2014-01-30
Cząsteczki CD - Cluster of Differentiation
Układ odpornościowy funkcjonuje dzięki leukocytom, które oddziałują z:
innymi leukocytami
Metody oznaczania markerów
innymi komórkami układu odpornościowego i nie tylko
powierzchniowych komórek krwi
czynnikami zakaz
nymi / antygenami itp&
obwodowej
Oddziaływania o których mowa są mediowane przez cząsteczki znajdujące się na
powierzchni leukocytów (glikoproteiny, glikolipidy)
 podstawy cytometrii przepływowej
Ab przeciw tym cząsteczką dostarczają niezbędnych narzędzi do analizy ich
struktury, funkcji, rozmieszczenia.
Zakład Mikrobiologii i Laboratoryjnej Immunologii Medycznej
Uniwersytet Medyczny w A
odzi
Oznaczanie markerów powierzchniowych komórek krwi obwodowej jest
możliwe dzięki zastosowaniu przeciwciał monoklonalnych (mAb)
Cząsteczki CD - Cluster of Differentiation
skierowanych przeciwko obecnym na komórkach Ag różnicowania,
CD (cluster of differentiation).
Warsztaty HLDA (Human Leukocyte Differentiation Antigens Workshop)
-Zainicjowane aby wnieść porządek w chaos, który zaistniał w latach 80`-tych
- immunolodzy utworzyli ogromną liczbę mAb reagujących z receptorami
powierzchniowymi komórek (Ab i Ag miały odrębny nazwy)
- przy braku badań porównawczych niemożliwe było stwierdzenie czy dana
cząsteczka nie jest rozpoznawana przez więcej niż jedno Ab.
- warsztaty HLDA wysłały  zakodowane Ab do różnych laboratoriów, aby
przeanalizowały Ag powierzchniowe wielu różnych komórek
- zebrane dane przeanalizowano stosując metodę  cluster analysis
- metoda identyfikuje grupy (clusters) Ab o bardzo podobnej swoistości
wiązania Ag leukocytów na ich różnych etapach różnicowania
(differentiation)  cluster of differentiation  CD
Nomenklatura cząsteczek CD:
- dostarcza niezbędnej klasyfikacji na potrzeby diagnostyczne i terapeutyczne
Przeciwciała monoklonalne - skierowane przeciwko jednej determinancie
antygenowej (determinanta=epitop, miejsce wiązania Ag z Ab) Komórka macierzysta
Schemat przeciwciała:
1. fragment wiążący antygen
2. region Fab
3. region Fc
niebieskie - łańcuchy ciężkie
Granulocyt Monocyt Limfocyt T Limfocyt B trombocyt
żółte - łańcuchy lekkie
ciemnoniebieskie/żółte - regiony zmienne
jasnoniebieskie/żółte - regiony stałe
szare - mostki dwusiarczkowe
Produkcja przeciwciał monoklonalnych (mAb), umożliwiła wprowadzenie
Limfocyt Tc
znacznie dokładniejszych technik laboratoryjnych tj. IF, EIA, cytometria
Limfocyt Th
przepływowa.
j& Metody jakościowe - pozwalające określić miejsce wiązania Ag z Ab w
komórce
j& Metody ilościowe  pozwalające na określenie liczby komórek posiadających
Aktywowany limfocyt T
dany Ag w postaci odsetka lub w wartościach bezwzględnych
1
2014-01-30
SUBPOPULACJE KOMÓREK
POPULACJE i SUBPOPULACJE KOMÓREK
JEDNOJ
DROWYCH KRWI OBWODOWEJ
 JEDNOJ
DROWYCH KRWI OBWODOWEJ
KOMÓRKI NATURAL KILLER (NK)
MONOCYTY
�mAb: CD14+
�mAb: CD3-CD56+CD16+
�stanowią 2-4% wszystkich leukocytów
�posiadają właściwości cytotoksyczne
�mają zdolność do ruchu pełzakowatego i mogą wydostawać się
�ważne w odporności przeciw komórkom nowotworowym oraz
ze światła naczyń krwionośnych
komórkom zarażonym przez wirusy
�po przejściu do tkanek dojrzewają i przekształcają się w M�
�działają nieswoiście (wykazują właściwości cytotoksyczne bez
�komórki żerne żyjące około 4 dni
wcześniejszej immunizacji)
Metody oznaczania markerów
POPULACJE I SUBPOPULACJE KOMÓREK
powierzchniowych komórek krwi obwodowej
 JEDNOJ
DROWYCH KRWI OBWODOWEJ
LIMFOCYTY B
Testy rozetowe
�mAb: CD3-/CD19+
�postają i dojrzewają w szpiku
�bardzo dużo limfocytów B występuje w czasie infekcji
Metody immunofluorescencyjne
bakteryjnych
�wiążą Ag za pomocą receptora BCR, następnie przetwarzają go i
 wystawiają na powierzchnię komórki w postaci kompleksu z
białkami MHC.
�Mikroskopia fluorescencyjna
�Kompleks ten jest rozpoznawany przez swoisty względem
danego antygenu limfocyt T pomocniczy.
�Wtedy dochodzi do transformacji blastycznej i powstania
�Cytometria przepływowa
komórki plazmatycznej produkującej Ab. Ag, które powodują
taki typ reakcji nazywamy antygenami grasiczozależnymi.
�W odróżnieniu od nich, antygeny grasiczoniezależne nie
wymagają obecności limfocytów T pomocniczych i mogą
bezpośrednio aktywować limfocyty B.
POPULACJE I SUBPOPULACJE KOMÓREK
CYTOMETRIA PRZEPA
YWOWA
 JEDNOJ
DROWYCH KRWI OBWODOWEJ
LIMFOCYTY T
FACS (Fluorescence Activating Cell Sorting)
�T pomocnicze - T helper (Th):
rozszerzona metoda cytometrii przepływowej, w której
'#mAb: CD3+CD4+
'#wspomagają odpowiedz
immunologiczną poprzez wydzielanie
oprócz pomiarów komórek są stosowane również
mediatorów regulujących funkcje układu odpornościowego
(cytokin) lub poprzez bezpośredni kontakt z innymi
urządzenia sortujące.
komórkami
'#subpopulacje komórek Th:, Th1 i Th2, Th17 + limfocyty
regulatorowe Treg, Tr1, Th3
'#konwencjonalne CD25- vs supresorowe CD25+
Odgrywa zasadniczą rolę w fenotypowaniu komórek
'#pamięci CD45 RO vs dziewicze CD45 RA
immunokompetentnych człowieka.
�T cytotoksyczne (Tc):
'#mAb: CD3+CD8+
Ocena subpopulacji komórek tą techniką jest obiektywną i
'#są odpowiedzialne za reakcje cytotoksyczne
powtarzalną metodą diagnostyczną.
2
2014-01-30
CYTOMETRIA PRZEPA
YWOWA
Układ transportu cieczy
Analiza wieloparametrowa
Zadaniem układu powietrznego jest wytworzenie różnicowego
jednej komórki w aparacie,
ciśnienia w zbiorniku z cieczą ogniskującą i w probówce z
w momencie gdy ruch
zawiesiną komórek;
komórek w cieczy jest
uporządkowany
Układ transportu cieczy doprowadza ciecz ogniskującą do
odpowiednio ukształtowanej dyszy pomiarowej, do której
�komórki się nie zlepią,
również powoli wstrzykiwana jest próbka na zasadzie
będą oddzielne w słupie ogniskowania hydrodynamicznego, komórki są formowane w
cienki strumień, który podąża w kierunku wiązki laserowej.
�na pojedynczą komórkę
Po pomiarze komórki i ciecz otaczająca przemieszczane są do
pada laser w komorze
pojemnika zbierającego odpadki; stabilność tego układu
pomiarowej
decyduje o jakości pomiaru
Zasada działania
Budowa cytometru
(UKA
AD OPTYCZNY)
cytometru przepływowego
układ optyki
na układ optyki składa się z
ródło światła  laser, układ kształtujący i ogniskujący
wiązkę laserową na komórce oraz optyka zbierająca, której zadaniem jest
Znakowane komórki są pompowane pod niewielkim ciśnieniem
odfiltrowanie poszczególnych długości fal oraz zogniskowanie promieni świetlnych
do strefy pomiaru, gdzie są naświetlane dokładnie zogniskowaną
na fotokatodzie detektorów
wiązką laserową;
z
ródła światła
z
ródłem światła wzbudzającego jest laser, który emituje światło spójne,
Komórki rozpraszają światło i jednocześnie światło lasera wzbudza
monochromatyczne, przeważnie spolaryzowane pionowo, o małej średnicy
fluorochromy przyłączone do komórki w procesie  znakowania .
wiązki i o odpowiednim natężeniu.
Mierzone jest natężenie światła za pomocą odpowiednich
W zależności od potrzeb używamy laserów emitujących światło o różnych
detektorów. Powstałe tam sygnały elektryczne są wzmacniane,
długościach fal  od UV poprzez światło niebieskie, zielono-żółte do czerwonego;
najczęściej w cytometrii używa się laserów argonowych, kryptonowych lub
formowane i przesyłane do komputera celem dalszej obróbki,
wykorzystujących mieszaniny gazowe (Ar-Ne, He-Ne)
przechowywania i analizy.
filtry
aby umożliwić jednoczasowy pomiar w dwóch lub trzech kolorach stosujemy filtry
przepuszczające tylko pożądane długości fal pozwalające na uzyskiwanie
szerokiego widma fluorescencyjnego
Budowa cytometru (układ optyczny)
BUDOWA CYTOMETRU
Filtry dzielimy na:
układ transportu cieczy:
powiązany z układem powietrznym (TUBA Z PRZEPA
YWEM
interferencyjne, których działanie polega na tym, ze światło na takim
LAMINARNYM PRÓBKI)
filtrze ulega interferencji tzn. pewne długości fal są wzmacniane, inne
wytłumiane; potrafią bardzo precyzyjnie przepuścić żądaną długość fali
np. 525,5 nm; należą do grupy filtrów pasmowych (band pass)
układ optyczny:
�z
ródło światła: laser argonowy, lampa rtęciowa
W cytometrii używa się także zwierciadeł dichroicznych,
�detektory: diody, fotopowielacze
ustawionych pod katem 45� do wiązki światła  pewien zakres widma
�lustra, filtry przepuszczające promienie światła tylko o
ulega odbiciu, reszta jest przepuszczana
określonej długości
absorbcyjne, wykonane ze szkła napylonego warstwą materiału
układ elektroniki:
pochłaniającego pewien zakres widma, a przepuszczające pozostały;
używane w cp. jako filtry odcinające  przepuszczające światło do lub od
wzmacniacze, przetwornik analogowo- cyfrowy, system
pewnej długości fali
komputerowy do przechowywania i obróbki danych
3
2014-01-30
UKA
AD ELEKTRONIKI
MIERZONE PARAMETRY
- detektorów i obróbki obrazu
Impulsy świetlne generowane przez fluorochromy ulegają konwersji na
sygnał napięciowy który możemy precyzyjnie zmierzyć Podstawowym pomiarem jest rejestrowanie światła
rozproszonego na komórce oraz światła wysyłanego
Wybór odpowiednich detektorów pozwala na uwidocznienie sygnału z
przez wzbudzony fluorochrom.
wybranego fluorochromu
Zmieniając napięcie na fotopowielaczach i fotodiodach ustawiamy próg Detektory mierzą światło rozproszone.
detekcji dla poszczególnych fluorochromów i morfologii komórki
Fotodiody  detekcja rozproszenie światła białego do przodu (forward
scatter) Fotopowielacze  detekcja fluorescencji i bocznego rozproszenia
światła białego (side scatter)
Kompensacja kolorów. Sygnał z fluorescencji po opuszczeniu
przedwzmacniacza przechodzi przez układy kompensacji kolorów, gdyż
część widma emisji z różnych fluorochromów nakładają się
Materiał do badań
Analiza danych  cz. 1
Etap I. Analiza wstępna  ma na celu wybór komórek do
Niemal z każdego materiału biologicznego można przeprowadzić analizę:
dalszej analizy zarejestrowanych fluorochromów. Analizę
Komórek głównie z krwi obwodowej i szpiku kostnego
wstępną prowadzi się w oparciu o cechy morfologiczne
Komórek wyizolowanych z węzłów chłonnych, guzów nowotworowych,
komórki (wielkości i  gęstości )
płynów jam ustrojowych, płynu mózgowo-rdzeniowego, popłuczyn
Analiza wstępna opiera się o pomiar światła rozproszonego na komórce
pęcherzykowo-oskrzelikowych
światło rozproszone mierzą dwa detektory:
1. rejestruje rozproszenie do przodu (zgodnie z kierunkiem wiązki
laserowej) w niewielki kąt (<10�)  FSC (Forward Scatter)
Pojedyncze komórki, metody izolacji!!!
2. rejestruje rozproszenie pod kątem 90� - SSC (Side Scatter)
Żywe, niezamrożone komórki
Analizując komórki w przestrzeni dwuwymiarowej w układzie FSC vs. SSC
możemy je różnicować:
Ograniczony czas na wykonanie analizy
FSC  rozdziela komórki ze względu na wielkość
SSC  ze względu na ich gęstość i wewnętrzne ziarnistości
Warunki pobrania materiału, antykoagulant, czas
FSC
Przedni detektor (forward scatter)- pomiar światła
Ocena jakościowa Ocena ilościowa
rozproszonego, mierzonego w przedłużeniu promienia
intensywność fluorescencji; pozwala odsetek wszystkich analizowanych
lasera, światło pada prawie pod katem 0p - charakteryzuje
na uzyskanie informacji o gęstości limfocytów lub odsetek wśród
wielkość komórki
receptora na powierzchni komórki wybranej populacji limfocytów przy
barwieniu dwubarwnym
laser
laser
laser
laser
detektor
detektor
detektor
detektor
Ocena nawet bardzo heterogennej populacji;
przedni
przedni
przedni
przedni
- wykrywanie zaburzeń ilościowych i jakościowych
- populacji patologicznych
4
2014-01-30
Analiza szczegółowa
SSC
- różne typy wykresów
Boczny detektor (side scatter)- pomiar światła
wykresy jednowymiarowe
rozproszonego, mierzone pod kątem 90p - pozwala na analizę
ziarnistości komórki
histogramy
ocena intensywności florescencji
laser  ang. MFI Mean Fluorescent Intensity
laser
laser
laser
również odsetek komórek o określonym
zakresie MFI
detektor
detektor
detektor
detektor
przedni
przedni
przedni
przedni
CD14 PE
detektor boczny
detektor boczny
detektor boczny
detektor boczny
Analiza szczegółowa
Analiza danych cz. 2
- różne typy wykresów
Etap II - analiza szczegółowa oparta o rejestr
wykresy dwuwymiarowe:
światła wysyłanego przez wzbudzone
" wykres kropkowy (dot plot)
fluorochromy
" wykres gęstości (density plot)
Oprócz parametrów opisujących rozproszenie światła istotnym pomiarem jest
" wykres konturowy (contour plot)
ocena intensywności fluorescencji; dla jednowiązkowego systemu
wzbudzania używa się trzech detektorów: FL1, FL2, FL3. Gdy dysponujemy
drugą wiązką (drugi laser) możemy użyć dodatkowego detektora: FL4 i
FL5.
UWAGA: FL1, FL2, FL3& w codziennej praktyce symbole te określamy jako
 kanały i mówią nam jakie fluorochromy możemy w nich rejestrować np.:
FL-1 rejestruje FITC, Alexa Fluor 488, 123 DHR
FL-2 rejestruje PE, jodek propidyny
FL-3 rejestruje PerCP, &
FL-4 rejestruje APC, &
wykresy trójwymiarowe
(perspektywiczny):
Schematyczny rozkład leukocytów na cytogramie
Wieloparametrowa analiza pojedynczej komórki!!!
FFC/SSC
Wyznakowane
fluorochromem mAb
Zawiesina
pojedynczych
komórek!!!
Badanie Ag wewnątrzkomórkowych jest
FL1 (FITC)
trudniejsze, wymaga skomplikowanych Znakowanie
metod DNA - PI
5
FL2 (PE)
2014-01-30
Do identyfikacji zaburzeń składu podstawowych
KONTROLA NEGATYWNA
populacji komórek stosuje się zestawy mAb
(dyskryminator)
(ocena subpopulacji)
Prawidłowa kontrola negatywna gdy ~ 98% komórek w próbie nie
- Kontrola izotypowa - IgG1-FITC / IgG2 - PRE
wykazuje wysokiej fluorescencji dla zastosowanych mAb
- Anty-CD45 FITC / Anty-CD14 PRE
- Anty-CD2 FITC / Anty-CD19 PRE
Autofluorescencja (baseline)
- Anty-CD3 FITC / Anty-CD4 PRE
- Anty-CD3 FITC / Anty-CD8 PRE
Przykłady mAb dla kontroli negatywnych:
-Anty-CD16 FITC / Anty-CD56 PRE / Anti-CD3 APC
�IgG1, IgG2a, IgG2b, IgM
Stosowane mAb nie mogą reagować swoiście z ludzkimi Ag
!!!Zmienne wartości leukocytów i limfocytów:
powierzchniowymi leukocytów (cząsteczkami CD)
- okres noworodkowy
- okres niemowlęcy
- wpływ czynników tj. leki, używki, wysiłek fizyczny, posiłek, rytm dnia, itp..
Jak odróżnić limfocyty od innych komórek?
Zakres wartości prawidłowych markerów komórek
limfocyty: najwyższa gęstość CD45; brak
jednojądrowych krwi obwodowej człowieka
CD14
granulocyty: mniej CD45 na komórkach;
średnia ekspresja CD14
monocyty: wysoka gęstość CD45;
wysoka CD14
nieleukocyty: erytrocyty, płytki krwi
CD45 (-) i CD14(-)
CD4 występuje na limfocytach i
monocytach!
Wybramkowane limfocyty = suma %
kom. NK, limfocytów T i B.
Eozynofile  umiejscawiają się najczęściej w górnym biegunie regionu neutrofilów
Bazofile  można znalez
ć w obrębie regionu charakterystycznego dla limfocytów
Charakterystyczne markery dla poszczególnych
PRZYDATNOŚĆ DIAGNOSTYCZNA CYTOMETRII
subpopulacji leukocytów
PRZEPA
YWOWEJ
Diagnostyka zaburzeń immunologicznych
Podstawowe markery i cechy fenotypowe linii komórkowych
Diagnostyka chorób limfoproliferacyjnych
Ocena immunomorfologiczna limfocytów
CD45 - marker wszystkich leukocytów
�monitorowanie stanu ukł. immunologicznego:
CD19, CD20 - markery limfocytów B
'#chorych z wirusem HIV,
CD3, CD7 - markery limfocytów T
'#leczenia immunosupresyjnego
CD4 - marker limfocytów T pomocniczych
'#chorób autoimmunizacyjnych:
CD8 - marker limfocytów T supresorowych
-zaburzenia w aktywacji komórek np. wzrost ekspresji odsetka komórek T (RZS,
CD56 - marker komórek NK
zapalenie tęczówki, cukrzyca t.I)
CD71, CD69 - markery aktywacji limfocytów
-zmiany w zakresie odsetka różnych subpopulacji: wzrost ekspresji komórek T z
antygenami komórek NK CD57, zmniejszony odsetek komórek CD8+CD29+ u
CD13, CD33 - markery różnicowania mieloidalnego
chorych ze sklerodermią, zmniejszona liczba komórek CD4+  inducer w zespole
CD25high - marker limfoctów Treg (grasiczych i indukowanych Sjogrena.
na obwodzie)
'#chorych przed i po przeszczepach:
CD15 - marker granulocytów (wysoka ekspresja)
-określanie w szpiku przygotowanym do przeszczepu komórek prekursorowych
CD34+;
CD14 - marker monocytów
-do udanej transplantacji szpiku potrzeba ok. 5x105 komórek CD34+/kg
CD34 - podstawowy marker komórek progenitorowych m.ciała;
-ocena cytometryczna komórek CD34+ u chorych po przeszczepie szpiku
(macierzystych)
daje możliwość oceny reimplantacji
'#leczenia immunosupresyjnego
6
2014-01-30
ZASTOSOWANIE CYTOMETRII PRZEPA
YWOWEJ W
DIAGNOSTYCE I MONITOROWANIU PIERWOTNYCH I
OCENA FENOTYPÓW KOMÓREK
WTÓRNYCH NIEDOBORÓW ODPORNOŚCI
UKA
ADU ODPORNOŚCIOWEGO
Niedobory odporności wrodzone, pierwotne IMMUNOFENOTYPOWANIE LIMFOCYTÓW
CP stanowi jeden z elementów badania układu odpornościowego i rzadko stanowi niezbędne w monitorowaniu:
kryterium jego rozpoznania; cechy fenotypowe dotyczą zmian ilościowych i
jakościowych:
- wrodzonych zaburzeń odpowiedzi humoralnej, związanych z
* SCID (sever combined immunodeficiency - ciężki złożony niedobór niedoborem limfocytów B: określa się liczbę komórek cechujących
odporności), w którym poza znacznymi niedoborami przeciwciał stwierdza się
się występowaniem markerów CD19/CD20, będących wykładnikiem
znaczne zmniejszenie we krwi obwodowej liczby komórek T i B; obecne są
tej populacji
jedynie komórki B lub na komórkach tych brak jest cząsteczek MHC klasy II;
* CVID (common variable immunodeficiency  pospolity, zmienny
np. u chorych z agammaglobulinemią sprzężoną z chromosomem X
niedobór odporności)
- zwykle nie stwierdza się znacznych zaburzeń liczby limfocytów T i B;
- wśród limfocytów T obserwuje się znaczny spadek liczby komórek
CD4+CD45RA+ (Dziewicze limfocyty pomocnicze)
W składzie limfocytów we krwi brak
- niewielki spadek komórek B CD19+, u których obserwuje się obniżenie
wydzielania IgM i IgG;
przesunięcia np. w ziarnicy złośliwej a są
widoczne zmiany w ilościowe w śledzionie.
* Zespół Di George a - zmniejszenie liczby, dojrzałości i zaburzenia funkcji
limfocytów T;
IMMUNOFENOTYPOWANIE LIMFOCYTÓW
OCENIANE PARAMETRY
niezbędne w monitorowaniu:
Wtórnych (nabytych) niedoborów STRUKTURALNE
FUNKCJONALNE
odporności
rozmiar
ładunek powierzchniowy
*AIDS  określenie subpopulacji CD4+
LIMFOCYTY
kształt
w wartościach bezwzględnych
ekspresja receptorów
CD4+CD8+
(kom/mm3)
cytoplazmatyczna ziarnistość
powierzchniowych
oraz wskaz
nik CD4/CD8 jest
C
wyznacznikiem klinicznej manifestacji
zawartość barwnika np.: hemoglobina,
integralność błony (żywotność)
choroby i monitorowania efektów
D
barwniki fotosyntetyczne, porfiryny
leczenia
aktywność endocytarna
LIMFOCYTY CD4-
4
aminokwasy fluoryzujące w białkach
CD8+
organizacja cytoszkieletu
np.: tryptofan, tyrozyna
aktywność enzymów
zawartość DNA, RNA, wszystkich
Osoba zdrowa 44%/27% = 1,63
białek, lipidów, cukrów
CD8
powierzchniowych, antygenów
Pacjent z pełnoobjawowym niedoborem
odporności 7,7%/54% = 0,14
CYTOMETRIA PRZEPA
YWOWA
IMMUNOFENOTYPOWANIE LIMFOCYTÓW
Zalety cytometrii:
" Ocena limfocytów T (CD3) oraz ich subpopulacji CD4, CD8
- szybki, obiektywny i zautomatyzowany pomiar pojedynczych
komórek w dużych populacjach komórkowych, z dużą
" Ocena ekspresji na powierzchni limfocytów Ag MHC klasy II
powtarzalnością
(niedobór)
- wykrywanie śladowych subpopulacji
- równoległa ocena kilku parametrów
" Ocena receptora TCR lub jego składowych (niedobory łańcuchów
- ilościowa i jakościowa ocena stanu układu immunologicznego,
ł i �, zaburzenia transdukcji sygnału)
poszczególnych populacji
" Ocena innych struktur, których brak charakterystyczny jest dla
Wady:
różnych zespołów chorobowych, np.:
- niedobór sialoglikoproteiny CD43 w zespole Wiskotta Aldricha - niemożność korelacji wyników pomiarów fluorescencji z morfologią
- brak CD40L w zespole hiper IgM komórek
- technika przygotowania materiału do badań, wymagająca izolacji z
tkanki pojedynczych komórek
- wysoki koszt badań
7