyt mała ilość materiału
i przedłużający się czas transportu mogą
być przyczyną fałszywie ujemnych
wyników.

Materiały do diagnozowania

gruźlicy układu oddechowego

Plwocina odkrztuszona (wydzielina

dolnych dróg oddechowych)

• 3-6 prób w ciągu kolejnych dni na początku

choroby w celu potwierdzenia gruźlicy

• w celu monitorowania leczenia: zgodnie z

aktualnymi zaleceniami Narodowego
Programu Zwalczania Gruźlicy w zależności
od przyjętego schematu leczenia

• optymalnie 10 ml, minimalnie: 2-3 ml

Materiały do diagnozowania

gruźlicy układu oddechowego

Gdy pacjent ma trudności z odkrzsztuszaniem:
• plwocina indukowana - po zastosowaniu

inhalacji z hipertonicznego (3-15%) roztworu
NaCl

• Materiał podczas wykonywania bronchoskopii
• Popłuczyny żołądkowe mogące zawierać

połkniętą plwocinę wraz z prątkami, stanowią
one dobry materiał diagnostyczny u chorych,
od których nie ma możliwości pobrania
materiału z dróg oddechowych (dzieci,
kobiety, pacjenci niewspółpracujący).

MATERIAŁ POBIERANY PODCZAS

BRONCHOSKOPII

(popłuczyny oskrzelowe, BAL, bioptat oskrzela, zabezpieczona

szczoteczka)

• Materiał płynny - optymalnie: maksymalna, możliwa do

uzyskania objętość

• Minimalnie: 10 ml
• Pozostałe materiały (bioptat oskrzela, zabezpieczona

szczoteczka i inne): maksymalna, możliwa do uzyskania

objętość

• Materiał po pobraniu umieścić w odpowiednim

pojemniku bez dodatku płynów konserwujących

• Wyjątkowo materiał, którego nie można dostarczyć

najpóźniej na godzinę przed zamknięciem laboratorium,

można przechować w temperaturze 4oC do następnego

dnia, do momentu otwarcia pracowni

• MATERIAŁ NIE DO ZAAKCEPTOWANIA!:
Materiał w formalinie lub innym płynie

konserwującym

POPŁUCZYNY ŻOŁĄDKOWE

• Wielkość próby:

 Optymalna: 50 ml

 Minimalna: 5-10 ml

• Ilość i częstotliwość

pobierania prób

 najlepiej 3, w ciągu kolejnych

dni.

• Przygotowanie pacjenta

 Przed pobraniem pacjent nie

powinien wstawać z łóżka

przez 8 godzin

• Pobieranie

 sondą żołądkową

 rano,

 na czczo,

 zaraz po przebudzeniu

 wprowadzić 100 ml soli fizj.

 zaaspirować

 umieścić w pojemniku

• Przechowywanie

i

transport

 dostarczyć do laboratorium

natychmiast po pobraniu -

prątki ulegają zniszczeniu w

kwaśnym środowisku oraz pod

wpływem

enzymów

trawiennych

 Gdy

jest

to

niemożliwe

-materiał zneutralizować przez

dodanie 100mg węglanu

sodu.

Pojemniki z neutralizatorem

można

otrzymać

w

laboratorium

 Transportować w temperaturze

otoczenia, w odpowiednim

zabezpieczeniu.

MATERIAŁY DO DIAGNOZOWANIA

GRUŹLICY POZAPŁUCNEJ

MOCZ

• Wielkość próby

• Optymalnie: cała pierwsza poranna porcja moczu

• Minimalnie: 50 ml, wyjątkowo <50 ml w przypadku

skąpomoczu

• Ilość i częstotliwość pobierania prób:

 6 prób w ciągu kolejnych dni

• Przygotowanie pacjenta i pobranie

 Po dokładnym umyciu narządów płciowych i ujścia cewki

moczowej wodą z mydłem, opłukaniu wodą i wytarciu

jednorazowym ręcznikiem lub papierem toaletowym

 Pacjent nie powinien pić od godziny 18-tej dnia poprzedniego

 Unikać pobierania moczu w trakcie leczenia antybiotykami o

szerokim spektrum

• Przechowywanie i transport

 Materiał dostarczyć do 2 godzin od pobrania, ponieważ prątki

mogą zostać uszkodzone przez kwaśne środowisko moczu, a

także może dojść do przerostu próbki.

MATERIAŁY DO DIAGNOZOWANIA

GRUŹLICY POZAPŁUCNEJ

PŁYN MÓZGOWO-RDZENIOWY

• Wielkość próby

 optymalnie: maksymalna możliwa do uzyskania objętość (materiał

skąpoprątkowy!)

 minimalnie: 5 ml

• Pobieranie

 Zgodnie z procedurami obowiązującymi przy tego typu zabiegach.

 Do jałowego naczynia, bez żadnych dodatków.

• Przechowywanie i transport

 Dostarczyć jak najszybciej, najlepiej w ciągu 1 godziny od pobrania.

 Transport w temperaturze otoczenia i w odpowiednim

zabezpieczeniu.

PŁYNY Z JAM CIAŁA: OPŁUCNOWY, OTRZEWNOWY,

OSIERDZIOWY ,STAWOWY

• Wielkość próby

 Optymalnie: cała uzyskana ilość, po oddzieleniu niezbędnej porcji do

innych badań

 Minimalnie: 10-15 ml

MATERIAŁY DO DIAGNOZOWANIA

GRUŹLICY POZAPŁUCNEJ

WĘZŁY CHŁONNE, FRAGMENTY TKANEK, WYSKOBINY,

FRAGMENTY KOŚCI

• Wielkość próby: jeśli jest to możliwe, pobrać i przysłać do

badania znaczną część tkanki; węzeł chłonny najlepiej pobrać w

całości

• Pobieranie

 Wybrać fragment tkanki zmieniony chorobotwórczo, serowaty.

 Pobrany materiał umieścić w jałowym pojemniku, bez dodatku

żadnych utrwalaczy, środków konserwujących, soli fizjologicznej lub

innych płynów.

 Materiałów tych nie należy zawijać w gazę itp.

• Przechowywanie i transport

 Dostarczyć jak najszybciej, najlepiej do 1 godziny od pobrania.

 Transportować w temperaturze otoczenia i w odpowiednim

zabezpieczeniu.

• MATERIAŁ NIE DO ZAAKCEPTOWANIA!:

 Materiał w formalinie lub innym płynie

 Materiał zawinięty w gazę

MATERIAŁY DO DIAGNOZOWANIA

GRUŹLICY POZAPŁUCNEJ

ZAWARTOŚCI ROPNI, PUNKTATY, BIOPTATY, MATERIAŁ

ZE ZMIAN SKÓRNYCH

• Wielkość próby

 Maksymalna możliwa do uzyskania ilość

• Pobieranie

 W przypadku zmian skórnych należy pobierać zeskobiny i wycinki skóry.

 W przypadku owrzodzeń skórnych, ropni: aspiraty igłą i strzykawką.

 Materiały pobierane w ten sposób umieszczać w jałowym pojemniku bez

żadnych dodatków.

 Wyjątkowo, gdy objętość aspiratu/bioptatu jest bardzo mała, można

dostarczyć materiał w strzykawce z zatyczką.

 Gdy aspiracja i biopsja nie jest możliwa (np. objętość płynu jest

niewystarczająca), dopuszczalne jest pobranie materiału za pomocą

wymazówki, a najlepiej kilku wymazówek; stosować wymazówki suche,

bez podłoża transportowego. W przypadku owrzodzeń pobierać wówczas

materiał z brzegu zmiany.

• Przechowywanie i transport

 Dostarczyć jak najszybciej, najlepiej w ciągu 1- 2 godzin od pobrania.

 Transportować w temperaturze otoczenia i w odpowiednim

zabezpieczeniu

MATERIAŁY DO DIAGNOZOWANIA

GRUŹLICY POZAPŁUCNEJ

KREW – chorzy HIV+

• Wielkość próby

 Optymalnie: 5-7 ml

 Minimalnie: 3 ml

• Liczba prób

 co najmniej 2 próbki

• Pobranie

 Zgodnie z procedurami obowiązującymi przy tego typu zabiegach.

 Przed pobraniem krwi/szpiku umyć miejsce wkłucia wodą i mydłem,

opłukać wodą, a następnie dwukrotnie zdezynfekować skórę oraz

korek butelki.

 Materiał pobrać bezpośrednio do butelki z podłożem do hodowli

Podczas przekłuwania się przez korek butelki zmienić igłę.

• Przechowywanie i transport

 Dostarczyć jak najszybciej od momentu pobrania. Dopuszcza się

przechowywanie butelek z pobranym materiałem do 24 godzin w

temperaturze pokojowej

 Transport w temperaturze otoczenia

• MATERIAŁ NIE DO ZAAKCEPTOWANIA!

 Krew pobrana do probówki lub innego pojemnika.

Przygotowanie materiału do

badań

Ma na celu:
• dekontaminację materiału zawierającego

oprócz prątków naturalną florę bakteryjną

• homogenizację
• zagęszczenie

Odbywa się to dzięki

zastosowaniu mieszaniny N-acetylo-L-
cysteiny z NaOH i przez wirowanie. Z tak
uzyskanego osadu wykonuje się badania.

Metody badań

mikrobiologicznych

• Bakterioskopia
• Wykrywanie kwasów nukleinowych
• Hodowla
• Identyfikacja
• Lekowrażliwość

Bakterioskopia AFB

Unikalna budowa ściany komórkowej

prątków – duża zawartość kwasów
mykolowych, które mają zdolność
łączenia się z niektórymi barwnikami
i tworzenia trwałego związku
nierozpuszczalnego pod wpływem
kwasów, zasad i alkoholi. Jest to
cecha kwasooporności.

Bakterioskopia AFB (1)

1.Metoda Ziehla-Neelsena (Z-N)

• Metoda referencyjna
• Alkoholowy roztwór fuksyny zasadowej
• Odbarwianie kwaśnym alkoholem
• Barwienie tła błękitem metylenowym
• Obserwacja w mikroskopie świetlnym, w

obiektywie immersyjnym

• Czas obserwacji 10 min (200-300 pól

widzenia)

Bakterioskopia AFB (2)

2. Bezpośrednia fluorescencja
• Barwniki: auramina, rodamina, oranż

akrydyny

• Obserwacja w mikroskopie

fluorescencyjnym w małym
powiększeniu

• Metoda skreningowa
• Dodatni wynik musi być potwierdzony Z-

N

Bakterioskopia AFB (3)

Metoda Z-N

Metoda fluorescencyjna

Bakterioskopia AFB (4)

Zalety

• Badanie tanie

• Badanie szybkie, czas wykonania do 24 h

• Specyficzność – wysoka (ponad 90%)

• Szybka identyfikacja osób obficie prątkujących
Wady

• Czułość – niska (30-60%), prątki widać w

mikroskopie przy ilości 10000 komórek w 1 ml

plwociny

• Nie identyfikuje gatunku prątka

• Nie rozróżnia prątków martwych i żywych

• Mała przydatność do diagnozowania gruźlicy

pozapłucnej

Hodowla (1)

• Jest złotym standardem diagnostyki

gruźlicy

• Pozwala uzyskać szczep do dalszych badań
• Ma większą czułość niż bakterioskopia,

umożliwia wykrycie prątków obecnych
nawet w małych ilościach w materiałach
klinicznych (od 10 do 1000 komórek/ml)

• Dostępne są dwie metody hodowlane:

klasyczna i automatyczna

Hodowla (2)

Metoda klasyczna
• Podłoże stałe Loewensteina-

Jensena i Stonebrincka

• Inkubacja w cieplarce w

37

o

C do 10 tygodni

• Zazwyczaj wzrost uzyskuje

się po 4 tygodniach

inkubacji

• Hodowle przegląda się raz

w tygodniu

• Czułość ok. 50%

Hodowla (3)

Metoda automatyczna MB BacT

• Podłoże płynne Middlebrooka 7H9 – zwiększenie czułości

• Inkubacja w aparacie do 6 tygodni

• Wzrost uzyskuje się zazwyczaj po kilku – kilkunastu dniach
• Prątki w wyniku metabolizmu wydzielają CO

2

, którego narastające stężenie

powoduje zmianę zabarwienia czułego wskaźnika kolorymetrycznego,

pomiar ten wykonuje aparat automatycznie i rejestruje komputerowo

Hodowla (4)

• Z dodatniej hodowli należy wykonać

preparat, aby upewnić się, że uzyskano
wzrost prątków.

• Pewna część hodowli ulega przerostowi florą

towarzyszącą. Kontaminacja w przypadku
podłoży stałych wynosi 2-5%, a podłoży
płynnych 5-10%.

• Uzyskany szczep poddaje się identyfikacji

gatunkowej i badaniu lekowrażliwości

Identyfikacja (1)

Bardzo ważną strukturą

chemiczną w ścianie
komórkowej prątków jest
dwumykolan trehalozy, który
występuje tylko w prątkach
zjadliwych i determinuje
specyficzne ułożenie w
hodowli płynnej komórek
prątków należących do
kompleksu M.tuberculosis w
formie „wiązek” lub
„warkoczy” (cord factor).

Identyfikacja (2)

Metody tradycyjne

• Test niacynowy: dodatni tylko dla M.tuberculosis .

Wykonuje się ze „starych” hodowli

• Morfologia kolonii: szorstkie, gładkie, śluzowe

• Czas wzrostu: szybki (<7 dni), wolny

• Temperatura wzrostu: 25

0

C, 37

0

C, 42

0

C

• Wytwarzanie barwnika: w ciemności, po

naświetleniu – test fotosyntezy

• Testy biochemiczne

• Czas identyfikacji: 2-6 tygodni

• Możliwe do wykonania w każdym laboratorium

prątka

Identyfikacja (3)

Metody nowoczesne

• Test NAP w systemie BACTEC 460 TB – odróżnia

M.tuberculosis od wszystkich pozostałych gatunków

• Sondy genetyczne – dostępne dla M.tuberculosis

complex, M.kansasii, M.avium complex, M.gordone

• HPLC- cieczowa chromatografia wysokowydajna –

analiza wzorów elucyjnych kwasów mykolowych

• Możliwe do wykonania od 1 (genetyka, HPLC) do

kilku dni (NAP)

• Możliwe do wykonania w dobrze wyposażonych

laboratoriach, zatrudniających wysoko

wykwalifikowany personel

Lekooporność prątków (1)

• Oporność pierwotna -

stwierdzona przed
włączeniem leczenia
przeciwprątkowego

• Oporność wtórna – powstała

w trakcie leczenia
przeciwprątkowego

• Oporność wielolekowa (MDR)

– na co najmniej dwa leki w
tym INH i RMP

• Oporność naturalna – MOTT

są zazwyczaj oporne na
większość leków
przeciwprątkowych

Podstawowe leki
przeciwprątkow

e

INH –izoniazyd
SM –

streptomycyna

RMP - rifampicyna
EMB - etambutol
PZA -pyrazynamid

Lekooporność prątków (2)

Metoda klasyczna

• Kompilacja metody

proporcji według

Canettiego i metody

wskaźnika oporności

według Mitchisona

• Na podłożach stałych L-J
• Czas badania – 4

tygodnie

• Stężenia leków:
 SM – 2; 4; 8 ug/ml
 INH – 0,1; 0,2; 0,4 ug/ml
 RMP – 20; 40; 80 ug/ml
 EMB – 1;2;4 ug/ml

Metoda automatyczna

MBacT

• Test BacT/ALERT

S.I.R.E.Kit

• Maksymalny czas

badania: 15 dni

• Leki rozpuszczone w

podłożu płynnym 7H9 w

butelkach BacT/ALERT MP

• Stężenia leków:
 SM: 1,0 ug/ml
 INH: 0,1 ug/ml
 RMP: 1,0 ug/ml
 EMB: 5,0 ug/ml

Lekooporność prątków (3)

W przypadku stwierdzenia oporności na

podstawowe leki, szczególnie MDR, oznacza

się wrażliwość na tuberkulostatyki II rzutu:

•kapreomycyna,

•cykloseryna,

•etionamid, rifabutina,

•klofazymina,
a także antybiotyki i chemioterapeutyki

mogące mieć zastosowanie w leczeniu:

•ofloksacyna,

•amikacyna,

•biseptol,

•erytromycyna.

Wykrywanie kwasów

nukleinowych

(badanie genetyczne) (1)

System genetyczny BD ProbeTec ET jest półautomatycznym

systemem diagnostycznym do wykrywania in vitro obecności
Mycobacterium tuberculosis complex bezpośrednio w

materiałach klinicznych na podstawie zawartości materiału

genetycznego - DNA (test DTB)

•stosowana jest tu metoda w oparciu o technikę homogennej

amplifikacji z przemieszczeniem nici DNA (SDA, Strand

Displacement Amplification) oraz detekcja przy użyciu metody

fluorescencyjnego przekazywania energii.

•sekwencją docelową jest sekwencja insercyjna IS 6110, czyli

fragment DNA charakterystyczny dla grupy M.tuberculosis

complex, obecny we wszystkich komórkach M.tuberculosis w

wielu powtórzeniach

•w każdej studzience, w której zachodzi powielanie DNA,

znajduje się wewnętrzna kontrola amplifikacji IAC pozwalająca

na wykrywanie inhibitorów reakcji, które mogą występować w

badanym materiale (np.hemoglobina)

Wykrywanie kwasów

nukleinowych (2) Przygotowanie

próbki

Do badania genetycznego służy część materiału opracowanego N-acetylo-L-

cysteiną z NaOH pozostała po założeniu hodowli i wykonaniu preparatu AFB.

Etapy przygotowania próbki do wykrywania DNA:

Zagęszczanie i
wypłukiwanie inhibitorów
(przemywanie buforem i
wirowanie).

Zabijanie
M.tuberculosis w
temperaturze 105

o

C.

Uwalnianie DNA
z komórek w
łaźni
ultradźwiękowej.

Wykrywanie kwasów

nukleinowych (3)

Etapy badania

Wstępna inkubacja w
studzienkach
przygotowawczych
zawierających primery
amplifikacyjne, znakowane
fluorescencyjnie sondy
detekcyjne i inne
odczynniki niezbędne do
amplifikacji.

Inkubacja w bloku grzewczym w
mikrostudzienkach amplifikacyjnych
zawierających polimerazę DNA
i endonukleazę restrykcyjną

Umieszczenie
mikrostudzienek w
aparacie, w którym
odbywa się jednoczesna
amplifikacja i
detekcja w czasie
rzeczywistym w tej
samej próbce

Wykrywanie kwasów

nukleinowych (4)

Zalety metody

• wysoka czułość i specyficzność testu
• pozwala na szybkie określenie

przynależności gatunkowej prątków
kwasoopornych wykrytych w bakterioskopii
(przy dodatniej bakterioskopii AFB dodatni
wynik testu DTB - M.tuberculosis complex,
ujemny wynik testu DTB - grupa MOTT)

• pozwala na znaczne przyspieszenie

diagnostyki gruźlicy, czas trwania badania -
kilka godzin

Wykrywanie kwasów

nukleinowych (5)

Dodatkowe możliwości

System genetyczny BD ProbeTec ET

umożliwia także identyfikację prątków

wyhodowanych zarówno na podłożu

stałym, jak i w podłożu płynnym.

Dostępne są testy do identyfikacji:

• M.tuberculosis complex (test ctb)
• M.avium complex (test mac)
• M.kansasii (test kan).
Przebieg badania: jak wyżej.

Materiały z dróg oddechowych - 502

badania

Bakterioskopia

15%

85%

Wyniki w grupie materiałów AFB+

DTB(-); hodowla:
MOTT

12

DTB+; hodowla:
M.tb; rozpoznanie:
gruźlica

58

DTB+; hodowla (-);
rozpoznanie:
gruźlica

3

RAZEM

73

58

3

12

CZUŁOŚĆ 100%

SWOISTOŚĆ 100%

Wyniki w grupie materiałów AFB(-)

DTB+

41

rozpoznano

gruźlicę

49

8

nie rozpoznano

gruźlicy

343

nie

rozpoznano
gruźlicy; hodowla

(-)

21

rozpoznano

gruźlicę; hodowla
+

DTB(-)

379

3

rozpoznano

gruźlicę;

potwierdzono w
badaniach innych

materiałów

12

rozpoznano

gruźlicę; hodowla
(-)

DTB

inhibicja

1

RAZEM

429

CZUŁOŚĆ 53,2%

SPECYFICZNOŚĆ
97,7%

CAŁKOWITA ŚREDNIA CZUŁOŚĆ 73,4%

CAŁKOWITA ŚREDNIA SWOISTOŚĆ
97,8%

Ocena wiarygodności testu dla

materiałów z dróg oddechowych

AFB+ i AFB(-)

Drzewo decyzyjne (1)

Rozmaz AFB+

DNA

negatywny

MOTT

DNA pozytywny

M.tuberculosis

complex

Izoluj i lecz

Drzewo decyzyjne (2)

Rozmaz AFB(-)

DNA negatywne

DNA pozytywne

Czekaj na
hodowle.

Diagnozuj w
innych
kierunkach.

Izoluj i lecz