OGÓLNE ZASADY DIAGNOSTYKI MIKROBIOLOGICZNEJ
Katedra i Zakład Mikrobiologii Lekarskiej
Anna Majewska
DROBNOUSTROJE
BAKTERIE
WIRUSY
GRZYBY
RODZAJE INTERAKCJI
DROBNOUSTROJU Z ORGANIZMEM
DROBNOUSTROJE KOMENSALNE
DROBNOUSTROJE OPORTUNISTYCZNE
DROBNOUSTROJE PATOGENNE
DIAGNOSTYKA MIKROBIOLOGICZNA
CEL:
IDENTYFIKACJA CZYNNIKA
ETIOLOGICZNEGO ODPOWIEDZIALNEGO
ZA ZAKAŻENIE
OKREŚLENIE JEGO PROFILU
WRAŻLIWOŚCI NA CHEMIOTERAPEUTYKI
NADZÓR MIKROBIOLOGICZNY I EPIDEMIOLOGICZNY
POBRANIE MATERIAŁU
TRANSPORT
METODA DIAGNOSTYCZNA
PRÓBKI MATERIAŁU DO BADANIA MIKROBIOLOGICZNEGO
WYMAZ Z GARDŁA I MIGAŁKÓW, PLWOCINA,
WYMAZ Z RANY, ROPA Z ROPNIA,
WYCINKI TKANEK,
KREW, KAŁ, MOCZ,
POPŁUCZYNY PĘCHERZYKOWO- OSKRZELOWE
PŁYN MÓZGOWO-RDZENIOWY,
WYMAZ ZE SPOJÓWKI,
ZESKROBINY ROGÓWKOWE
ZASADY
PRZED ROZPOCZĘCIEM CHEMIOTERAPII
Z MIEJSC, W KTÓRYCH TOCZY SIĘ PROCES
CHOROBOWY
W ODPOWIEDNIM CZASIE
POBRAĆ ODPOWIEDNIĄ ILOŚĆ/OBJĘTOŚĆ MATERIAŁU
ZACHOWAĆ ZASADY ASEPTYKI (SPRZĘT, DEZYNFEKCJA SKÓRY)
ZAPEWNIĆ WŁAŚCIWE WARUNKI PRZECHOWYWANIA I TRANSPORTU
(TERMICZNE, PODŁOŻA TRANSPORTOWE)
DOSTARCZYĆ DO PRACOWNI MIKROBIOLOGICZNEJ W MOŻLIWIE NAJKRÓTSZYM CZASIE
METODY
BEZPOŚREDNIE POŚREDNIE
WYKRYCIE DROBNOUSTROJU WYKRYCIE SWOISTYCH
LUB JEGO FRAGMENTU PRZECIWCIAŁ
W MATERIALE KLINICZNYM
METODY
METODY NIEHODOWLANE
(SZYBKIE TESTY DIAGNOSTYCZNE)
METODY KONWENCJINALNE
(HODOWLA DROBNOUSTROJÓW)
METODY HODOWLI DROBNOUSTROJÓW POŁĄCZONE Z IZOLACJĄ I IDENTYFIKACJĄ MIKROORGANIZMU (NAJCZĘŚCIEJ DO GATUNKU) NAZYWANE SĄ METODAMI KONWENCJONALNYMI (KLASYCZNYMI).
SĄ SZCZEGÓLNIE ISTOTNE W BAKTERIOLOGII I MIKOLOGII, GDZIE OPRÓCZ IDENTYFIKACJI CZYNNIKA ETIOLOGICZNEGO POWINNY BYĆ WYKONANE TESTY WRAŻLIWOŚCI NA CHEMIOTERAPEUTYKI/ANTYBIOTYKI.
METODY KONWENCJONALNE (HODOWLA)
IZOLACJA I IDENTYFIKACJA DROBNOUSTROJU
W POBRANYCH MATERIAŁACH WYSTĘPUJĄ RÓŻNE GATUNKI DROBNOUSTROJÓW, W CELU ICH WYIZOLOWANIA, NAMNOŻENIA I UZYSKANIA CZYSTEJ HODOWLI, PRÓBKI POSIEWA SIĘ NA ODPOWIEDNIE PODŁOŻA WZROSTOWE.
HODOWLA DROBNOUSTROJÓW
STWORZYĆ WARUNKI W KTÓRYCH BYTUJĄ DROBNOUSTROJE
W A R U N K I H O D O W L I:
TLENOWE, MIKROAEROFILNE, BEZTLENOWE
TEMPERATURA: 35-37°C, 22-30°C
CIŚNIENIE OSMOTYCZNE - IZOTONICZNE
STĘŻENIE JONÓW WODOROWYCH (pH) - 6,8 - 7,5
P O D Ł O Ż A (POŻYWKI) H O D O W L A N E
PŁYNNE, PÓŁPŁYNNE, STAŁE
PROSTE, WZBOGACONE, SPECJALNE , RÓŻNICUJĄCE,
WYBIÓRCZE, WYBIÓRCZO - RÓŻNICUJĄCE
IDENTYFIKACJA
NA PODSTAWIE CHARAKTERYSTYCZNEGO
WZROSTU NA PODŁOŻACH
(MORFOLOGII KOLONII)
S. aureus
Salmonella spp.
MORFOLOGIA KOLONII
KSZTAŁT - OKRGŁY, OWALNY, SOCZEWKOWATY, PROMIENISTY
WIELKOŚĆ - ŚREDNICA KOLONII [W MM]
BRZEG - RÓWNY, FALISTY, POSZARPANY
POWIERZCHNIA - GŁADKA, POMARSZCZONA, GRUBOZIARNISTA
WYNIOSŁOŚĆ PONAD POWIERZCHNIĘ - PŁASKA, BRAK, STOŻKOWATA
KOLOR - KOLONII, PODOŻA
PRZEJRZYSTOŚĆ - PRZEJRZYSTA, MĘTNA
ZAPACH - DROŻDŻY, MIODU
TYP HEMOLIZY - α, β, γ
PRODUKCJA HEMOLIZYN
S. pyogenes
S. pneumoniae
C. perfringens - podwójna hemoliza
WZROST NA PODŁOŻACH PŁYNNYCH
WZROST DROBNOUSTROJÓW ZWIĄZANY JEST ZE SPOSOBEM ODDYCHANIA BAKTERII.
MOŻE ODBYWAĆ SIĘ NA POWIERZCHNI POŻYWKI,
TWORZYĆ OSAD NA DNIE NACZYNIA LUB POWODOWAĆ
ZMĘTNIENIE CAŁEJ POŻYWKI
NA PODSTAWIE WYNIKÓW TESTÓW
BIOCHEMICZNYCH (KOMERCYJNE TESTY API)
OKREŚLAJĄCYCH ZDOLNOŚĆ
DROBNOUSTROJÓW DO NP.: ROZKŁDU
CUKRÓW, ALKOHOLI, ICH WŁAŚCIWOŚCI
PROTEOLITYCZNE, WYTWARZANIE
ENZYMÓW
IDENTYFIKACJA (2)
NA PODSTAWIE OBRAZU MIKROSKOPOWEGO
NAJBARDZIEJ ROZPOWSZECHNIONE SĄ KOMERCYJNE BIOCHEMICZNE TESTY DIAGNOSTYCZNE, NP.:
API 20 E - PRZEZNACZONE DLA BAKTERII Z RODZINY ENTEROBACTERIACEAE
API 20 A - DLA BAKTERII BEZTLENOWYCH
API 20E
METODY NIEHODOWLANE
ODCZYNY IMMUNOLOGICZNE
METODY BIOLOGII MOLEKULARNEJ
TYPOWANIE BAKTERIOFAGAMI
METODY NIEHODOWLANE (1)
ODCZYNY IMMUNOLOGICZNE
PRECYPITACJI
AGLUTYNACJI
IMMUNOFLUORESCENCJI,
IMMUNOENZYMATYCZNE
ODCZYN PRECYPITACJI
ROZPUSZCZALNE ANTYGENY POLIPEPTYDOWE LUB WIELOCUKROWE UZYSKUJE SIĘ Z TKANEK LUB Z DROBNOUSTROJÓW NA DRODZE EKSTRAKCJI KWASAMI, ENZYMATYCZNIE LUB W PODWYŻSZONEJ TEMPERATURZE.
DO ICH IDENTYFIKACJI STOSOWANE SĄ W OBECNOŚCI ELEKTROLITÓW ZNANE SWOISTE PRZECIWCIAŁA.
ZASTOSOWANIE:
OZNACZANIE GRUP SEROLOGICZNYCH PACIORKOWCÓW
HEMOLIZUJĄCYCH WG LANCEFIELD (IDENTYFIKACJA WIELOCUKRU C) - PRECYPITACJA OBRĄCZKOWA.
IMMUNOPRECYPITACJA (IMMUNODYFUZJA) - METODA ELEKA DO WYKRYWANIA TOKSYNOTWÓRCZOŚCI MACZUGOWCÓW BŁONICY.
AGLUTYNACJA LATEKSOWA
MIKROCZĄSTECZKI LATEKSU OPŁASZCZONE SĄ ZNANYMI PRZECIWCIAŁAMI, KTÓRE WIĄŻĄ SIĘ ZE SPECYFICZNYMI ANTYGENAMI, DOPROWADZAJĄC DO WIDOCZNEJ GOŁYM OKIEM AGLUTYNACJI.
WYKONANIE TESTÓW NIE WYMAGA UŻYCIA CZYSTYCH SZCZEPÓW DROBNOUSTROJÓW.
ZASTOSOWANIE: IDENTYFIKACJA DWOINEK ZAPALENIA PŁUC, DO WYKRYWANIA CZYNNIKÓW ZAPALENIA OPON MÓZGOWO - RDZENIOWYCH (H. INFLUENZAE, S. PNEUMONIAE).
AGLUTYNACJA SZKIEŁKOWA
IDENTYFIKACJA NIEZNANYCH SZCZEPÓW BAKTERYJNYCH,
PRZY UŻYCIU ZNANYCH SWOISTYCH SUROWIC ODPORNOŚCIOWYCH.
ZASTOSOWANIE: W DIAGNOSTYCE BAKTERII Z
RODZAJÓW :
SALMONELLA, SHIGELLA, PSEUDOMONAS, NEISSERIA.
Coli Lateks EPEC
METODY IMMUNOFLUORESCENCYJNE
ODCZYN IMMUNOFLUORESCENCJI BEZPOŚREDNIEJ
PO UTRWALENIU PRÓBKI NAKRAPLA SIĘ WZORCOWE PRZECIWCIAŁA WYZNAKOWANE FLUOROCHROMEM. PO OKRESIE INKUBACJI PREPARAT UMIESZCZA SIĘ W MIKROSKOPIE FLUORESCENCYJNYM.
JEŚLI W BADANYM MATERIALE ZNAJDOWAŁY SIĘ SPECYFICZNE DLA WYZNAKOWANYCH PRZECIWCIAŁ DROBNOUSTROJE, W POLU WIDZENIA MIKROSKOPU UWIDOCZNI SIĘ ŚWIECĄCY KOMPLEKS.
ODCZYN IMMUNOFLUORESCENCJI POŚREDNIEJ
W REAKCJI BIORĄ UDZIAŁ 3 REAGUJĄCE SUBSTANCJE:
ZNANY ANTYGEN,
BADANA SUROWICA,
ZNAKOWANA FLUOROCHROMEM ANTYIMMUNOGLOBULINA ZWIERZĘCA PRZECIW POSZUKIWANYM PRZECIWCIAŁOM.
METODY IMMUNOFLUOROSCENCYJNE
METODY IMMUNOENZYMATYCZNE (EIA, ELISA)
BEZPOŚREDNIE - BADANE ANTYGENY REAGUJĄ
Z PRZECIWCIAŁAMI, KTÓRE, ZWIĄZANE SĄ Z ENZYMEM
NP.: PEROKSYDAZĄ CHRZANOWĄ.
DLA UWIDOCZNIENIA KOMPLEKSU
ANTYGENU Z PRZECIWCIAŁEM
DODAJE SIĘ ODPOWIEDNIO
DOBRANY SUBSTRAT
I PO INKUBACJI
ODCZYTUJE SIĘ WYNIK
REAKCJI BARWNEJ
JAKOŚCIOWO
LUB ILOŚCIOWO.
METODY POŚREDNIE
ZASTOSOWANIE: DIAGNOSTYKA ZAKAŻEŃ WYWOŁANYCH PRZEZ DROBNOUSTROJE Z RODZAJU:
BORRELIA, LEGIONELLA, CHLAMYDIA.
METODY BIOLOGII MOLEKULARNEJ
POSZUKIWANIE KWASÓW NUKLEINOWYCH W MATERIALE KLINICZNYM LUB HODOWLI DROBNOUSTROJÓW;
PCR (METODA POLIMERYZACJI REAKCJI ŁAŃCUCHOWEJ),
HYBRYDYZACJA KWASÓW NUKLEINOWYCH PRZY UŻYCIU SOND MOLEKULARNYCH
METODY NIEHODOWLANE (2)
METODA POLIMERAZOWEJ REAKCJI ŁAŃCUCHOWEJ (PCR)
POZWALA NA WYKRYCIE ZNIKOMEJ ILOŚCI DNA W BADANEJ PRÓBCE,
NAWET GDY DROBNOUSTROJE W MATERIALE ZAKAŹNYM SĄ MARTWE.
HYBRYDYZACJA KWASÓW NUKLEINOWYCH - PRZY UŻYCIU SOND
MOLEKULARNYCH.
BADANIE TRWA OK. 2 GODZ. I UMOŻLIWIA W ZALEŻNOŚCI OD RODZAJU DROBNOUSTROJU
WYKRYCIE DNA PRZY ILOŚCI 10 3 DROBNOUSTROJÓW.
INNE METODY IDENTYFIKACJI
ANALIZA CHROMATOGRAFI GAZOWEJ
METODA STOSOWANA JEST DO JAKOŚCIOWEGO LUB ILOŚCIOWEGO ROZDZIAŁU SUBSTANCJI (SKŁADNIKÓW KOMÓREK BAKTERYJNYCH LUB PRODUKTÓW ICH METABOLIZMU) O MAŁEJ MASIE CZĄSTECZKOWEJ.
WYSOCE PRECYZYJNA I CZUŁA.
STOSOWANA JEST GŁÓWNIE DO IDENTYFIKACJI PRODUKTÓW METABOLIZMU BAKTERII BEZTLENOWYCH (KWASY TŁUSZCZOWE).
POZWALA TEŻ NA SZYBKĄ IDENTYFIKACJĘ GRZYBÓW I BAKTERII Z RODZAJÓW MYCOBACTERIUM, NEISSERIA.
TYPOWANIE BAKTERIOFAGAMI
MA NA CELU IDENTYFIKACJĘ OKREŚLONYCH GATUNKÓW WYHODOWANYCH BAKTERII (RZADKO) LUB OZNACZANIE ICH TYPÓW FAGOWYCH.
OZNACZANIE TYPÓW FAGOWYCH STOSOWANE JEST W DOCHODZENIU EPIDEMIOLOGICZNYM, W CELU USTALENIA ŹRÓDŁA ZAKAŻENIA I DRÓG SZERZENIA W ŚRODOWISKU SZPITALNYM I POZASZPITALNYM.
OKREŚLENIE LEKOWRAŻLIWOŚCI
POZWALA NA WYBÓR CHEMIOTERAPEUTYKU O
NAJWĘŻSZYM ZAKRESIE DZIAŁANIA I
NAJWIĘKSZEJ SKUTECZNOŚCI PRZECIWKO
WYIZOLOWANEMU DROBNOUSTROJOWI.
DOSTĘPNE SĄ KOMERCYJNE METODY OZNACZANIA LEKOOPORNOŚCI BAKTERII WG SYSTEMU ATB:
ATB G - DLA RODZINY ENTEROBACTERIACEAE
ATB - STAPH 5 - DLA GRONKOWCÓW
ATB - ANA - DLA BAKTERII BEZTLENOWYCH
WYKRYWANIE MECHANIZMÓW OPORNOŚCI BAKTERII NA LEKI - TESTY SPECJALNE
METODA DYFUZYJNO - KRĄŻKOWA
Aglutynacja lateksowa
WYKRYWANIE BIAŁKA PBP 2’ - IDENTYFIKACJA
GRONKOWCÓW OPORNYCH NA METYCYLINĘ
(MRSA, MRCNS)