Wykrywanie drobnoustrojów chorobotwórczych w wodzie
Mimo występowania różnego rodzaju mikroorganizmów chorobotwórczych w wodzie, wykrycie ich w tym środowisku nawet podczas trwającej epidemii nie jest łatwe i rzadko praktykowane, zwłaszcza jako badanie rutynowe. Przyczyną tego jest głównie bardzo mała liczba tych drobnoustrojów w wodzie w momencie jej badania. Jak już wiadomo, drobnoustroje chorobotwórcze w zasadzie nie rozmnażają się w wodzie, a ilość ich ulega redukcji w stopniu, który zależy od gatunku zarazka, jak i warunków środowiska. Choć dane o długości życia w wodzie mikroorganizmów chorobotwórczych przytaczane przez różnych autorów są sprzeczne, na ogół wszyscy potwierdzają zjawisko, że największy procent redukcji (około 90%) ich liczebności zaznacza się w pierwszych godzinach czy dniach. Biorąc pod uwagę, że okres inkubacji choroby zakaźnej dość często trwa kilka czy więcej dni, w momencie podejrzenia wody jako drogi zakażenia ? drobnoustroje chorobotwórcze mogą już wyginąć zupełnie lub znajdować się w tak małej ilości, że wykrycie ich wymaga specjalnych metod. W metodach tych istotne znaczenie ma zagęszczenie próbki, jak i zastosowanie właściwych podłoży namnażających oraz różnicująco-wybiórczych. Pewnych drobnoustrojów (np. wirusów) nie udaje się hodować na podłożach sztucznych, a zakażenie hodowli tkankowych lub zwierząt doświadczalnych nie zawsze jest skuteczne, jeśli w próbce liczba drobnoustrojów jest bardzo mała. Należy podkreślić, że metody używane do wykrywania chorobotwórczych mikroorganizmów w wodzie są w większości jakościowe lub pół- ilościowe; wyjątek stanowi zastosowanie filtrów membranowych do bezpośredniego hodowania zagęszczonych na nich bakterii z wody na odpowiednich podłożach. Stosunkowo najlepiej opracowane i w miarę proste są metody izolowania z wody pałeczek Salmonella oraz przecinkowców cholery. Sanitarno-higieniczna kontrola wody Stwierdzenie, że woda do picia może odgrywać istotną rolę w przenoszeniu chorób zakaźnych oraz brak odpowiednich metod izolowania zarazków z wody, skłonił od dawna higienistów i bakteriologów do znalezienia pośredniego sposobu wskazującego na obecność drobnoustrojów chorobotwórczych, dostających się do wody z wydalinami ludzkimi czy nawet zwierzęcymi, głównie za pośrednictwem ścieków bytowo-gospodarczych. Jak wykazały badania, w kale lub ściekach bytowych drobnoustrojom chorobotwórczym towarzyszą zawsze drobnoustroje stanowiące normalną florę jelitową ludzi i zwierząt.
Zadania mikrobiologicznej kontroli żywności
Jesteśmy obecnie świadkami poważnych przemian w sposobie odżywiania się szerokich rzesz ludności. Jest to wynikiem działania wielu czynników, wśród których najważniejszymi są: industrializacja i rozwój miast oraz powszechna praca zawodowa kobiet. Powstają i rozszerzają się różne formy żywienia zbiorowego: stołówki szkolne, pracownicze, kuchnie centralne, mniej lub bardziej zautomatyzowane bary szybkiej obsługi itp. Przemysł spożywczy również przeżywa okres dynamicznego rozwoju. Zmieniają się metody technologiczne, wzrasta produkcja koncentratów, mrożonek, gotowych wyrobów garmażeryjnych, półtrwałych produktów porcjowanych. W toku produkcji wprowadza się do żywności dodatki mające na celu zwiększenie trwałości lub atrakcyjności gotowych wyrobów albo ułatwienie pożądanych przemian. Można tu wymienić chemiczne środki konserwujące, antybiotyki, przeciwutleniacze, środki wybielające, aromaty, preparaty enzymatyczne. Tradycyjne metody utrwalania żywności zastępuje się przez nowe, nie zawsze dokładnie sprawdzone. Przykładem może być zastosowanie promieni jonizujących do wyjaławiania żywności. Również tradycyjne metody fermentacyjne, prowadzone w oparciu o naturalną mikroflorę produktów lub stosowanie czystych kultur są coraz częściej zastępowane użyciem preparatów enzymatycznych, wyprodukowanych przez wybrane drobnoustroje (patrz str. 515). Wszystko to nie pozostaje bez wpływu na mikroflorę produktów. Wobec konieczności poszukiwania nowych źródeł dla zaspokojenia stale rosnących potrzeb żywieniowych ludzkości, rozważane są perspektywy wykorzystania drobnoustrojów do syntezy składników odżywczych z produktów odpadkowych lub niejadalnych ? przykładem niech będą próby wykorzystania pewnych gatunków drożdży rozkładających węglowodory ? do produkcji biomasy bogatej w białko w toku biologicznej rafinacji ropy naftowej. Szybki postęp techniczny w przemyśle spożywczym otwiera szerokie możliwości rozwoju dla związanych z nim działów mikrobiologii przemysłowej. Postęp ten jednak wymaga, w imię ochrony zdrowia konsumentów, równoległego rozwoju mikrobiologicznej kontroli żywności z punktu widzenia higieny. Sygnałem alarmowym, wskazującym na konieczność postawienia tej dziedziny mikrobiologii na odpowiednim poziomie stał się, zaobserwowany szczególnie w czasie II wojny światowej i w latach powojennych, znaczny wzrost liczby bakteryjnych zatruć pokarmowych. I tak np. w Anglii i Walii w okresie lat 1944?1954 zanotowano przeszło 10-krotne zwiększenie się liczby ognisk zatruć pokarmowych o etiologii bakteryjnej. Podobną sytuację stwierdzono w większości krajów cywilizowanych. Mimo nasilonej kontroli i działalności profilaktycznej, w wielu krajach nie udało się dotąd opanować całkowicie tego niepożądanego zjawiska. Ilustracją może być stały wzrost w USA liczby zachorowań na przenoszone poprzez żywność salmonelozy .
Także w Polsce liczba zarejestrowanych ognisk i liczba przypadków zachorowań na skutek bakteryjnych zatruć pokarmowych wykazuje tendencję wzrastającą . Nie ulega przy tym wątpliwości, że rzeczywista liczba przypadków zatruć pokarmowych wielokrotnie przewyższa zarejestrowane. Przyczyny wzrostu liczby zatruć pokarmowych należy niewątpliwie szukać we wspomnianej już zmianie trybu życia i sposobu odżywiania ludzi. W związku z wytworzeniem się wielkich skupisk ludności powstają ponadto problemy transportu i magazynowania żywności na niespotykaną dawniej skalę. Droga produktów żywnościowych od producenta do konsumenta coraz się wydłuża.
Mikroflora ścieków i zasady ich biologicznego oczyszczania
Surowe ścieki zawierają ogromne ilości mikroorganizmów; np. liczby bakterii sięgają 107 i więcej w 1 ml. Organizmy składające się na tę liczbę są bardzo różne i różnią się w poszczególnych ściekach. Dominującymi drobnoustrojami są bakterie, a wśród nich najliczniej występują pałeczki z rodzaju Pioteus, bakterie grupy coli, paciorkowce kałowe, tlenowe i beztlenowe laseczki zarodnikujące, naturalne bakterie wodne oraz bakterie denitryfikujące. Ponadto w ściekach mogą znajdować się wszystkie uprzednio wymienione drobnoustroje chorobotwórcze oraz ogromna rozmaitość bakteriofagów.
Poza bogactwem drobnoustrojów ścieki charakteryzują się dużą ilością najrozmaitszych związków chemicznych, głównie organicznych. Stanowią one obfite źródło pokarmu dla mikroorganizmów, które związki te rozkładają. Jeśli rozkład odbywa się w warunkach tlenowych, substancje organiczne mogą być utleniane do końcowych produktów, takich jak C02, H20, H2S04, HNOs i in.; mówimy wtedy o mineralizacji lub stabilizacji ścieków. Jeśli warunki są beztlenowe, zachodzi tylko częściowe utlenianie i powstają pośrednie produkty o niemiłej lub odrażającej woni (np. H2S), uciążliwe dla otoczenia.
Coraz większa produkcja ścieków stwarza ogromne problemy higienistom i inżynierom sanitarnym,, związane z właściwym oczyszczaniem ścieków przed ich wpuszczaniem do naturalnych zbiorników wodnych, wykorzystaniem w rolnictwie do nawadniania pól uprawnych lub ponownym ich użyciem jako wody przemysłowej w obiegu zamkniętym.
Poza wstępnymi procesami mechanicznymi i chemicznymi, podstawę skutecznego oczyszczania ścieków stanowią procesy biochemiczne z udziałem mikroorganizmów, głównie bakterii. Oczyszczanie można przeprowadzać w procesie beztlenowym (np. w osadnikach Imhoffa) lub wydajniej i częściej dziś przeprowadzanym procesie tlenowym, np. na złożach zraszanych lub za pomocą osadu czynnego, najskuteczniejszego ze znanych obecnie sposobów.
Złoże zraszane, stanowiące pewnego rodzaju filtr biologiczny, zbudowane jest ze zbiornika wypełnionego odłamkami kamieni, koksu i żużlu, na które rozpyla się ścieki po uprzednim wstępnym ich oczyszczeniu. W czasie przechodzenia ścieków, na powierzchni odłamków rozwijają się drobnoustroje tworząc błonkę, składającą się z różnych mikroorganizmów. Wskutek stałego przepływu powietrza (w kierunku przeciwnym do przepływu ścieków) drobnoustroje mineralizują przechodzące przez złoże ścieki, które z kolei są odprowadzane specjalnymi odpływami. W czasie pracy złoża następuje stałe niszczenie części błon- ki, która odrywa się i spływa wraz ze ściekami, osadzając się na dnie całego urządzenia, skąd jest okresowo usuwana. W wyniku oczyszczania na złożu zraszanym zostaje usuniętych ze ścieków od 0 do 80% zawieszonych cząstek stałych oraz od 70 do 85% bakterii, przy czym redukcja bakterii nie następuje drogą mechanicznego usuwania, lecz jest wynikiem antagonistycznego działania oraz pożerania przez pierwotniaki.
Podczas energicznego napowietrzania surowych ścieków przez określony czas,, drobne cząstki oraz substancje koloidalne wykazują tendencję do zbijania się. Powstają gąbczaste kłaczki (flokulacja) łatwo opadające. Jeśli ścieki pozostawimy w osadniku ? tworzą one na dnie mulisty osad, będący zaczątkiem tzw. osadu czynnego. Po odprowadzeniu sklarowanych (i oczyszczonych) ścieków znad osadu, doprowadzeniu nowej partii surowych ścieków, energicznym napowietrzaniu i pozostawieniu w osadniku, powstają nowe porcje osadu czynnego, przy czym w miarę dalszego powtarzania wymienionych czynności czas pełnej flokulacji jest coraz krótszy. W przypadku, gdy osad czynny stanowi 15?20% objętości oczyszczanych ścieków, flokulacja i oczyszczanie ścieków następuje w ciągu kilku minut. Nadmiar powstającego osadu jest okresowo usuwany. W tworzeniu kłaczków podstawową rolę odgrywają mikroorganizmy, bowiem w ściekach wyjałowionych proces ten nie zachodzi. Badania mikroskopowe kłaczków wykazały, że składają się one ze śluzowato-galaretowatej masy, w której znajdują się ogromne ilości bakterii, jak również pierwotniaków i martwe cząstki stałe. Śluzowato-gałaretowata substancja okazała się zooglealną masą bakterii zdolnych do wytwarzania otoczki oraz śluzu. Najczęściej i najwięcej spotyka się bakterii należących do rodzaju Zooglea oraz bakterii nitryfikujących. Dokładna rola poszczególnych drobnoustrojów oraz pierwotniaków w tym procesie nie jest dotąd jeszcze wyjaśniona. Oczyszczanie osadem czynnym pozwala na redukcję zawiesin w 70 do 97%, a bakterii ? w 95 do 99%, a nawet więcej. Efektywnemu oczyszczaniu ścieków towarzyszy jednak powstawanie dużej ilości osadu (nadmiar), którego unieszkodliwianie stanowi odrębny i obecnie najtrudniejszy problem w całym zagadnieniu oczyszczania ścieków. Należy tylko podkreślić, że osad ten posiada dużą wartość nawozową i mógłby być wykorzystany w rolnictwie po uzyskaniu pewności, że nie zawiera żadnych drobnoustrojów chorobotwórczych.
W uzasadnionych przypadkach oczyszczone ścieki ze szpitali zakaźnych lub sanatoriów przeciwgruźliczych poddaje się dezynfekcji, najczęściej przez chlorowanie.
Sanitarna analiza bakteriologiczna wody
Sanitarna analiza bakteriologiczna wody, wykonywana w sposób rutynowy przez terenową służbę przeciwepidemiczną, obejmuje oznaczanie tzw. ogólnej liczby bakterii w 1 ml wody oraz wykrywanie bakterii grupy coli.
Badanie ogólnej liczby bakterii, wykonywane metodą płytkową, polega w zasadzie na ilościowym określaniu bakterii zdolnych tworzyć kolonie na agarze zwykłym w temp. 20°C w ciągu 72 godzin (psychrofilne) oraz w temp. 37CC w ciągu 24 godzin (mezofilne). Oczywiste jest, że liczba rozwijających się w tych warunkach kolonii nie odpowiada nigdy rzeczywistej liczbie bakterii psychrofilnych czy mezofilnych, znajdujących się aktualnie w wodzie. Stąd uzyskiwane wyniki podaje się zawsze jako ogólną liczbę kolonii bakterii w 1 ml nierozcieńczonej wody, rozwijających się w ściśle określonych warunkach.
Przeważającą część ?ogólnej liczby bakterii w 20°” stanowią właściwe bakterie wodne oraz nieliczne glebowe, w zasadzie nieszkodliwe dla człowieka. Na ogólną liczbę bakterii mezofilnych składają się bakterie ściekowe oraz niektóre glebowe, toteż duża ich liczba dowodzi zanieczyszczenia wody. W ogromnej większości wód bakterie psychrofilne przewyższają liczbowo bakterie mezofilne. Metody badania bakterii grupy coli, stanowiących najważniejszy i najczulszy wskaźnik zanieczyszczenia kałowego wody, oparte są o zdolność fermentowania przez te drobnoustroje laktozy. Powszechnie stosowane są dwie metody: fermentacyjna probówkowa oraz filtrów membranowych. Pierwsza polega na posiewie różnych objętości wody na pożywce płynnej z laktozą oraz przeprowadzeniu testów potwierdzających. Wyniki tej metody podaje się bądź jako miano coli (najmniejsza objętość wody, zawierająca przynajmniej jedną komórkę bakterii grupy coli), bądź jako najbardziej prawdopodobną liczbę (NPL) tych drobnoustrojów w 100 ml wody, wyliczoną na podstawie rachunku prawdopodobieństwa. Zasadą drugiej metody jest przesączenie odpowiedniej objętości wody przez filtr membranowy, a następnie hodowanie bakterii osadzonych na jego `powierzchni na odpowiednim podłożu różnicująco-wybiórczym i policzenie wyrosłych typowych kolonii. W efekcie otrzymujemy w stosunkowo krótkim okresie rzeczywistą liczbę bakterii grupy coli w danej objętości wody. Wyniki podaje się jako wskaźnik coli-, jest to liczba bakterii grupy coli w 100 ml wody.
Bakteriologiczne kryteria oceny jakości wody
W wyniku badania mikroflory jelitowej ustalono stałe występowanie w niej, między innymi, następujących bakterii: 1) E. coli oraz blisko spokrewnionych z nią innych pałeczek jelitowych; 2) paciorkowców kałowych z typowym gatunkiem Streptococcus faecalis; 3) Clostridium periringens. O wyborze drobnoustrojów jako wskaźnika niebezpiecznego epidemiologicznie zanieczyszczenia wody decydują następujące czynniki: 1) względna ilość danego drobnoustroju w kale ludzi; 2) przeżywalność w środowisku zewnętrznym (szczególnie w wodzie) w porównaniu z przeżywalnością gatunków chorobotwórczych; 3) stopień skomplikowania metody ich wykrywania. Przyjętym obecnie (choć nie wolnym od krytycznych uwag) wskaźnikiem kałowego zanieczyszczenia wody jest grupa bakterii należących do Enterobacteriaceae, zwana grupą coli. Termin ten obejmuje tlenowe lub względnie beztlenowe Gram-ujemne pałeczki, nie zarodnikujące, obdarzone w zasadzie zdolnością fermentowania laktozy z wytworzeniem kwasu i gazu w ciągu 48 godzin. Do grupy coli zaliczamy następujące gatunki czy rodzaje bakterii: E. coli, Citrobacter oraz Enterobacter aerogenes, cloacae i liqueiaciens. Z sanitarnego punktu widzenia największe znaczenie przypisuje się na ogół E. coli, jako gatunkowi dominującemu w kale ludzi i zwierząt pod względem ilościowym, jak i częstości występowania. Często gatunek ten w bakteriologii sanitarnej określa się jako typ kałowy (jelitowy, fekalny) w odróżnieniu od typu niekałowego (ziemnego, pośredniego), do którego zalicza się wszystkie pozostałe gatunki grupy coli. Głównym powodem uznania jednak wszystkich bakterii grupy coli jako wskaźników jest fakt,, że nie kał, ale ścieki bytowe są podstawowym źródłem zanieczyszczenia wody mikroorganizmami chorobotwórczymi, a oba typy omawianych bakterii występują w ściekach w przybliżeniu w tych samych ilościach.
Paciorkowce kałowe oraz C. perfringens wykorzystuje się zwykle jako dodatkowe wskaźniki zanieczyszczenia wody w przypadkach wątpliwych lub przy nowych ujęciach wody. Ponadto ciągle dyskusyjna jest sprawa, czy bakterie grupy coli są odpowiednim wskaźnikiem zanieczyszczenia wody w pływalniach i czy właśnie paciorkowce kałowe lub inne nie byłyby właściwsze.Również należy podkreślić, że żadna z wymienionych grup. drobnoustrojów nie stanowi wiarygodnego wskaźnika obecności w wodzie tych wirusów jelitowych, które mogą się szerzyć drogą wodną. Nowsze badania wykazały większą często oporność wirusów niż bakterii wskaźnikowych na stosowane konwencjonalne metody oczyszczania wody z chlorowaniem włącznie. Być może zastosowanie bakteriofagów jako drobnoustrojów wskaźnikowych w stosunku do wirusów rozwiąże kiedyś i ten problem.