Wykład 11 18.02.2013

„Profile białkowe płynów ustrojowych. Metody oznaczania białka całkowitego i albuminy”

stężenie białka całkowitego jest wypadkową

Metabolizm białek osocza:

Synteza i degradacja białek osocza

• 75% wątroba (albumina)

• limfocyty w wyniku stymulacji Ag (Ig)

• tkanki np. jelita (lipoproteiny, transferyna)

• szpik kostny (transferyna)

• gruczoły dokrewne (hormony)

Synteza → obróbka potranslacyjna → przestrzeń pozakomórkowa

proteoliza, glikozylacja

Czas półtrwania białek osocza waha się w szerokich granicach

• od kilku h dla białek układu krzepnięcia

• do 21/14 dni dla albuminy

• 24dni dla Ig

Białka ulegają starzeniu, są wtedy wiązane przez mniej lub bardziej specyficzne receptory powierzchniowe komórek (LRP), pozbawione komponenty glikozydowej, internalizowane na drodze endocytozy i katabolizowane w lizosomach.

Degradacja białek odbywa się we wszystkich tkankach proporcjonalnie do ich aktywności metabolicznej

• wątroba- degradacja części lipoprotein

• skóra- albumina

• komórki śródbłonka naczyń- białka o dużej masie cząsteczkowej

• część białek osocza (ok 5g/dobę) przesącza się do przewodu pokarmowego, gdzie podlega strawieniu. AA są na powrót wchłaniane do krążenia wrotnego. Takiej samej degradacji ulegają również endogenne białka sków trawiennych, złuszczonego nabłonka przewodu pokarmowego

• droga kłębków nerkowych- gradient filtracyjny w kłębkach nerkowych dla białek osocza zależy od ich masy cząsteczkowej. Dla albumin wynosi on 1:1000

W ciągu doby przesącza się do moczu pierwotnego ok 5g albuminy i wiele innych białek drobnocząsteczkowych. Większość z nich zostaje zresorbowana zwrotnie 99% i rozłożona w komórkach kanalików nerkowych.

W efekcie zdrowy człowiek wydala z moczem 20-80mg/24h w tym nie więcej niż 30mg albuminy!!!!\

Profile białkowe płynów ustrojowych

		Białko całkowite	albumina	Ig
Białko należące do przestrzeni wewnątrznaczyniowej	osocze	63-83 g/l	35-50 g/l (60% osocza)	1.07.2015
Płyn ekskrecyjny pozanaczyniowy	surowica	60-80 g/l	35-50 g/l	7-15 g/l
Płyn transcelularny	mocz	<200 mg/dobę	<30 g/l
	Płyn m-r	0,25-0,45 g/l
	ślina	2,4 g/l
	Sok trzustkowy	1-3,8 g/l
	łzy	0,2-0,5 g/l
	wysięki	>30g/l

Wartości prawidłowe:

↓60-80g/l obrzęki

↑80 g/l -↑ lepkości osocza

Metody oceny białka całkowitego w surowicy

1. Oznaczanie azotu białkowego

1. metoda Kiejdahla 2-100g/l referencyjne

2. metoda Nesslera

2. Metody strąceniowe

1. metoda taninowa 0,02-0,1 g/l

2. metoda Extona 0,02-2 g/l

3. Metody kolorymetryczne

1. metoda biuretowa 0,5-100 g/l

2. metoda Lowry'ego 0,01-0,5 g/l

3. metoda spektrofotometryczna (280 nm) 0,1-1,2 g/l

4. Metoda refraktometryczna 10-110 g/l

Postępowanie z materiałem badanym przed analizą

• krew pobierana rano, na czczo

• po wyrzepieniu i odwirowaniu surowicy oglądamy ją

• shemolizowane, żółtaczkowe, lipemiczne - wykonać próbę ślepą zmętnieniową

• dekstran, heparyna również reagują z odczynnikiem biuretowym (podanie 500 ml dekstranu podnosi stężenie białka o 8 g/l kolejnego dnia nie odnotowana wpływu na poziom białka całkowitego)

• hiperbilirubinemia podniesiona o 7 g/l wpływa znacząco na poziom białka.

Zakłócenia Białko całkowite Albumina

żółtaczka <10% przy Bb <24mg/dl <10% przy Bb <40 mg/dl

<410mmol/l <684 mmol/l

hemoliza <10% przy <3g/l <10% przy <4,5g/l

lipemia <10% przy <1000ng/dl

podanie 500ml dekstranu ↑ TP o ok 8g/l

zaraz po podaniu. Po 12h nie odnotowano

wpływu na poziom TP

1. Oznaczanie azotu białkowego

Metoda Kiejdahla

Wykonuje się:

1. Utlenianie białek do: CO₂, H₂O, SO₂, NH₃

2. Zawartość azotu w białkach, która wynosi 16%

16 g azotu - 100 g białka

1 g azotu - x g białka

x=6,25

C_TP g/dl=g/dl∙6,25

Zasada metody:

Spalenie surowicy z H₂SO₄ w obecności katalizatora (CuSO₄ lub SeO₂) w wyniku czego węgiel utlenia się do CO₂, N lub NH₃, który jest następnie wiązany przez kwas siarkowy do siarczanu amonu (NH₄)₂SO₄.

Próbkę jako (NH₄)₂SO₄ przenosi się ilościowo do aparatu Parnasa-Wagnera, gdzie po dodaniu NaOH uwalnia się NH₃.

NH₃ oddestylowuje się z parą wodną w odbieralniku, w którym znajduje się nasycony roztwór kwasu bornego. Kwas wiąże amoniak to warząc zielony boran amonu.

Amoniak odmiareczkowuje się HCl do momentu uzyskania barwy fiołkowo-czerwonej, który wypiera słaby kwas borny.

Natężenie barwy jest wprost proporcjonalne do zawartości azotu w badanym materiale.

C_TP g/dl=g/dl azotu ∙6,25

(NH₄)₂SO₄+2NaOH → 2NH₃+Na₂SO₄+2H₂O

2NH₃+H₃BO₃→(NH₄)₂B₄O₇+5H₂O

(NH₄)₂B₄O₇+2HCl+5H₂O→2NH₄Cl+4H₃BO₃

Metoda Nesslera

Zasada metody:

Spalenie surowicy z H₂SO₄ w obecności katalizatora (CuSO₄ lub SeO₂) w wyniku czego węgiel utlenia się do CO₂, N lub NH₃, który jest następnie wiązany przez kwas siarkowy do siarczanu amonu (NH₄)₂SO₄.

(NH₄)₂SO₄ reaguje z jodkiem amidooksyrtęciowym dając produkt o żółtym zabarwieniu.

Natężenie barwy jest wprost proporcjonalne do zawartości azotu w badanym materiale.

C g/dl=g/dl azotu ∙ 6,54

6,54 - z założenia, że azot w białkach to 15%

2. Metody strąceniowe

Metoda taninowa

Zasada metody:

Polega na oznaczaniu zmętnienia jakie daje połączenie białka z taniną w środowisku kwaśnym w obecności fenolu. Uzyskane zmętnienie jest wprost proporcjonalne do stężenia białka.

Metoda Extona

Zasada metody:

Białko wytrąca się z kwasem sulfosalicylowym w obecności siarczanu sodowego. Stopień zmętnienia oznaczony jest przez pomiar ekstynkcji przy długości fali λ=445 nm jest wprost proporcjonalne do stężenia białka.

3. Metody kolorymetryczne

Metoda biuretowa

Zasada metody:

Jony miedziowe w środowisku zasadowym reagują z wiązaniami peptydowym białek - CO-NH- tworząc kompleks o fiołkowym zabarwieniu z maksimum przy λ=546 nm (jeżeli pomiar prowadzony wobec próby ślepiej). Jeśli pomiar wobec wody to λ=680 nm.

Intensywność barwy jest wprost proporcjonalna do liczby wiązań peptydowych. Najprostszym związkiem, który wchodzi w reakcję jest biuret: NH₂-CO-NH-CO-NH­₂.

W odczynie alkalicznym jony miedzi strącają się jako Cu(OH)₂ konieczny jest więc czynnik stabilizujący (winian sodowo-potasowy).

Stężenie białka: z krzywej, ze wzoru.

Granice 10-150 g/l.

Białka rzadko spadają poniżej 20 g/l i nie przekracza 140 g/l (więc jest to dobra metoda, ale nie w moczu lub płynach z jam ciala).

Metody dobieramy w zależności od właściwości białek i ich stężenia w płynie biologicznym.

Pytanie o winian sodowo-potasowy → stabilizowanie jonów miedzi

Metoda Lowry'ego

Zasada metody:

Odczynnik Felina-Ciocalteu reaguje z resztami tyrozyny w cząsteczce białka dając niebieską barwę. W obecności rozcieńczonego roztworu jonów miedzi w roztworze alkalicznym (reakcja na wiązania peptydowe) barwa ulega znacznemu wzmocnieniu.

• Bardziej czuła metoda niż metoda biuretowa.

• W materiale o niskim stężeniu białka.

• Wyniki zawyża obecność aminokwasów aromatycznych.

Barwa roztworu jest wynikiem 2 reakcji:

1. Kwasu fosforomolibdenowego i fosforowolframowego z obecnymi w białku aminokwasami aromatycznymi (tyrozyną i tryptofanem)

2. Reakcji biuretowej (wiązania biuretowe reagują z jonami Cu²⁺ w środowisku alkalicznym).

Metoda spektrofotometryczna

• nadaje się do pomiaru stężenia białka w płynie mózgowo-rdzeniowym nie mętnego i nie podbarwionego

• w skład większości białek wchodzą AA. W obecność tych AA powoduje charakterystyczną absorbancję przy λ= 280nm. Nasilenie tej absorbancji jest wprost proporcjonalne do stężenia AA, a tym samym do ilości białka

• Kwasy nukleinowe przeszkadzająprzy oznaczaniu białka w ekstraktach białkowych. Jednak kwasy te dają znaczne zwiększenie absorbancji światła przy 260nm niż przy 280nm. W związku z czym możliwe jest wyeliminowanie ich wpływu podczas pomiaru przy λ= 260 i 280nm

C= C₂₈₀- C₂₆₀

4. Metoda refraktometryczna

Wielkość współczynników załamania dla płynów ustrojowych jest wprost proporcjonalna do zawartości w nich białka. Po oznaczeniu refrakcji badanej surowicy ze specjalnych tablic odczytuje się stężenie białka w %.

Metody oznaczania albumin:

• sucha chemia KODAK S

• metoda kolorymetryczna z zielenią bromokrezolową S

• moetoda kolorymetryczna z czerwienią bromokrezolową S

• metoda elektroforetyczna S

• immunofelometryczna Sp, mocz

• elektroimmunodyfuzji radialnej lub Laurella Sp, mocz

metoda kolorymetryczna

zieleń w środowisku kwaśnym z albuminami surowicy tworzyy barwny kompleks. Intensywność zabarwienia mierzona przy 630nm jest wprost proporcjonalna do stężenia albumin w badanej próbce.

Oczynniki:

• czerwień bromokrezolowa

• surowica wzorcowa

• sól fizjologiczna

Czułość metody: 1g/l

Liniowość: do 70g/l

---