Insulina

Insulina

Odkrywcy insuliny

Odkrywcy insuliny

Sir Frederick
Banting

Charles
Best

Federick
Sanger

Nagroda Nobla w
1923 za odkrycie
insuliny

Nagroda Nobla w
1953 za ustalenie
sekwencji
aminokwasów

Cukrzyca

Cukrzyca

Cukrzyca (

Cukrzyca (

diabetes mellitus

diabetes mellitus

) jest przewlekłą

) jest przewlekłą

chorobą przemiany materii spowodowaną

chorobą przemiany materii spowodowaną

brakiem lub nieprawidłowym działaniem

brakiem lub nieprawidłowym działaniem

hormonu - insuliny. Wraz z zaburzeniem

hormonu - insuliny. Wraz z zaburzeniem

gospodarki cukrowej organizmu zaburzona

gospodarki cukrowej organizmu zaburzona

zostaje również gospodarka tłuszczowa,

zostaje również gospodarka tłuszczowa,

białkowa i wodno-elektrolitowa.

białkowa i wodno-elektrolitowa.

Światowa Organizacja Zdrowia szacuje, że

Światowa Organizacja Zdrowia szacuje, że

w 1985 roku było na świecie 30 mln ludzi

w 1985 roku było na świecie 30 mln ludzi

chorujących na cukrzycę, 10 lat później

chorujących na cukrzycę, 10 lat później

135 mln, a w roku 2000 - 171 mln. Przewiduje

135 mln, a w roku 2000 - 171 mln. Przewiduje

się, że w roku 2030 będzie około 366 mln ludzi

się, że w roku 2030 będzie około 366 mln ludzi

chorych na cukrzycę

chorych na cukrzycę

POZIOM CUKRU U OSÓB

POZIOM CUKRU U OSÓB

ZDROWYCH I CHORYCH

ZDROWYCH I CHORYCH

Objawy cukrzycy:

Objawy cukrzycy:



zmęczenie,

zmęczenie,



osłabienie,

osłabienie,



wielomocz (czyli częste oddawanie dużej ilości

wielomocz (czyli częste oddawanie dużej ilości

moczu),

moczu),



nadmierne pragnienie,

nadmierne pragnienie,



zwiększony apetyt,

zwiększony apetyt,



chudnięcie.

chudnięcie.

Podstawowe znaczenie dla rozpoznania

Podstawowe znaczenie dla rozpoznania

cukrzycy mają badania biochemiczne krwi i

cukrzycy mają badania biochemiczne krwi i

oznaczenie zawartości cukru we krwi oraz w

oznaczenie zawartości cukru we krwi oraz w

moczu (tzw. glikozurii, czyli cukromoczu).

moczu (tzw. glikozurii, czyli cukromoczu).

Prawidłowe stężenie glukozy we krwi

Prawidłowe stężenie glukozy we krwi



glikemia na czczo: 3,4-5,5 mmol/l (60-99 mg/dl)

glikemia na czczo: 3,4-5,5 mmol/l (60-99 mg/dl)



glikemia przygodna: <11,1 mmol/l (<200

glikemia przygodna: <11,1 mmol/l (<200

mg/dl) - powyżej tego poziomu u chorych z

mg/dl) - powyżej tego poziomu u chorych z

objawami rozpoznaje się już

objawami rozpoznaje się już

cukrzycę

cukrzycę

Skutki nie leczenia

Skutki nie leczenia

cukrzycy

cukrzycy

Owrzodzenie stopy z
martwicą

Zmiany w dnie
oka

Retinotapatia
cukrzycowa

Typy cukrzycy:

Typy cukrzycy:



Typ I

Typ I

: występuje u ludzi młodych jest spowodowana

: występuje u ludzi młodych jest spowodowana

zniszczeniem lub niewydolnością komórek trzustki,

zniszczeniem lub niewydolnością komórek trzustki,

odpowiedzialnych za produkcję i wydzielanie insuliny. Ten

odpowiedzialnych za produkcję i wydzielanie insuliny. Ten

rodzaj cukrzycy nazywany jest cukrzycą insulinozależną

rodzaj cukrzycy nazywany jest cukrzycą insulinozależną



Typ II

Typ II

: występuje u ludzi starszych, na ogół otyłych i z

: występuje u ludzi starszych, na ogół otyłych i z

nadciśnieniem tętniczym, cukrzycę wywołuje oporność na

nadciśnieniem tętniczym, cukrzycę wywołuje oporność na

działanie insuliny. Wymaga ciągłego przyjmowania

działanie insuliny. Wymaga ciągłego przyjmowania

odpowiednich leków doustnych. Często, z czasem,

odpowiednich leków doustnych. Często, z czasem,

potrzebne jest także przejście na zastrzyki z insuliną

potrzebne jest także przejście na zastrzyki z insuliną



Wtórna

Wtórna

: jest spowodowana rozregulowaniem

: jest spowodowana rozregulowaniem

metabolizmu organizmu przez inne zaburzenia lub

metabolizmu organizmu przez inne zaburzenia lub

zespoły chorobowe

zespoły chorobowe



Ciążowa

Ciążowa

: spowodowana zaburzeniem gospodarki

: spowodowana zaburzeniem gospodarki

hormonalnej organizmu podczas ciąży. Zazwyczaj

hormonalnej organizmu podczas ciąży. Zazwyczaj

całkowicie ustępuje po porodzie, ale zwiększa ryzyko

całkowicie ustępuje po porodzie, ale zwiększa ryzyko

zachorowania na cukrzycę typu 2 w przyszłości

zachorowania na cukrzycę typu 2 w przyszłości



Cukrzyca typu pierwszego (insulinozależna):

Cukrzyca typu pierwszego (insulinozależna):



spowodowana jest genetycznym, wrodzonym

spowodowana jest genetycznym, wrodzonym

uszkodzeniem komórek beta w trzustce

uszkodzeniem komórek beta w trzustce

produkujących insulinę.

produkujących insulinę.



objawy wynikają z niedoboru lub całkowitego

objawy wynikają z niedoboru lub całkowitego

braku endogennej insuliny,

braku endogennej insuliny,



objawia się w dzieciństwie lub okresie

objawia się w dzieciństwie lub okresie

młodzieńczym,

młodzieńczym,



jest związana z dożywotnią koniecznością

jest związana z dożywotnią koniecznością

przyjmowania insuliny.

przyjmowania insuliny.



Cukrzyca typu drugiego (insulinoniezależna):

Cukrzyca typu drugiego (insulinoniezależna):



występuje zazwyczaj u ludzi po 40 roku

występuje zazwyczaj u ludzi po 40 roku

życia,

życia,



jest związana ze zwyczajami żywieniowymi

jest związana ze zwyczajami żywieniowymi

i otyłością,

i otyłością,



początek leczenia - leki doustnych, a po

początek leczenia - leki doustnych, a po

pewnym czasie progresja choroby zmusza do

pewnym czasie progresja choroby zmusza do

stosowania insuliny.

stosowania insuliny.

Hormony

Hormony

są to chemiczne

są to chemiczne

substancje

substancje

sygnałowe,

sygnałowe,

syntetyzowane

syntetyzowane

przez wyspecjalizowane

przez wyspecjalizowane

komórki

komórki

gruczołów

gruczołów

dokrewnych.

dokrewnych.

Są one

Są one

wydzielane do

wydzielane do

krwi

krwi

i z nią

i z nią

transportowane do

transportowane do

narządów docelowych,

narządów docelowych,

w

w

których regulują procesy

których regulują procesy

fizjologiczne i biochemiczne.

fizjologiczne i biochemiczne.

Hormony regulują:

Hormony regulują:



Wzrost i różnicowanie się komórek, tkanek i narządów

Wzrost i różnicowanie się komórek, tkanek i narządów



Szlaki przemian metabolicznych

Szlaki przemian metabolicznych



Trawienie

Trawienie



Utrzymanie stężenia jonów (homeostaza)

Utrzymanie stężenia jonów (homeostaza)

Układ regulacji hormonalnej

Układ regulacji hormonalnej

Działanie hormonów:

Działanie hormonów:



endokrynne,

endokrynne,



parakrynne,

parakrynne,



autokrynne.

autokrynne.



Insulina

Insulina

,

,

która wytwarzana jest w komórkach B

która wytwarzana jest w komórkach B

trzustki, ma działanie:

trzustki, ma działanie:



parakrynne - ha mowanie wytwarzania i

parakrynne - ha mowanie wytwarzania i

uwalniania

uwalniania

glukagonu

glukagonu

z sąsiednich komórek A

z sąsiednich komórek A

wysp trzustkowych,

wysp trzustkowych,



endokrynne - w regulacji metabolizmu glukozy i

endokrynne - w regulacji metabolizmu glukozy i

lipidów.

lipidów.

Hierarchia

Hierarchia

hormonów

hormonów

Hormony

Lipofilowe

Hydrofilowe

Hormony

Steroidowe

(Progesteron ,

Testosteron,

Kortyzol,

Aldosteron,

Kalcytriol)

Jodotyroniny

(Tyroksyna)

Kwas

retinowy

Pochodne

aminokwasów

(Histamina,

Serotonina,

Melatoni na,

Aminy katecholowe,

tj. DOPA,

dopamina,

noradrenalina,

adrenalina)

Peptydy,

białka złożone

z aminokwasów

(Tyreoliberyna,

Tyreotropina,

Insulina,

Glukagon)

Biosynteza

Biosynteza

STRUKTURA

STRUKTURA

INSULINY

INSULINY

Insulina może

Insulina może

tworzyć dimery

tworzyć dimery

i heksamery.

i heksamery.

Są one jednak

Są one jednak

dużo wolniej

dużo wolniej

wchłaniane w

wchłaniane w

organiźmie.

organiźmie.

Przeprowadza się

Przeprowadza się

modyfikaję polegającą

modyfikaję polegającą

na zmianie kolejności

na zmianie kolejności

ostatnich

ostatnich

aminokwasów co

aminokwasów co

zapobiega tworzenia

zapobiega tworzenia

złożonych struktur

złożonych struktur

Insulina może

Insulina może

tworzyć dimery

tworzyć dimery

i heksamery.

i heksamery.

Są one jednak

Są one jednak

dużo wolniej

dużo wolniej

wchłaniane w

wchłaniane w

organiźmie.

organiźmie.

Przeprowadza się

Przeprowadza się

modyfikaję polegającą

modyfikaję polegającą

na zmianie kolejności

na zmianie kolejności

ostatnich

ostatnich

aminokwasów co

aminokwasów co

zapobiega tworzenia

zapobiega tworzenia

złożonych struktur

złożonych struktur

WYDZIELANIE

WYDZIELANIE

INSULINY

INSULINY

Insulina jest wytwarzana w

Insulina jest wytwarzana w

organizmie w odpowiedzi na

organizmie w odpowiedzi na

zmianę stężenia glukozy we

zmianę stężenia glukozy we

krwi. Transportery glukozy

krwi. Transportery glukozy

GLUT2 pozwalają wniknąć

GLUT2 pozwalają wniknąć

cząsteczce glukozy do

cząsteczce glukozy do

komórek beta. Wewnątrz

komórek beta. Wewnątrz

zachodzi fosforylacja glukozy,

zachodzi fosforylacja glukozy,

która w następnych etapach

która w następnych etapach

jest metabolizowana do ATP.

jest metabolizowana do ATP.

Zwiększony stosunek

Zwiększony stosunek

ATP:ADP powoduje

ATP:ADP powoduje

zamknięcie kanałów

zamknięcie kanałów

potasowych w wyniku czego

potasowych w wyniku czego

następuje wzrost stężenia

następuje wzrost stężenia

jonów K+ a dalej polaryzację

jonów K+ a dalej polaryzację

błony. Efektem tego jest

błony. Efektem tego jest

otwarcie kanałów wapniowych

otwarcie kanałów wapniowych

i wpłynięcie jonów Ca+ do

i wpłynięcie jonów Ca+ do

środka komórki. W wyniku

środka komórki. W wyniku

tego insulina jest wydzielana

tego insulina jest wydzielana

do krwi.

do krwi.

DZIAŁANIE

DZIAŁANIE

INSULINY

INSULINY

Insulina krąży we

Insulina krąży we

krwi gdy poziom

krwi gdy poziom

glukozy wzrasta.

glukozy wzrasta.

Przyłącza się ona do

Przyłącza się ona do

receptorów w

receptorów w

komórce. W wyniku

komórce. W wyniku

tego wewnątrz

tego wewnątrz

komórki

komórki

przekazywany jest

przekazywany jest

sygnał o

sygnał o

wychwytywaniu

wychwytywaniu

glukozy z krwi. W

glukozy z krwi. W

komórce istnieją

komórce istnieją

specjalne

specjalne

transportery

transportery

glukozy typu GLUT4

glukozy typu GLUT4

przystosowane do

przystosowane do

wyłapywania

wyłapywania

glukozy z obiegu.

glukozy z obiegu.

Rola insuliny polega na:

Rola insuliny polega na:



wykorzystywaniu cukrów i

wykorzystywaniu cukrów i

tłuszczów jako materiału

tłuszczów jako materiału

energetycznego dla komórek;

energetycznego dla komórek;



magazynowaniu nadmiernej

magazynowaniu nadmiernej

ilości cukrów w postaci zapasów;

ilości cukrów w postaci zapasów;



wytwarzaniu białek z substancji

wytwarzaniu białek z substancji

znajdujących się w pożywieniu.

znajdujących się w pożywieniu.

Działanie insuliny:

Przyśpiesza:

• syntezę glukogenu

• syntezę kwasów tluszczowych

• estryfikację kwasów tłuszczowych

• Transport aminokwasów

•Transport potasu

•Zwalnia proteinolizę

•Zwalnia lipolizę

•Zmniejsza glukogenogenezę

Rola insuliny

Rola insuliny



Pomaga glukozie wniknąć do

Pomaga glukozie wniknąć do

komórek

komórek



Stymuluje magazynowanie glukozy

Stymuluje magazynowanie glukozy

w wątrobie

w wątrobie



Pobudza wytwarzanie tłuszczu z

Pobudza wytwarzanie tłuszczu z

nadwyżki węglowodanów

nadwyżki węglowodanów



Pobudza wytwarzanie związków

Pobudza wytwarzanie związków

białka

białka

SYNTEZA INSULINY

SYNTEZA INSULINY

1.

1.

Synteza dwóch

Synteza dwóch

łańcuchów insuliny

łańcuchów insuliny

a następnie ich połączenie

a następnie ich połączenie

mostkami siarczkowymi.

mostkami siarczkowymi.

Nić DNA kodująca łańcuch B insuliny

Nić DNA kodująca łańcuch B insuliny

(m) RNA

Transkrypcja

Transkrypcja

Struktura DNA i proces

Struktura DNA i proces

transkrypcji

transkrypcji

TRANSLACJA W

TRANSLACJA W

RYBOSOMACH

RYBOSOMACH

Proinsulina

Proinsulina

Peptyd nieaktywny prekursor insuliny.

Peptyd nieaktywny prekursor insuliny.

Proinsulina powstaje z preproinsuliny w

Proinsulina powstaje z preproinsuliny w

trzustce, w komórkach β wysepek

trzustce, w komórkach β wysepek

Langerhansa

Langerhansa

Wysepka Langerhansa
wyizolowana z trzustki
szczura

Przekształcanie

Przekształcanie

preproinsuliny w

preproinsuliny w

insulinę

insulinę

Preparaty Insulinowe

Preparaty Insulinowe



insulina zwierzęca

insulina zwierzęca



pozyskiwana z trzustek zwierzęcych (dawcami są świnie,

pozyskiwana z trzustek zwierzęcych (dawcami są świnie,

krowy i psy),

krowy i psy),



skomplikowana technologia produkcji (problemy z

skomplikowana technologia produkcji (problemy z

oczyszczeniem),

oczyszczeniem),



wieprzowa insulina ma budowę bardzo zbliżoną do ludzkiej

wieprzowa insulina ma budowę bardzo zbliżoną do ludzkiej

(różnica dotyczy tylko jednego aminokwasu), mimo to

(różnica dotyczy tylko jednego aminokwasu), mimo to

immunizuje i alergizuje pacjentów powodując liczne

immunizuje i alergizuje pacjentów powodując liczne

powikłania terapii

powikłania terapii

,

,



insulina humanizowana

insulina humanizowana



insulina wieprzowa, w której metodą chemiczną wymienia się

insulina wieprzowa, w której metodą chemiczną wymienia się

jeden aminokwas;

jeden aminokwas;



insulina ludzka

insulina ludzka



produkt uzyskany dzięki inżynierii genetycznej,

produkt uzyskany dzięki inżynierii genetycznej,



Wytwarzana przez bakterie lub grzyby, do których

Wytwarzana przez bakterie lub grzyby, do których

wprowadzono ludzki gen kodujący insulinę,

wprowadzono ludzki gen kodujący insulinę,



uzyskany produkt jest identyczny z insuliną wytwarzaną

uzyskany produkt jest identyczny z insuliną wytwarzaną

przez trzustkę człowieka;

przez trzustkę człowieka;



analog insuliny ludzkiej

analog insuliny ludzkiej



insulina ludzka, w której wymieniono jeden lub parę

insulina ludzka, w której wymieniono jeden lub parę

aminokwasów, dzięki czemu uzyskuje się szczególne

aminokwasów, dzięki czemu uzyskuje się szczególne

właściwości produktu

właściwości produktu

.

.

Otrzymywanie insuliny

Otrzymywanie insuliny

bydlęcej

bydlęcej

Aby zapewnić
wystarczającą ilość
insuliny dla jednego
pacjenta w ciągu roku,
potrzeba około 7 kg
trzustki zwierzęcej

Otrzymywanie insuliny

Otrzymywanie insuliny

ludzkiej

ludzkiej

„

„

Produkcja insuliny ludzkiej

Produkcja insuliny ludzkiej

jest jednym z najbardziej

jest jednym z najbardziej

skomplikowanych procesów

skomplikowanych procesów

biochemicznych. Technolodzy

biochemicznych. Technolodzy

mówią, że jeśli ktoś umie

mówią, że jeśli ktoś umie

zrobić insulinę, to już resztę

zrobić insulinę, to już resztę

wykona za niego nawet stróż

wykona za niego nawet stróż

w wolnym czasie”

w wolnym czasie”

Gazeta Wyborcza

Metody rekombinacji

Metody rekombinacji



Przy użyciu

Przy użyciu

E. coli

E. coli

z wstawką

z wstawką

zawierającą gen kodujący proinsulinę

zawierającą gen kodujący proinsulinę



Przy użyciu

Przy użyciu

E. coli

E. coli

z wstawką

z wstawką

kodującą poszczególne łańcuchy

kodującą poszczególne łańcuchy

insuliny

insuliny



Przy użyciu

Przy użyciu

Saccharomyces

Saccharomyces

cerevisiae

cerevisiae

zawierających gen

zawierających gen

proinsuliny

proinsuliny

Gen insuliny

Gen insuliny

63 pary zasad kodują łańcuch A

63 pary zasad kodują łańcuch A

90 par zasad koduje łańcuch B

90 par zasad koduje łańcuch B

Kodon terminujący syntezę białka

Kodon terminujący syntezę białka

Wektor do namnażania

Wektor do namnażania

Komórka
E.coli

Wektor
plazmidowy

Izolowanie genu

Izolowanie genu

Tym samym enzymem restrykcyjnym
przecinamy DNA dawcy i plazmid

Budowa wektora

Budowa wektora



Sekwencje ori – początek replikacji

Sekwencje ori – początek replikacji



Geny odporności na antybiotyki

Geny odporności na antybiotyki



Fragment genu kodującego

Fragment genu kodującego

β

β

-

-

galaktozydazę

galaktozydazę

Łączenie z plazmidem

Łączenie z plazmidem

Fragment wyizolowanego genu,

Fragment wyizolowanego genu,

każdego z łańcuchów osobno

każdego z łańcuchów osobno

wstawiany jest pomiędzy sekwencje

wstawiany jest pomiędzy sekwencje

genu kodującego

genu kodującego

β

β

-galaktozydazę.

-galaktozydazę.

Namnażanie

Namnażanie

Plazmidy namnażają się nie zależnie od
komórek bakteryjnych, stąd w jednej komórce
może być więcej niż jedna kopia plazmidu

Izolowanie powielonych

Izolowanie powielonych

łańcuchów

łańcuchów

W wyniku reakcji chemicznych takich

W wyniku reakcji chemicznych takich

jak sulfonowanie, tioliza i utlenianie

jak sulfonowanie, tioliza i utlenianie

otrzymujemy aktywny hormon

otrzymujemy aktywny hormon

Rekombinacja -

Rekombinacja -

Szczegóły

Szczegóły



Szczep

Szczep

E. Coli

E. Coli

JM101

JM101



Plazmid

Plazmid

pKK233-3

pKK233-3



Wstawka genu ludzkiej proinsuliny z

Wstawka genu ludzkiej proinsuliny z

bibliotek cDNA

bibliotek cDNA



Enzymy restrykcyjne

Enzymy restrykcyjne



Eco

Eco

RI

RI



Hin

Hin

dIII

dIII



Transformacja bakterii na podłożu LB-

Transformacja bakterii na podłożu LB-

agar z dodatkiem ampicyliny 100 [

agar z dodatkiem ampicyliny 100 [

µ

µ

g/ml]

g/ml]

PRZECHOWYWANIE

PRZECHOWYWANIE

SZCZEPÓW

SZCZEPÓW



Bakterie są przechowywane w postaci

Bakterie są przechowywane w postaci

zamrożonej (-70

zamrożonej (-70

°

°

C do -80

C do -80

°

°

C )

C )

, a do

, a do

kolejnych szarż procesu ożywiane

kolejnych szarż procesu ożywiane

i poddane rozmnażaniu przez

i poddane rozmnażaniu przez

klonowanie

klonowanie



Stabilność cech nabytych przez

Stabilność cech nabytych przez

genetyczne zmodyfikowanie są

genetyczne zmodyfikowanie są

kontrolowane poprzez umieszczenie

kontrolowane poprzez umieszczenie

szczepów w roztworze z niewielką

szczepów w roztworze z niewielką

ilością ampicyliny i tetracykliny

ilością ampicyliny i tetracykliny

Technologie produkcji

Technologie produkcji

insuliny

insuliny



Produkcja gotowej insuliny produkowanej

Produkcja gotowej insuliny produkowanej

w procesie sekrecji plazmidowej

w procesie sekrecji plazmidowej

E. Coli

E. Coli



Produkcja proinsuliny i przekształcanie w

Produkcja proinsuliny i przekształcanie w

insulinę na drodze:

insulinę na drodze:



Chemicznej

Chemicznej



Enzymatycznej

Enzymatycznej



Produkcja osobno łańcuchów A i B

Produkcja osobno łańcuchów A i B

insuliny z osobnych wstawek, wydzielenie

insuliny z osobnych wstawek, wydzielenie

i finalne łączenie enzymatyczne

i finalne łączenie enzymatyczne

(proces

(proces

najnowszy)

najnowszy)

BIOTON S.A.

BIOTON S.A.

Współpraca - Instytut

Współpraca - Instytut

Biotechnologii i Antybiotyków

Biotechnologii i Antybiotyków

Proces produkcji insuliny

Proces produkcji insuliny

Fermentacja

Odzysk Surowej

Proinsuliny

Oczyszczanie

Proinsuliny

Enzymatyczne

Odcięcie białka

Fuzyjnego

Oczyszczanie

Surowej Insuliny

Krystalizacja

Produkt Finalny – Czysta ludzka

rekombinowana insulina

Fermentacja

Fermentacja



Zrekombinowane uprzednio bakterie

Zrekombinowane uprzednio bakterie

E. Coli

E. Coli

namnażane są w bioreaktorze

namnażane są w bioreaktorze



Bioreaktor typu okresowego, lub

Bioreaktor typu okresowego, lub

semi-okresowego

semi-okresowego



Warunki procesu muszą być ściśle

Warunki procesu muszą być ściśle

przestrzegane ponieważ procesem

przestrzegane ponieważ procesem

konkurencyjnym w stosunku do

konkurencyjnym w stosunku do

sekrecji rekombinowanego białka

sekrecji rekombinowanego białka

przez

przez

E. Coli

E. Coli

jest produkcja octanu

jest produkcja octanu

WARUNKI BIOSYNTEZY

WARUNKI BIOSYNTEZY



Szczep E. Coli DH5 z Clontech-BD Biosciences, PaIo Alto,

Szczep E. Coli DH5 z Clontech-BD Biosciences, PaIo Alto,

California, USA

California, USA



Bioreaktor (z urządzeniem napowietrzającym i

Bioreaktor (z urządzeniem napowietrzającym i

mieszadłem)

mieszadłem)



pH 6.8

pH 6.8



temp 37

temp 37

°

°

C

C



pożywka SOC (kompletna, bogata pożywka do efektywnej

pożywka SOC (kompletna, bogata pożywka do efektywnej

hodowli bakterii

hodowli bakterii

E. coli

E. coli

poddanych transformacji

poddanych transformacji

plazmidowej ; skład:

plazmidowej ; skład:

2% (w/o) trypton

2% (w/o) trypton

0,5% (w/o) ekstrakt drożdżowy

0,5% (w/o) ekstrakt drożdżowy

0,05% (w/o) NaCl

0,05% (w/o) NaCl

2,5 mM KCl

2,5 mM KCl

20 mM sterylnej glukozy

20 mM sterylnej glukozy

w wodzie bidestylowanej

w wodzie bidestylowanej

Zalety:

-prostota prowadzenia operacji,

-łatwość utrzymania warunków jałowych,

-odnawialność inokulum zapobiega
degeneracji szczepu.

Wady:
-niska produkcyjność procesu,
-brak możliwości regulacji stężenia
substratu.

hodowla na podłożu ciekłym – HPC,

okresowa (batch culture) – stanowi ona system zamknięty,
mikroorganizmy wzrastają na określonej , ograniczonej ilości
pożywki.

Polega na:

-załadowaniu pożywki do fermentora,

-wysterylizowaniu jej wraz z aparatem,

-zaszczepieniu materiału posiewowego,

-namnażaniu mikroorganizmów.

w celu zapewnienia optymalnych warunków życia dla szczepu
produkcyjnego utrzymywana jest odpowiednia temperatura,
odpowiednia kwasowość środowiska, a hodowla jest izolowana
od innych mikroorganizmów.

b

iosynteza insuliny jest trzyetapowa i obejmuje hodowlę

kolbową, hodowlę posiewową oraz hodowlę produkcyjną.

BIOREAKTOR

BIOREAKTOR

Główną częścią tego urządzenia jest
komora hodowlana, w której zachodzą
procesy biosyntezy

Hodowane w
fermentorze
bakterie E. coli
potrzebują
substancji
odżywczych,
dlatego do
komory wraz z
zawiesiną
bakterii
wprowadza się
pożywkę SOC

W celu
zapewnienia
hodowanym
organizmom
warunków
tlenowych,
wnętrze komory
jest
napowietrzane

Aby wyrównać warunki
panujące wewnątrz
komory (dostępność
pożywki i tlenu),
zawiesina jest stale
mieszana

Bakterie mnożą się i
wytwarzają tak duże ilości
ciepła, że jego nadmiar musi
być odprowadzony. W tym
celu zbiornik chłodzi się
wodą

Po osiągnięciu optymalnego stanu hodowli
bakterie pobudza się do zaprogramowanej
produkcji ludzkiej insuliny

Po osiągnięciu odpowiedniego
stężenia insuliny w komórkach,
zawartość komory zostaje
przepompowana do urządzeń, w
których insulina zostanie wydobyta z
komórek E. coli i oczyszczona.
Komora jest gotowa do nowego cyklu
produkcyjnego

Fermentacja – Warunki

Fermentacja – Warunki



Wysoka gęstość komórek w bioreaktorze

Wysoka gęstość komórek w bioreaktorze

~100 [g (suchej masy)/l]

~100 [g (suchej masy)/l]



Inokulum przygotowane jest uprzednio w

Inokulum przygotowane jest uprzednio w

kolbach z dodatkiem ampicyliny

kolbach z dodatkiem ampicyliny



Mieszanie z prędkością 600-900 [rpm]

Mieszanie z prędkością 600-900 [rpm]



Docelowe pH = 7 (Utrzymywane przez

Docelowe pH = 7 (Utrzymywane przez

dodawanie 4M NaOH i 4M HCl)

dodawanie 4M NaOH i 4M HCl)

Fermentacja - Warunki

Fermentacja - Warunki



Temperatura procesu – 37

Temperatura procesu – 37

°

°

C

C



Docelowe stężenie tlenu w reaktorze –

Docelowe stężenie tlenu w reaktorze –

40%

40%



Szybkość aeracji – 2 [vvm]

Szybkość aeracji – 2 [vvm]



Pożywka o niskiej zawartości glukozy

Pożywka o niskiej zawartości glukozy



Pulsacyjna addycja glukozy do reaktora

Pulsacyjna addycja glukozy do reaktora



Docelowe stężenie glukozy – 5 [g/l]

Docelowe stężenie glukozy – 5 [g/l]



Dokarmianie rozpoczyna się po

Dokarmianie rozpoczyna się po

zakończeniu wykładniczej fazy wzrostu

zakończeniu wykładniczej fazy wzrostu



Możliwe jest również pulsacyjne

Możliwe jest również pulsacyjne

dozowanie alaniny i seryny

dozowanie alaniny i seryny

WYDZIELANIE

WYDZIELANIE

INSULINY

INSULINY



Skuteczność działania (i wartość

Skuteczność działania (i wartość

handlowa) bioproduktu zależy od

handlowa) bioproduktu zależy od

stopnia jego czystości

stopnia jego czystości



Czystość jest czynnikiem

Czystość jest czynnikiem

decydującym o aktywności i

decydującym o aktywności i

skuteczności insuliny

skuteczności insuliny

IZOLACJA PRODUKTU

IZOLACJA PRODUKTU

Odwirowanie wodnego

Odwirowanie wodnego

roztworu pożywki

roztworu pożywki

Dezintegracja komórki przez nadtrawienie

Dezintegracja komórki przez nadtrawienie

ścianek komórkowych i działanie wysokiego

ścianek komórkowych i działanie wysokiego

ciśnienia

ciśnienia

Oddzielenie zdezintegrowanej biomasy

Oddzielenie zdezintegrowanej biomasy

Ciałka inkluzyjne wraz z wytworzonym

Ciałka inkluzyjne wraz z wytworzonym

białkiem pozostają w roztworze

białkiem pozostają w roztworze

WIROWANIE

WIROWANIE



Wirówka ślimakowa

Wirówka ślimakowa

n = 1500 - 6000

n = 1500 - 6000

obr/min

obr/min

η

η

= 0,4 – 60 m

= 0,4 – 60 m

3

3

/h

/h

zawiesiny o stężeniu

zawiesiny o stężeniu

2 - 50% obj.ciała

2 - 50% obj.ciała

stałego

stałego

CMI MODEL EBW-36
Wirówka ślimakowa

DEZINTEGRACJA

DEZINTEGRACJA

KOMÓREK

KOMÓREK

• Enzymatyczne
nadtrawienie
(lizozym, glukanazy,
mannazy,
glikozydazy, proteazy
+ EDTA)

• Szok osmotyczny

Niska agresywność

ODDZIELENIE

ODDZIELENIE

ZDEZINTEGROWNEJ

ZDEZINTEGROWNEJ

BIOMASY - -

BIOMASY - -

MIKROFILTRACJA

MIKROFILTRACJA

Schemat modułu membranowego płytowo-
ramowego

Zapewnia odseparowanie i zatrzymanie w
retentacie cząstek o średnicy większej od 0,1
μm

Permeat

Retentat

Nadawa

c

P

c

F

c

R

TRANSFORMACJA

TRANSFORMACJA

ENZYMATYCZNA

ENZYMATYCZNA

W wyniku reakcji powstaje cząsteczka insuliny identyczna z cząsteczką
insuliny wytworzonej przez trzustkę ludzką.

Odzysk surowej

Odzysk surowej

proinsuliny

proinsuliny



Reakcja oksydatywnej sulfitolizy białka fuzyjnego

Reakcja oksydatywnej sulfitolizy białka fuzyjnego



Przeprowadza się ją celem oddzielenia fragmentu

Przeprowadza się ją celem oddzielenia fragmentu

liderowego peptydu powstałęgo podczas sekrecji

liderowego peptydu powstałęgo podczas sekrecji



Pozwala to na łatwiejszą obróbkę i oczyszczanie białka

Pozwala to na łatwiejszą obróbkę i oczyszczanie białka



Sulfonowane białko nadaje się do przeprowadzenia

Sulfonowane białko nadaje się do przeprowadzenia

reakcji łączenia łańcuchów A i B.

reakcji łączenia łańcuchów A i B.



Przeprowadza się ją przy użyciu Na

Przeprowadza się ją przy użyciu Na

2

2

SO

SO

3

3

obecności Na

obecności Na

2

2

S

S

4

4

O

O

6

6

(Reszty Cys przeprowadza się

(Reszty Cys przeprowadza się

w SO

w SO

3

3

-

-

celem ułatwienia dalszej obróbki)

celem ułatwienia dalszej obróbki)



Czas reakcji – 2-3 [h] (t.p.) lub 40 [min] (37

Czas reakcji – 2-3 [h] (t.p.) lub 40 [min] (37

°

°

C)

C)

Oczyszczanie wstępne

Oczyszczanie wstępne

Sulfonowane białko fuzyjne jest oczyszczane w

Sulfonowane białko fuzyjne jest oczyszczane w

procesach:

procesach:

1)

1)

Elektroforezy SDS-PAGE

Elektroforezy SDS-PAGE

2)

2)

Chromatografii afinitywnej (rozpoznającej reszty

Chromatografii afinitywnej (rozpoznającej reszty

His)

His)

3)

3)

Chromatografii anionowej

Chromatografii anionowej

-

Zanieczyszczenia białkowe z komórek usuwane są

Zanieczyszczenia białkowe z komórek usuwane są

na kolumnie chelatującej Ni (Sepharose)

na kolumnie chelatującej Ni (Sepharose)

-

Wydajność wstępnego oczyszczania sięga 85-95%

Wydajność wstępnego oczyszczania sięga 85-95%

-

Dalsze oczyszczanie na kolumnie HPLC

Dalsze oczyszczanie na kolumnie HPLC

Enzymatyczna synteza

Enzymatyczna synteza

insuliny

insuliny



Cięcie proinsuliny przy użyciu:

Cięcie proinsuliny przy użyciu:



Trypsyny (EC 3.4.21.4)

Trypsyny (EC 3.4.21.4)



Karboksypeptydazy B (3.4.17.2)

Karboksypeptydazy B (3.4.17.2)



Karboksypeptydaza jest użyta w 10-

Karboksypeptydaza jest użyta w 10-

krotnym nadmiarze (w/w)

krotnym nadmiarze (w/w)



Warunki:

Warunki:



pH=8.8

pH=8.8



T=23

T=23

°

°

C

C



T=23 h

T=23 h

Synteza insuliny

Synteza insuliny



Reakcję przerywa się poprzez dodanie 0.1 N

Reakcję przerywa się poprzez dodanie 0.1 N

HCl

HCl



Uzyskaną insulinę oczyszcza się poprzez

Uzyskaną insulinę oczyszcza się poprzez



Chromatografię (MeCN:CF

Chromatografię (MeCN:CF

3

3

COOH)

COOH)



Elektroforezę

Elektroforezę



Czystość uzyskanej insuliny bada się poprzez:

Czystość uzyskanej insuliny bada się poprzez:



FAB-MS

FAB-MS



Analizę aminokwasów

Analizę aminokwasów

Gotowa insulina nadaje się do przeprowadzenia

Gotowa insulina nadaje się do przeprowadzenia

testów biologicznych i wprowadzenia do obrotu

testów biologicznych i wprowadzenia do obrotu

Literatura

Literatura



J. Fiedurek;

J. Fiedurek;

„Podstawy wybranych procesów

„Podstawy wybranych procesów

biotechnologicznych”

biotechnologicznych”

; Wydawnictwo UMCS;

; Wydawnictwo UMCS;

2004

2004



W. Bednarski, J. Fiedurek;

W. Bednarski, J. Fiedurek;

„Podstawy biotechnologii

„Podstawy biotechnologii

przemysłowej”

przemysłowej”

; WNT;

; WNT;

2007

2007



W.F. Heatj, R.M. Belagaje, G.S. Brooke, R.E. Chance, J.A.

W.F. Heatj, R.M. Belagaje, G.S. Brooke, R.E. Chance, J.A.

Hoffman, H.B. Long, S.G. Reams, C. Roundtree, W.N. Shaw, L.J.

Hoffman, H.B. Long, S.G. Reams, C. Roundtree, W.N. Shaw, L.J.

Slieker, K.L. Sundell, R.D. DiMarchi;

Slieker, K.L. Sundell, R.D. DiMarchi;

J. Biol. Chem

J. Biol. Chem

;

;

1992

1992

; 267;

; 267;

1; 419-425

1; 419-425



S. Jana, J.K. Deb;

S. Jana, J.K. Deb;

Appl. Microbiol. Biotechnol

Appl. Microbiol. Biotechnol

;

;

2005

2005

; 67; 289-298

; 67; 289-298



M. Schmidt, K.R. Babu, N. Khanna, S. Marten, U. Rinas;

M. Schmidt, K.R. Babu, N. Khanna, S. Marten, U. Rinas;

J.

J.

Biotechnol

Biotechnol

;

;

1999

1999

; 68; 71-83

; 68; 71-83



R.V. Tikhonov, S.E. Pechenov, I.A. Belacheu, S.A. Yakimov, V.E.

R.V. Tikhonov, S.E. Pechenov, I.A. Belacheu, S.A. Yakimov, V.E.

Klyushnichenko, E.F. Boldireva, V.G. Korobko, H. Tunes, J.E.

Klyushnichenko, E.F. Boldireva, V.G. Korobko, H. Tunes, J.E.

Thiemann, L. Vilela, A.N. Wulfson;

Thiemann, L. Vilela, A.N. Wulfson;

Protein Exp. Purificat;

Protein Exp. Purificat;

2001

2001

;

;

21; 176-182

21; 176-182



G. Walsh;

G. Walsh;

Appl. Microbiol. Biotechnol

Appl. Microbiol. Biotechnol

;

;

2005

2005

; 67; 151-159

; 67; 151-159

