Małgorzata Ligęza

ŁAŃCUCHOWA REAKCJA

POLIMERYZACJI- PCR

PCR (Polymerase Chain

Reaction)

• Metoda amplifikacji-powielania

łańcuchów DNA w warunkach
laboratoryjnych, polegająca na
sekwencji wielokrotnego
podgrzewania i oziębiania próbki.

• Technika została wynaleziona w 1983

roku przez Kary'ego Mullisa, za co
otrzymał w roku 1993 Nagrodę
Nobla.

Składniki mieszaniny

reakcyjnej

• matrycowy DNA
• trifosforany deoksyrybonukleozydów
• startery (primery)
krótkie (najczęściej ok. 20 nukleotydów) fragmenty

DNA

komplementarne do fragmentów matrycy, znajdujących
się na obu końcach interesującego nas genu
• Termostabilna polimeraza DNA
polimeraza Taq wyizolowana z bakterii Thermus

aquaticus

polimeraza Pfu z archeowców Pyrococcus furiosis

• Reakcję PCR przeprowadza się w bloku grzejnym,

który jest kontrolowany przez termocykler. Produkt
reakcji ocenia się przez elektroforezę i barwienie
bromkiem etydyny.

3 etapy reakcji PCR:

• Denaturacja dwuniciowego DNA
15-30s, 90-95

○

C

• Przyłączenie starterów
30-60s, 50-60

○

C

• Elongacja
różny czas trwania, 72

○

C

Wymienione etapy tworzą 1 cykl.

Etap I-

Denaturacja dwuniciowego DNA

• W wysokiej temperaturze pękają

wiązania wodorowe i podwójna
helisa DNA rozdziela się na dwa
pojedyncze łańcuchy.

• W celu uzyskania tego efektu

podnosi się temperaturę mieszaniny
reakcyjnej do wymaganych 95° na 15
sekund.

Etap II-

Przyłaczanie starterów

• Tworzą się odcinki dwuniciowe, składających

się z przygotowanych starterów
(oligonukleotydów hybrydyzujących z końcem
3` każdej nici,komplementarnych do sekwencji
DNA oskrzydlających gen mający ulec
namnożeniu) z matrycową cząsteczką DNA.

• Etap ten zachodzi w temperaturze niższej,

ściśle określonej dla danej pary starterów
(pomiędzy 45-60 °C).

Etap III-

Elongacja

• Właściwa synteza DNA i tym samym

amplifikacja pożądanego genu.

• Podwyższenie temperatury do około 72 °C

powoduje rozpoczęcie się syntezy nici
komplementarnej do matrycy.

• Pod koniec pierwszego cyklu otrzymujemy

dwie kopie DNA zawierające region, który
chcieliśmy zwielokrotnić.

• Proces powtarza się, zwykle

przeprowadza się od 20 do 40 cykli

• Ilość kopii DNA wzrasta wykładniczo
• Wydajność reakcji nie jest 100%-owa

(niespecyficzne produkty)

• Niespecyficzne produkty są związane

z powstawaniem lokalnych struktur
drugorzędowych lub niespecyficznym
łączeniu się starterów z matrycą

Eliminacja niespecyficznych

produktów

• Optymalizacja warunków
• Dodanie DMSO (dimetylosulfotlenek)

lub glicerolu

• Zastosowanie polimerazy TopoTaq
• Zastosowanie polimerazy typu hot

start

Odmiany reakcji PCR-

RT PCR Reverse Transcriptase PCR

• Synteza DNA na

matrycy
dojrzałego mRNA
przy pomocy
odwrotnej
transkryptazy.

• Dzięki temu

kopiowane są
tylko egzony.

Odwrotna transkryptaza – struktura
III-rzędowa

Odmiany reakcji PCR-

Real Time PCR

• Wprowadzenie do

środowiska reakcji
znakowanych
fluorescencyjnie
sond w celu
określenia ilości
matrycy użytej w
reakcji oraz
śledzenia ilości
powstającego
produktu.

Odmiany reakcji PCR-

Multiplex PCR

• Zastosowanie starterów dla różnych

genów lub odmiennych fragmentów
tego samego genu. Pozwala na
jednoczesne wykrywanie DNA kilku
patogenów. Szczególnie przydatny w
genetyce sądowej i kryminalistyce.

Zalety metody PCR

• Sekwencja badanego genu nie musi być

znana – wystarczy znajomość sekwencji
oskrzydlających

• Startery nie muszą być komplementarne do

matrycy w 100%

• Specyficzność – dobór odpowiednich

starterów pozwala na amplifikację
odpowiedniego odcinka

• Czułość – możliwe wykrycie nawet

pojedynczej cząsteczki DNA

Cechy badania:
• Analiza liczby kopii

wirusa/bakterii

• Możliwość śledzenia

postępów leczenia

Co można wykryć:
Wirus opryszczki
Entero- i parvowirusy
Cytomegalia
HIV

Badania PCR w medycynie

Badanie ilościowe Badanie

jakościowe

Cechy badania:

•Identyfikacja materiału
genetycznego wirusa/bakterii
a nie przeciwciał

•Identyfikacja możliwa na
wczesnym etapie zakażenia

Co można wykryć:

Wirus różyczki

 Wirus hepatitis B i C

 Bakteria Salmonella

 Bakteria Ureaplasma

Inne zastosowania PCR

• Ustalanie ojcostwa
• Kryminalistyka
• Ustalanie nosicielstwa zmutowanego

genu

• Antropologia
• Diagnostyka preimplantacyjna

Bibliografia:

• Podstawy genetyki dla studentów i

lekarzy, Gerard Drewa, Tomasz
Ferenc, Elsevier Urban & Partner,
Wrocław 2003, wyd. 2

• PCR wczoraj i dziś, czyli "stara

śpiewka" w nowej aranżacji, Wojciech
Bobela

• Źródła internetowe