3 kol. inż. gen.

wersja B

1. Ilosc kopii plazmidu pBR322 to 15-20; pUC – 500-700

3. Wektory ekspresyjne - silny, regulowany promotor rozpoznawany przez polimerazę RNA gospodarza; transkrypcja jest inicjowana wiele razy na minutę.

4. Kosmidy - wektory plazmidowe wyposażone w sekwencję cos faga lambda ich wielkość wynosi od 5 do 8 kpz co oznacza, że można do niego sklonować od 35-45 kpz.

6. Co dodaje ogonki homopolimerowe - terminalna transferaza (3') i fragment Klenowa polimerazy DNA I

8. Sposoby znakowania sond molekularnych: reakcja przesunięcia pęknięć w DNA (ang. nick translation), lub reakcja przypadkowego startu replikacji (ang. random priming)

9. Temperatura hybrydyzacji - 65-68ºC, ok. 1M NaCl lub 42ºC, ok. 1M NaCl + 50% formamid

11. Polimeraza do sekwencjonowania musi spełniac 3 warunki: Wysoka procesywność – zdolność syntezy odpowiednio długiego odcinka DNA i oddysocjowanie dopiero po włączeniu ddNTP.

Brak aktywności egzonukleazy 5’→3’ (lub nieznaczna taka aktywność) zdolność zastępowania istniejącego łańcucha DNA – zjawisko niekorzystne w sekwencjonowaniu, ponieważ usuwanie nukleotydów z końca 5’ nowosyntetyzowanego łańcucha skraca go uniemożliwiając odczytanie prawidłowej sekwencji z wzoru prążków po autoradiografii.

Brak aktywności egzonukleazy 3’→5’ (lub nieznaczna taka aktywność) aktywność korektorska – polimeraza pozbawiona tej aktywności nie usuwa wbudowanych ddNTP kończących łańcuch po ich włączeniu.

wersja A

1. Ilosć kopii plazmidów pUC na komórkę - 500-700

2. Wektory drożdżowe: np. YAC (YAC składa się z części prokariotycznej - plazmidowe ori i marker selekcyjny – oporność na antybiotyk i eukariotycznej, która zawiera: odcinek ori ARS, centromer CEN, telomery i geny selekcyjne (np. his3, trp1, ura3 – nie są to geny oporności na antybiotyk))

3. Wektory ekspresyjne wyposażone są w silny, regulowany promotor rozpoznawany przez polimerazę RNA gospodarza, który powoduje, że w specyficznych warunkach transkrypcja jest inicjowana wiele razy na minutę

4. Ligaza katalizuje tworzenie wiązań fosfodiestrowych

5. W metodach znakowania sond molekularnych:

• radioaktywnie - do sondy włączany jest nukleotyd znakowany radioaktywnym izotopem (32P, 35S).

• związkami fluorescencyjnymi (rodamina, kumaryna czy fluoresceina).

• immunochemicznie , cytochemicznie - do sondy włączany jest nukleotyd sprzężony z haptenem (biotyną, digoksygeniną).

6. W roztworach o niskim stężeniu soli kwasy nukleinowe hybrydyzują szybciej

7. Fosmidy zawierające M13 służą do otrzymywanie jednoniciowych kopii DNA

8. Insercja odcinka obcego DNA do sekwencji wektora uniemożliwa sekwencję peptydu zdolnego do

tworzenia aktywnej cząsteczki B-galaktozydazy. Barwa kolonii bakteryjnych to: bezbarwne.

9. Stan kompetencji to stan uwarunkowany genetycznie, umożliwiający transformację.

11. Pirosekwencjonowanie - Nie używa się ddNTP, w czasie reakcji rejestruje się kolejność wbudowywania nukleotydów w trakcie syntezy nowej nici. Wbudowanie nukleotydu rejestruje się jako błysk chemiluminescencji indukowany przez pirofosforan, który uwalnia się z dNTP.

Otwarte:

1. Opisz x-gal i ITPG.

X-gal sztuczny substrat dla beta-galaktozydazy

IPTG sztuczny induktor beta-galaktozydazy (tzw. bezinteresowny)

Wektor zawiera N-końcowy fragment beta-galaktozydazy (genu lacZ), wprowadza się go komórek, które syntetyzują tylko część C-końcową beta-galaktozydazy (niosących zmutowany geny lacZ). Obydwa peptydy mogą asocjować (alfa-komplementacja) tworząc aktywne enzymatycznie białko.

2. Omów metodę transformacji.

• Zdolność transformacji bakterii zależy od tzw. stanu kompetencji.

• Stan naturalnej kompetencji uwarunkowany jest genetycznie.

• W takiej transformacji najlepiej pobierany jest liniowy natywny ds DNA. Jedna nić ulega degradacji, druga rekombinacji do genomu gospodarza.

• Naturalną zdolność wchodzenia w stan kompetencji wykazują głównie bakterie Gramdodatnie (Streptococcus, Staphylococcus, Bacillus).

• Bakterie Gram-ujemne zwłaszcza te z rodziny Enterobacteriaceae (m.in. E. coli) podlegają tego typu transformacji ze znacznie mniejsza wydajnością.

3. Cykliczne sekwencjonowanie DNA.

• Opiera się na wykorzystaniu termostabilnej polimerazy Taq, a właściwie jej zmodyfikowanej wersji, w której Phe z centrum aktywnego zastąpiono Tyr, co znacznie zmniejszyło dyskryminację ddNTP przez polimerazę.

• Możliwość stosowania dsDNA jako matrycy, np. plazmidowe DNA – łatwość przygotowania matrycy

• Do reakcji wystarcza bardzo mała ilość DNA co oznacza, że nie jest obligatoryjne konieczne sklonowania odcinka DNA przed sekwencjonowaniem, wystarczy np. produkt innej reakcji PCR

• Reakcja cyklicznego sekwencjonowania przebiega podobnie do reakcji PCR, ale wykorzystuje się w niej tylko jeden starter – syntetyzowana jest tylko jedna nić używanej cząsteczki matrycowego dsDNA

• Produkt reakcji akumuluje się liniowo a nie wykładniczo jak w normalnym PCR

• Otrzymaną pulę nici analizuje się albo przez elektroforezę w żelu poliakrylamidowym albo elektroforezę kapilarną

• Przełomem i krokiem w stronę automatyzacji procesu sekwencjonowania było zastosowanie do znakowania ddNTP barwników fluorescencyjnych. Każdy z ddNTP wyznakowany jest innym fluoroforem, co umożliwia prowadzenie reakcji w jednej próbówce

• 1 matryca = 1 reakcja

4. Chemiczna degradacja bakteryjna w transformacji.

Metoda chemicznej degradacji DNA – w metodzie cząsteczki DNA zakończone określonym nukleotydem otrzymuje się przez działanie odczynnikami tnącymi nić DNA specyficznie w miejscu określonego nukloetydu. Wyjściowym materiałem jest dsDNA, które przed rozpoczęciem degradacji znakuje się na końcu 5’. Uzyskujemy pulę cząsteczek z wyznakowaną zawsze tą samą nicią. Dodaje się ograniczoną ilość siarczanu dimetylu, tak że w poszczególnych cząsteczkach metylowana jest losowo tylko jedna G – DNA jest ciągle nienaruszone. Dodaje się piperydyny – usunięcie zmetylowanego pierścienia G i przecina ssDNA przed miejscem pozbawionym zasady azotowej. Uzyskuje się pulę cząsteczek, wyznakownych na końcu 5’ a różniących się długością na końcu 3’

• Produkty degradacji poddaje się elektroforezie w żelu poliakrylamidowym

• Ponieważ są one wyznakowane radioaktywnie przeprowadza się autoradiografię w celu ich wizualizacji.

5. Od czego zalezy wydajność transformacji bakterii metoda chemiczna:

1. Szczep biorcy powinien być bezplazmidowy (wrażliwy na antybiotyki), mieć nieaktywny system restrykcyjny (Res-) zapobiega degradacji obcego DNA oraz system rekombinacji (RecA-) co zapewnia stabilność wprowadzanych plazmidów w komórce (ważne np. przy klonowaniu genów chromosomalnych. Takie cechy mają np. szczepy E. coli DH5-alfa i XL1-Blue rekomendowane jako biorcy w transformacji

2. DNA plazmidowy powinien być oczyszczony – nadmiar soli, enzymów restrykcyjnych, resztek fenolu, obniża lub hamuje wydajność transformacji

3. Najbardziej efektywną formą transformacji jest forma ccc DNA plazmidu, transformacja formą liniową jest mało wydajna i stosowana tylko w szczególnych wypadkach

4. Wydajność transformacji zależy od wielkości cząsteczki plazmidu, duże cząsteczki transformują się trudniej.

5. Nadmiar DNA nie wpływa na wzrost wydajności, optymalna ilość dla E. coli powinna wynosić od 20-200 ng na reakcję.

6. Komórki kompetentne są bardzo wrażliwe i należy się z nimi obchodzić bardzo delikatnie, zwłaszcza podczas wirowania, mieszania z DNA. Wszystkie etapy preparatyki należy przeprowadzać w lodzie.

6. Wektory wahadłowe (bifunkcjonalne) mają:

• dwa odrębne miejsca startu replikacji (jedno z nich uruchamiane jest w eukariotycznych komórkach - drożdży, drugie w komórkach prokariotycznych E. coli)

• dwa typy markerów selekcyjnych: dla komórek drożdżowych jak i bakteryjnych

• umożliwia to wygodne utrzymywanie wektora w komórkach bakteryjnych oraz np. ekspresję sklonowanych genów w drożdżach

7. MCS, co to jest i po co sie używa

MCS (multiple cloning site – miejsce wielokrotnego klonowania tzw. polilinker) - krótki odcinek DNA zawierający wiele miejsc rozpoznawanych przez różne enzymy restrykcyjne. Pozwala na swobodny dobór odpowiedniego do klonowania enzymu.

8. Metody umieszczania DNA w komórkach

1. Transformacja

Zjawisko transformacji – czyli pobierania nagiego DNA z podłoża do komórek wykazano po raz pierwszy w bakteriach G+ Streptococcus pneumoniae (a potem także w Pneumonococcus czy Diplococcus) - Fred Griffiths 1928.

2. Elektrotransformacja (elektroporacja)

Istotą metody jest przepuszczenie przez zawiesinę komórek krótkiego (5-10 msek) puls prądu o bardzo wysokim napięciu (1250-2500 V). Prowadzi do powstawania porów (wielkość do 2 nm) w błonie (impuls elektryczny przejściowo i odwracalnie przerywa ciągłość błony), przez które do komórek może wnikać DNA. Można uzyskać bardzo wysoką wydajność transformacji oraz można wprowadzać bardzo duże cząsteczki DNA.

3. Koniugacja

Naturalny sposób wymiany DNA pomiędzy bakteriami. Umożliwia rekombinację genetyczną.