Diagnostyka

mikrobiologiczna

Romuald Krajewski

Badania mikrobiologiczne -
aspekty

•

Aspekt mikrobiologiczny

−

identyfikacja aktualnie występujących czynników etiologicznych z

określeniem ich właściwości jak: toksyczność, obecność otoczek, typ

serologiczny itp.

−

aktualny przegląd oporności na chemioterapeutyki i mechanizmów

oporności

−

ocena stopnia uodpornienia populacji wobec chorób infekcyjnych

•

Aspekt kliniczny

−

poszukiwanie związku między wykrytym drobnoustrojem, jego

właściwościami a objawami klinicznymi

−

prawidłowy dobór antybiotyków do terapii empirycznej i celowanej

−

analiza przyczyn niepowodzenia antybiotykoterapii

•

Aspekt epidemiologiczny

−

identyfikacja drobnoustrojów epidemicznych w oparciu o analizę cech

drobnoustrojów wywołujących zakażenia w określonym czasie i

środowisku

−

pomoc w ustalaniu źródeł i dróg szerzenia się zakażeń

(rozprzestrzeniania się drobnoustrojów epidemicznych)

−

monitorowanie rozprzestrzeniania się lekooporności.

Rola laboratorium
mikrobiologicznego

•

Badania mikrobiologiczne środowiska są
mało przydatne w zwalczaniu zakażeń
szpitalnych

•

Zadaniem laboratorium jest analiza flory
bakteryjnej u pacjentów w oddziałach

•

Laboratorium współpracuje z personelem
oddziałów w zakresie zapobiegania i
leczenia zakażeń

Rola laboratorium
mikrobiologicznego

•

Pobranie materiału do badania i
dostarczenie go do laboratorium

•

Identyfikacja drobnoustroju
(możliwie najbardziej szczegółowa)

•

Ocena wrażliwości na leki

Pobieranie materiału

•

Wymaz z nosogardła – badania w
kierunku nosicielstwa

•

Wacik zwilżony solą fizjologiczną
wprowadzany przez nos

•

Jałowa probówka z podłożem
transportowym

Pobieranie materiału

•

Wymaz z gardła

−Pobiera się z podniebienia, migdałków,

tylnej ściany gardła

−Nie należy dotykać języka ani

policzków

•

Plwocina

−Wątpliwa wartość diagnostyczna
−Pobiera się rano, po umyciu zębów

Pobieranie materiału

•

Oskrzela i płuca

•

Odsysanie zawartości oskrzeli – nie
można przez rurkę intubacyjną, ponieważ
pobiera się bakterie z rurki

•

BAL – popłuczyny pęcherzykowo-
oskrzelowe pobierane podczas
bronchoskopii

•

Zestawy szczoteczkowe

Pobieranie materiału -
krew

•

Prawidłowo pobrane próbki krwi u
zdrowych są zwykle jałowe

•

Bakteriemia występuje po myciu zębów,
ekstrakcji zębów, bakterie są usuwane w
ciągu <1 godziny

•

Dodatni wynik posiewu krwi ma znaczenie
tylko w połączeniu z objawami klinicznymi

•

Liczba bakterii we krwi jest niewielka, co
utrudnia hodowlę

Pobieranie materiału -
krew

•

Jałowy jednorazowy sprzęt

•

Nowe wkłucie (wyjątek – posiew z
cewnika)

•

Ogrzane podłoże

•

Natychmiast do laboratorium

•

Wielokrotne badania, pobieranie
przed szczytem gorączki

Pobieranie materiału -
krew

•

Specjalne podłoża w zależności od
spodziewanych bakterii – zwłaszcza
paciorkowców

•

Podłoża blokujące działanie antybiotyków

•

Automatyczne systemy identyfikujące
bakterie na podstawie aktywności
biochemicznej

Pobieranie materiału -
krew

•

Dezyfekcja korka butelki z podłożem i
miejsca wkłucia

•

Użycie środka odkażającego z jodyną do
wyschnięcia

•

Nie należy dotykać miejsca wkłucia

•

Pobieranie sterylnym zamkniętym
systemem

•

Parę (2-3) posiewów w ciągu 1-2 godzin

Pobieranie materiału -
ropień

•

Nakłucie i aspiracja

•

Głęboki wymaz z ropnia otwartego

•

Przechowywanie w podłożu
transportowym <2 godzin

•

Jeden posiew z jednego miejsca
dziennie

Pobieranie materiału -
cewnik

•

Przemycie skóry wokół cewnika

•

Usunięcie cewnika w sposób jałowy

•

Odcięcie ok. 5 cm i umieszczenie w
sterylnej próbówce (suchej lub z solą)

•

Cewnik bez soli – natychmiast do
laboratorium

•

Można przechowywać do 24 godzin w
niskiej temperaturze – 4st

Pobieranie materiału – płyn
mózgowo-rdzeniowy

•

Nakłucie lędźwiowe – wykonywane
przez lekarza

•

Dokładna dezynfekcja miejsca wkłucia

•

1-2 ml płynu sposobem zamkniętym w
temperaturze pokojowej

•

Transport do laboratorium w ciągu
<15 min

Pobieranie materiału –
wycinki tkanek

•

Sterylna probówka

•

Kilka kropli sterylnej soli
fizjologicznej

•

Zwykły transport – do laboratorium
w ciągu <15 min

•

Transport w systemie dla
beztlenowców - <24 godzin

Pobieranie materiału –
mocz

•

Dokładne mycie wodą z mydłem

•

Przetarcie jałowym gazikiem

•

Pobranie moczu ze środkowej części
strumienia do jałowego pojemnika
lub pojemnika z podłożem do
posiewu moczu

Pobieranie materiału – mocz z
cewnika

•

Jeżeli można nakłuć zbiornik moczu –
odkażenie miejsca nakłucia, pobranie 5-
10 ml do strzykawki, wprowadzenie do
jałowego pojemnika/probówki

•

Odkażenie zaworu, wypuszczenie
kilkudziesięciu ml, pobranie porcji do
jałowego pojemnika

•

Czas przechowywania <2 godzin

Badania bakteriologiczne

•

Preparaty bezpośrednie

•

Hodowla

•

Wykrywanie antygenów bakteryjnych

•

Wykrywanie DNA/RNA bakterii metodami
biologii molekularnej

•

Określenie poziomu przeciwciał w
surowicy i innych płynach ustrojowych

•

Próby na zwierzętach (rzadko)

Preparaty bezpośrednie

•

Barwienie

−negatywne – barwi się tło

−pozytywne – barwniki mające powinowactwo

do drobnoustrojów

−proste – pojedynczy barwnik

−złożone – liczne barwniki

•

Najczęstsza metoda – Grama

−bakterie G+ barwią się fioletem

krystalicznym na granatowo

−bakterie G- barwią się tylko barwnikiem

kontrastowym – fuksyna zasadowa

Preparaty bezpośrednie

•

Metoda Ziehl-Nielsena – fuksyna
karbolowa – bakterie zawierające w
ścianie komórkowej kwasy tłuszczowe
(Mycobacterium, Nocardia)

•

Metoda Giemsy – preparaty tkanek i
wykrywanie wirusów oraz Chlamydia

•

Metoda PAS – grzyby

Hodowla

•

Bardziej czuła niż preparat
bezpośredni

•

Bardziej kosztowna

•

Umożliwia określenie oporności na
antybiotyki

•

Stosuje się podłoża namnażające lub
selekcjonujące

Hodowla

•

Identyfikacja drobnoustroju – odbywa się
poprzez określenie właściwości
biochemicznych, najczęściej systemy
zautomatyzowane

•

Badanie oporności na antybiotyki –
metoda płytkowo-dyfuzyjna, metoda
pasków dyfuzyjnych, metoda
rozcieńczeniowa, metody automatyczne

Monitorowanie oporności

•

Gronkowce oporne na metycylinę

•

Enterokoki oporne na
aminoglikozydy i polipeptydy

•

Enterobacteriaceae wytwarzające
beta-laktamazy

•

Pseudomonas oporne na imipenem i
ciprofloksacynę

Testy lateksowe

•

Polegają na wiązaniu się specyficznych
przeciwciał (monoklonalnych) z
antygenami bakteryjnymi

•

Przeciwciała są umieszczone na nośniku
lateksowym lub krwinkach czerwonych

•

Nie zastępują hodowli, ale są szybsze i
ułatwiają podjęcie decyzji o leczeniu

Testy serologiczne

•

Polegają na łączeniu przeciwciał z
antygenem i wytrąceniu osadu lub
blokowaniu aktywności antygenu

•

Główne rodzaje odczynów serologicznych:

−precypitacji (antygeny rozpuszczalne)
−aglutynacji (wykrywanie przeciwciał i

antygenów)

−wiązania dopełniacza (blokowanie antygenów

lub liza komórek z udziałem dopełniacza)

−neutralizacja (zobojętnianie określonych

właściwości antygenu)

Metody serologiczne

•

Odczyn immunofluorescencji – przeciwciała znakowane
barwnikiem fluoryzującym, metoda pośrednia lub
bezpośrednia – wysoka czułość

•

Metody radioimmunologiczne – przeciwciała znakowane
izotopami

•

ELISA – znakowanie przeciwciał enzymami, które
następnie reagują z substancją chemiczną wytwarzając
barwnik, liczne odmiany metody

•

Immunobloting – elektroforeza białek i przeniesienie ich
na błonę, inkubacja w roztworze przeciwciał połączonych
z peroksydazą, która rozkłada barwnik – identyfikacja
antygenów białkowych i przeciwciał

Metody biologii
molekularnej

•

Pozwalają na szybką identyfikację drobnoustroju
i wdrożenie leczenia, ale nie eliminują potrzeby
posiewu i antybiogramu

•

Możliwa jest identyfikacja elementów ściany
bakteryjnej lub fragmentów kwasów
nukleinowych

•

Metody namnażania fragmentów DNA dają
ogromną czułość metod opartych na
identyfikacji specyficznych dla poszczegółnych
drobnoustrojów fragmentów DNA

Sondy genetyczne

•

Fragmenty DNA, które łączą się
komplementarnie ze ściśle im odpowiadającymi
fragmentami DNA drobnoustroju kodującymi
antygen, toksynę, oporność na lek, enzym itp

•

Cztery etapy:

− przygotowanie i denaturacja (rozdzielenie nici DNA)

materiału

− dodanie sondy i hybrydyzacja (połączenie)

− usunięcie niezwiązanej sondy

− wykrycie związanej sondy

•

Sondy wykrywające RNA są bardziej czułe,
ponieważ RNA występuje w wielu kopiach

Powielanie materiału
genetycznego

•

Polimerazowa reakcja amplifikacji (PCR) –
enzym jest niewrażliwy na temperaturę i w
podwyższonej temperaturze w kolejnych
cyklach syntetyzuje określone fragmenty
DNA

•

Produkty hybrydyzacji można oznaczyć
metodą elektroforezy lub swoistą sondą

•

Można zastosować do każdego (również
zdenaturowanego i utrwalonego) DNA

Zastosowania metod
molekularnych

•

Identyfikacja grzybów – Candida – hodowla trwa
długo i jest trudna, a zakażenia są bardzo
groźne – spektrograficzna identyfikacja d-
arabinitolu

•

Drobnoustroje wolno rosnące na podłożach –
Mycobacteria, Mycoplasma, Chlamydia, Borrelia
– metoda PCR umożliwia rozpoznanie w ciągu
24 godzin

•

Wirusy – HIV, EBV, HBV, HCV i inne – PCR i LCR
są podstawowymi metodami diagnostyki

Zastosowania metod
molekularnych

•

Oznaczanie zdolności wytwarzania toksyn i
enzymów

•

Wykrywanie genów oporności na antybiotyki

•

Typowanie genetyczne dla celów
epidemiologii zakażeń szpitalnych – ustalenie
czy mamy do czynienia z jednym szczepem,
czy różnymi ma wpływ na postępowanie