Odczyny wykrywające kompleksy antygen-przeciwciało

Antygeny związane ze swoistymi przeciwciałami tworzą kompleksy im­munologiczne zwane też kompleksami antygen-przeciwciało. Wykrywanie tych połączeń i ich ilościowe określanie jest ułatwione wówczas, gdy wyko­rzystuje się do tego celu radioizotopy, barwniki fluoryzujące lub enzymy. Po reakcji oddziela się powstałe kompleksy antygenu z przeciwciałem od resz-

ty materiału i ustala ich ilość. Metody te wymagają jednak specjalnej apara­tury i dlatego są rzadko używane w diagnostyce mikrobiologicznej. Zastoso­wanie praktyczne znalazy jedynie odczyny immunofluorescencyjne.

Iminunolluorescencja (IF) jest niezwykle czulą metodą serologiczną, służącą do wykrywania antygenu znajdującego się w tkankach, płynach ustrojowych) a także wydzielinach i wydalinach. W tym celu stosuje się tzw. koniugaty. tj. swoiste przeciwciała znakowane barwnikiem fluoryzującym. Najczęściej używanym barwnikiem fluoryzującym (fluorochromem) jest izocyjanian fluoresceiny (FITC) łatwo łączący się z immunoglobułinami, nie zmieniający przy tym właściwości reagowania z antygenem. Po naświe­tleniu promieniami ultrafioletowymi (długość fali 290-145 um) barwnik emituje intensywne światło widzialne barwy zielonej (długość fali 525 um), co pozwala na stwierdzenie przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego obec­ności kompleksów antygen-przeciwciało. Wśród odczynów immunofluores-cencyjnych na uwagę zasługują odczyn bezpośredni i pośredni.

Bezpośredni odczyn immunofluorescencji

Odczyn ten służy do wykazania obecności antygenu (bakterii, wirusów) w badanym materiale. Przeciwciała, znakuje się barwnikiem (FITC), pokry­wa nimi preparat (skrawek histologiczny, preparat odciskowy lub rozmaz) i przetrzymuje w temperaturze zwykle 37°C przez 30-60 minut. Następnie preparat przemywa się kilkakrotnie, celem usunięcia niezwiązanych przeciw­ciał, a po wysuszeniu ogląda w mikroskopie fluorescencyjnym. Obecność świecących, zielono-żółtych kompleksów dowodzi obecności antygenu.

Odczyn ten znalazł zastosowanie w badaniu kału na obecność prątków gruźlicy, tkanki mózgowej przy podejrzeniu o listeriozę, a także narządów wewnętrznych przy poszukiwaniu bakterii beztlenowych. Stosuje się go także do wykrywania wirusów, np. wirusa wścieklizny (w preparatach z tkanki mózgowej) czy wirusa pomoru świń (w preparatach odciskowych, wykona­nych z migdałków, śledziony, nerek itp.).

Pośredni odczyn immunofluorescencji

Odczyn ten w weterynarii stosuje się głównie do wykazania antygenu (wirusów, bakterii) w tkankach. W tym celu preparat pokrywa się swoistą surowicą i po inkubacji spłukuje buforowym roztworem 0,85% NaCl. Nastę­pnie pokrywa się surowicą antyglobulinową znakowaną FITC. Po ponownej inkubacji i przemyciu preparat ogląda się pod mikroskopem fluorescencyj­nym. Obecność ognisk fluorescencji dowodzi obecności antygenu w badanym preparacie.

Pośredni odczyn IF daje lepsze wyniki niż odczyn bezpośredni, ponieważ każda cząsteczka przeciwciała związana z antygenem przyłącza z kolei jako antygen kilka znakowanych immunogłobulin, co w efekcie daje znacznie silniejszą fluorescencje.

Odczyny wykazujące efekty łączenia się antygenu z przeciwciałem

Są to odczyny dwufazowe. Faza pierwsza dotyczy swoistego wiązania się antygenu z przeciwciałem natomiast druga jest uzależniona od stanu fizycznego antygenu i warunków środowiska. Jeżeli np. przeciwciało wiąże się z rozpuszczalnym antygenem, wówczas powstają kompleksy precypita-

cyjue. W przypadku natomiast antygenu upostaciowanego (bakterie, krwinki) mamy do czynienia z aglutynacją.

Jeżeli reakcja wiązania antygenu z przeciwciałem powoduje aktywację dopełniacza, wówczas mówimy o odczynach komplementarnych.

Odczyn precypitacji

Odczyn ten polega na łączeniu się antygenu koloidalnego (bezpostacio­wego) ze swoistym przeciwciałem (precypityną) w obecności elektrolitów. Wynik reakcji charakteryzuje się wystąpieniem zmętnienia, a później two­rzeniem się delikatnego precypitatu.

Odczyn precypitacji uwarunkowany jest w dużym stopniu stosunkami ilościowymi reagentów. Zahamowanie bowiem odczynu może wystąpić zarówno przy nadmiarze antygenu, jak i nadmiarze przeciwciał. W obu przypadkach tworzą się rozpuszczalne, nieprecypitujące kompleksy. Spowo­dowane to jest tym, że większość przeciwciał jest dwuwartościowa (IgG), dlatego też może wiązać się jednocześnie tylko z dwoma determinantami antygenowymi. Natomiast antygeny białkowe są wielowartościowc ze stosun­kowo dużą liczbą determinantów na swej powierzchni. W mieszaninach, w których występuje nadmiar przeciwciał, cząsteczka antygenu może być pokryta przez przeciwciała, co uniemożliwia krzyżowe łączenie się jej z in­nymi cząsteczkami antygenu i tworzenie precypitatu. Przy optymalnych proporcjach antygen-przeciwciało dochodzi do krzyżowych połączeń między cząsteczkami antygenu i formowania się dużych kompleksów precypitacyj-nych.

Wartość ochronna precypityn polega głównie na zobojętnianiu toksyn bakteryjnych (tężcowej, botulinowej) bądź też neutralizacji toksycznych substancji polisacharydowych otoczek bakteryjnych, co w znacznym stopniu ułatwia fagocytozę zarazków.

Techniki precypitacyjne

Próba pierścieniowa

Odczyn tego typu jest stosowany do wykrywania antygenu. Małą ilość surowicy odpornościowej wprowadza się pipetą pasteurowską na dno pro­bówki, a następnie nawarstwia się odrobinę roztworu antygenu. W wyniku łączenia się antygenu z przeciwciałem tworzy się w ciągu 1-2 minut deli-

katny pierścień na granicy obu płynów. Nadmiar antygenu zwykle nie wpływa na wynik reakcji, ponieważ następuje wzajemna dyfuzja w obu płynach i powstaje optymalne stężenie antygenu i przeciwciała w tej samej warstwie. Próba pierścieniowej precypitacji znajduje praktyczne zastosowa­nie w diagnostyce wąglika jako tzw. odczyn Ascoliego.

Test flokulacji

Próba polega na zmieszaniu roztworu antygenu z surowicą odpornościowa i obserwowaniu, po okresie inkubacji, powstałego precypitatu. Aby uniknąć hamowania precypitacji przy nadmiarze antygenu nastawia się odczyn w kilku probówkach, zawierających kolejne rozcieńczenia antygenu, i dodaje się sialą dawkę surowicy. Odczyn ten znajduje zastosowanie przy określaniu stężenia toksyny stanowiącej materiał wyjściowy do produkcji anatoksyny — szczepionki do uodporniania zwierząt.

Precypitacja w żelu

Modyfikacją odczynu precypitacyjnego jest opracowana przez Ouchter-lonyego metodyka wykonywania odczynu w żelu agarowym. Jest to tzw. test podwójnej immunodynizji. Polega on na tym, że antygen i surowica umieszczone są w basenikach wyciętych w żelu, skąd dyfundują we wszyst­kich kierunkach. Na granicy zetknięcia się antygenu z przeciwciałem tworzy się linia precypitacyjna, najczęściej w ciągu 24-48 godzin inkubacji w tem­peraturze pokojowej. Preparaty, zawierające różne frakcje antygenowe, będą dawać kilka prążków precypitacyjnych, w zależności od ich ruchli­wości w żelu. W ten sposób można stwierdzić liczbę antygenów

w badanym preparacie, jak również ustalić stopień ich pokrewieństwa anty­genowego. Jeżeli badane preparaty zawierają identyczne antygeny, utworzą się linie strątu łączące się ze sobą. Jest to tzw. reakcja identyczności. Jeżeli

antygeny są różne, następuje przecięcie się wytworzonych przez nie prąż­ków — reakcje nieidentyczności. Reakcja częściowej identyczności charak­teryzuje się tworzeniem tzw. „ostrogi", co świadczy, że spośród dwóch po­dobnych antygenów jeden z nich ma dodatkową determinantę antygenową.

reakcja identyczności

brak pokrewieństwa antygenowego

Metoda ta służy do badania struktury antygenowej drobnoustrojów, np. włoskowca różycy, wirusa pryszczycy, jak również do celów diagnostycz­nych.

Przy użyciu antygenów wirusowycłi można wykazać obecność swoistych przeciwciał w surowicach koni chorych na niedokrwistość zakaźną lub w su­rowicach bydła chorego na białaczkę.

Immunodyfuzja radialna

Metoda ta polega na migracji antygenu z basenu do żelu nasyconego swoistymi przeciwciałami. Stężenie surowicy w żełu jest oznaczone i stałe, natomiast zmienne w poszczególnych basenach są ilości antygenu. W wyniku reakcji antygenu z przeciwciałami wokół basenów powstają straty precypitacyjne w formie pierścieni, średnica tych pierścieni jest proporcjonalna do ilości badanego antygenu. Metodą tą określa się koncentrację antygenu.

Zmodyfikowaną immunodyfuzję radialną, polegającą na wysyceniu żelu antygenem, stosuje się do wykazywania przeciwciał przeciwko Mycoplasma mycoides.

Immunoelektroforeza

stanowi połączenie techniki podwójnej dyfuzji w żelu i elektroforezy. Odczyn przeprowadza się w cienkiej warstwie agaru pokrywającego szkiełko przedmiotowe. Do baseników wprowadza się badane antygeny i poddaje elektroforezie. Poszczególne frakcje antygenowe w zależ­ności od ładunku elektrycznego ulegają rozdzieleniu w polu elektrycznym. Następnie centralny rowek wypełnia się surowicą odpornościową, zawiera­jącą przeciwciała przeciwko badanym antygenom. Szkiełko umieszcza się w wilgotnej komorze, a wynik odczytuje po 24-48 godzinych przetrzymy­wania w temperaturze pokojowej. W miejscu maksymalnej koncentracji odpowiedniego antygenu reagującego z przeciwciałem powstają łuki precypitacyjne.

Metoda ta stosowana jest m. in. do badania składników dopełniacza, do wykrywania antygenów bakteryjnych, wirusowych i grzybiczych.

Immunoelektroprecypitacja

Metoda oparta jest o zjawisko elektroendoosmozy, tzn. wędrówki w żelu przeciwciał wraz z roztworem buforu w kierunku katody. Natomiast antygen, posiadający silny ładunek ujemny, migruje pod wpływem pola elektrycznego w kierunku anody wbrew endoosmozie. Po umieszczeniu w jednej studzience antygenu a w drugiej przeciwciał następuje migracja ku sobie tych reagentów, które po zetknięciu się dają linię precypitacyjną. Reakcja występuje już w cią­gu 10-15 minut.

Odczyn wykorzystywany jest w rozpoznawaniu chorób wirusowych, np. choroby aleuckiej norek, zakażeń na tle mikoplazrn, a także stosowany jest jako rutynowy test w mykoserologii do wykrywania przeciwciał, m. in. w sto­sunku do Aspergillus fumigatus, Histoplasma capsulatum i Candida albicans.

Dwukierunkową immunoelektroforezę wykonuje się w 1 % żelu agaro-zowym (oczyszczony agar) w buforze weronalowym o pH 8,6 i sile jonowej od u = 0,01 do 0,03. Na płytki szklane wlewa się agarozę, wycina otwór, wypełnia antygenem i prowadzi rozdział w jednym kierunku przez 1-2 go­dzin. Z kolei odcina się górną część żelu i miejsce to pokrywa się 1 % agarozą zmieszaną ze swoistą surowicą odpornościową. Elektroforezę

w drugim kierunku przeprowadza się przez kilka godzin. Po zakończeniu immunoeiektroforezy płytki po wysuszeniu wybarwia się, celem uwidocz­nienia łuków precypitacyjnych.

Metoda ta jako bardziej czuła i pozwalająca na ilościową ocenę stężenia antygenu lub przeciwciała wypiera coraz bardziej klasyczną metodę immuno­eiektroforezy, opisaną przez Grabara i Williamsa.

Odczyn aglutynacji

Przeciwciała, co najmniej dwuwartościowe, po związaniu się ze swoistym antygenem na powierzchni takich cząstek korpuskularnych (o średnicy zwykle powyżej 0,5 um), jak: bakterie, krwinki, plemniki itp., powodują ich zlepia­nie, czyli aglutynację.

Aglutynacja, podobnie jak precypitacja, jest zjawiskiem dwufazowym. Najpierw następuje szybkie wiązanie się swoistych przeciwciał z antygenem (faza I). Następnie immunoglobuliny (przeciwciała) naładowane ładunkiem siabo dodatnim zobojętniają, wzajemne odpychanie się ujemnie naładowa­nych cząstek antygenu, prowadząc do ich adherencji i wypadania komplek­sów z roztworu w obecności elektrolitów (faza II). Najłatwiej wiążą antygen i aglutynują wielowartościowe przeciwciała klasy IgM; przeciwciała klasy IgG i IgA są mniej aktywne. Aglutyniny stwierdza się głównie w surowicy, gdzie pojawiają się już w czasie choroby, zwykle na 6- 10 dzień po zakażeniu, i utrzymują się od kilku

do kilkunastu miesięcy. Obecność ich można wykazać także w innych pły­nach ustrojowych (mleko) i wydalinach. Aglutyniny nie inaktywują drobno­ustrojów, powodują jednak ich agregację i immobilizację w kapilarach naczyń krwionośnych, gdzie łatwo ulegają fagocytozie. Znacznie większe, znaczenie odgrywają aglutyniny jako przeciwciała diagnostyczne w rozpoznawaniu chorób zakaźnych. Odczyny aglutynacyjne są wykorzystywane w sęrodiagnostyce brucelozy, salmonelozy i leptospirozy. Na podstawie stężenia przeciwciał, tj. miana suro­wicy badanych zwierząt, można stawiać rozpoznanie schorzenia.

Miano jest to odwrotność najwyższego rozcieńczenia surowicy, przy którym następuje jeszcze widoczny odczyn aglutynacji. Jeżeli np. minimalne miano pozytywne wynosi 100, tzn. badana surowica jeszcze w rozcieńczeniu 1:100 aglutymyje antygen.

Aglutynacja znajduje zastosowanie także przy identyfikacji antygenów bakteryjnych za pomocą zestawu surowic o określonej swoistości. Ma to szczególne znaczenie w różnicowaniu drobnoustrojów o zbliżonych cechach morfologicznych i właściwościach fizjologicznych; np. drobnoustrojów z ro­dziny Enterobacteriaceae.

Techniki aglutynacji bezpośredniej

Odczyn aglutynacji bezpośredniej wykonać można jako tzw. aglutynację makroskopową — probówkową i płytkową (szkielkową), oraz mikrosko­pową.

Aglutynacja probówkową. Badaną surowicę rozcieńcza się zwykle roztworem 0,85% NaCl, a następnie do probówek ze wzrastającymi rozcierkzeniami surowicy dodaje się staią dawkę anty­genu. Probówki z reagentami pozostawia się przez 2 godziny w cieplarce w 37°C, a potem w temperaturze pokojowej. Wynik reakcji odczytuje się na drugi dzień. Metodą tą określa się miano badanej-surowicy (ryc. II. 17). Przy nadmiarze przeciwciała, podobnie jak w przypadku precypitacji, obser­wuje się zjawisko prozony, tj. zahamowania procesu aglutynacji. Czasami zjawisko prozony obserwuje się we wszystkich probówkach, w których nastaiono odczyn aglutynacji. Może to być spo­wodowane obecnością przeciwciał, które nie mają zdolności agiutynacyjnych mimo wiązania się z antygenem; są to tzw. przeciwciała niekompletne, jednowartościowe. Brak aglutynacji można tłumaczyć również takim usytuowaniem determinantów na cząsteczkach antygenu, że są one trudno dostępne dla receptorów przeciwciał i nie dochodzi do krzyżowego wiązania między cząsteczkami. Brak połączeń miedzy cząsteczkami antygenu może być także wynikiem związania się obu receptorów przeciwciała z determinantami znajdującymi się na tej samej cząsteczce antygenu.

Aglutynacja płytkowa. Kroplę surowicy, krwi lub mleka miesza się z kroplą barwionego antygenu na płycie szklanej, a wynik odczytuje się już po kilku minutach przetrzymywania płyty iv temperaturze pokojowej. Jest to metoda orientacyjna, często stosowana w terenie (np. przy badaniu drobiu w kierunku pulorozy).

Aglutynacja mikroskopowa. Odczyn wykonuje się na szkiełkach przedmiotowych lub na specjalnej płycie szklanej, a wynik odczytuje się pod mikroskopem po 5-10 minutach od nastawienia aglutynacji. Odczyn ten stosowany jest wówczas, gdy gęstość antygenu jest zbyt niska, np. przy rozpoznawaniu leptospirozy.

Niektóre gatunki bakterii (prątki gruźlicy) lub ich formy dysocjacyjne (forma R Brucella abortus) nie tworzą jednorodnej zawiesiny w roztworze fizjologicznym NaCl. Takie drobnoustroje bez obecności swoistych przeciw­ciał ulegają samoistnemu zlepianiu i wypadają z roztworu w postaci agluty-natu. Dlatego też nie mogą być używane jako antygeny do odczynu aglu­tynacji. Zjawisko tego typu nosi nazwę aglutynacji spontanicznej lub rze­komej.

Aglutynacja bierna

W odczynie aglutynacji biernej biorą udział trzy składniki: antygen w po­staci koloidalnej, swoiste w stosunku do antygenu przeciwciało oraz bierny nośnik antygenu.

Najczęściej używanymi nośnikami są erytrocyty owcy lub człowieka, cząstki lateksu czy bentonitu. Jako antygeny w tym odczynie stosowane są zwykle wyciągi polisacharydowe, lipopolisacharydowe czy też glikoproteidy. Mogą to być także produkty przemiany materii drobnoustrojów, np. tuber-kulina. Antygeny te opłaszcza się nośnikami i miesza z przeciwciałami swoistymi dla zaadsorbowanych antygenów. Wynik aglutynacji odczytuje się po 24 godzinach przetrzymywania w temperaturze pokojowej.

Na ogół antygeny wielocukrowe są dobrze adsorbowane przez erytro­cyty, natomiast antygeny białkowe wymagają uprzedniej modyfikacji po­wierzchni krwinek. Stosuje się w tym celu kwas taninowy lub też wiąże się antygen z krwinką, za pośrednictwem bis-dwufazowej benzydyny.

Najczęstszą formą aglutynacji biernej jest hemaglutynacja bierna, jeden z najczulszych odczynów serologicznych, wykorzystujący krwinki jako nośnik antygenu.

Odczyn antyglobulinowy Coombsa jest pośrednim odczynem aglutyna-cyjnym służącym do wykrywania niekompletnych przeciwciał. Przeciwciała takie są jednowartościowe, tzn. mają tylko jedną grupę chwytną (kompletne są co najmniej dwuwartościowe) i po połączeniu ze swoistym antygenem tworzą małe kompleksy nie wypadające z roztworu (brak wyraźnej reakcji aglutynacji). Obecność tych przeciwciał można jednak wykryć do­dając np. do zawiesiny pałeczek z rodzaju Brucella, związarrych ze swoistymi przeciwciałami niekompletnymi surowicy antyglobulinowcj. Surowicę taką uzyskuje się uodporniając królika globulinami bydlęcymi. Surowica królicza zawiera wówczas kompletne przeciwciała antyglobulinowe, które reagują z globulinami, tj. przeciwciałami niekompletnymi związanymi z bakteriami i tworzą duże kompleksy, wypadające z roztworu w postaci widocznych makroskopowo aglutynatów. W weterynarii odczyn antyglobulinowy jest wykorzystywany m. in. w diagnostyce brucelozy jako test uzupełniający obok odczynu aglutynacji i OWD. Niekiedy znajduje zastosowanie również w rozpoznawaniu listeriozy.

Odczyn zahamowania hemagłutynacji

Szereg drobnoustrojów ma zdolność aglutynowania czerwonych krwinek ssaków ,m. in. Erysipelothrix rhusiopathiae, Mycoplasma gallisepticum, wirus grypy, wirus rzekomego pomoru drobiu itp.). Tracą one jednak tę właściwość po związaniu się ze swoistymi przeciwciałami.

Odczyn zahamowania hemagłutynacji wykonuje się najczęściej w ten sposób, że do stałej dawki antygenu zawierającego 4 lub 8 jednostek hema-ghitynacyjnych, dodaje się kolejno wzrastające rozcieńczenia surowicy. Po inkubacji miesza się kompleksy antygen-przeciwciało z zawiesiną prze-mytycli erytrocytów. Za jednostkę hemaglutynacyjną przyjmuje się mini­malną dawkę zarazka powodującego hemaglutynację.

Niekiedy, podczas badania większej ilości różnych surowic, wygodniej jest dodawać zmienne dawki zarazka do stałej dawki rozcieńczontj surowicy.

Odczyn hamowania hemagłutynacji może być wykorzystywany do identyfikacji nieznanego zarazka o właściwościach hemaglutynacyjnych, lub do wykrywania przeciwciał w badanej surowicy przy użyciu znanego wirusa lub bakterii.

Współaglutynacja i paraagłutynacja

Współaglutynacja polega na aglutynowaniu przez przeciwciała obok zarazka homologicznego również, zwykle w niższym mianie, bakterii anty-genowo pokrewnych. Surowica otrzymana przez uodpornienie królików np. pałeczką Shigella dysenteriae, zlepiająca ten zarazek {Sh. dysenteriae) w roz­cieńczeniu 1:2000, aglutynuje także pałeczki Sh. flexneri, ale w rozcieńczeniu rylko 1:100. Absorpcja takiej surowicy pałeczkami Sh. dysenteriae usuwa z niej wszystkie charakterystyczne dla tego zarazka aglutyniny główne i uboczne, natomiast po absorpcji surowicy pałeczką Sh. flexneri znikają z niej tylko aglutyniny dla tego zarazka, tj. uboczne, przy nic zmienionym mianie aglu-lynin głównych dla Sh. dysenteriae.

Paraagłutynacja jest to zjawisko zlepiania przez surowice osobników chorych nie tylko zarazków związanych etiologicznie z daną jednostką choro­bową, ale także innych, niespokrewnionych szczepów bakterii występują­cych w ustroju chorego.

Typowym przykładem paraaglutynacji jest diagnostyeznie swoista aglu­tynacja pałeczek Proteus (szczepów X18 i X2) przez surowice ludzi chorych na tyfus plamisty, wywoływany przez Rickettsia prowazekii (tzw. odczyn Weila-Fe-lixa). Przyczyną tego zjawiska jest prawdopodobnie nabycie drogą trans­formacji przez szczepy Proteus X2 i X]9 dziedzicznej, genotypowej zdolności wytwarzania niektórych antygenów, charakterystycznych dla Rickettsia pro­wazekii. Właściwości paraaglutynacyjne można u niektórych bakterii stymu­lować także in nitro, hodując je na jednym wspólnym podłożu z bakteriami innego gatunku.

Odczyny komplementarne

Odczyn wiązania dopełniacza (OWD)

Krwinki czerwone uczulone swoistymi przeciwciałami ulegają lizie (roz­puszczeniu) pod wpływem działania komplementu. Zjawisko to ma duże znaczenie praktyczne, jest bowiem wykorzystywane w odczynie wiązania dopełniacza, który służy do wykrywania i określania albo przeciwciał w ba­danej surowicy, albo antygenu w badanym materiale. Odczyn wiązania dopełniacza obejmuje dwa układy. W skład pierwszego, czyli testowego, wchodzi antygen (drobnoustroje żywe lub zabite, ewentualnie ich wyciągi), badana surowica inaktywowana, tzn. pozbawiona dopełniacza (ogrzewanie w temperaturze 56°C przez 30 minut), oraz świeża surowica świnki morskiej jako źródło komplementu.

Jeżeli zwierzę ma w surowicy przeciwciała, wówczas wiążą one swoisty antygen, a powstały kompleks immunologiczny przyłącza w całości dopeł­niacz. Zużycie dopełniacza w tym układzie może być wykazane po dodaniu drugiego systemu wskaźnikowego.

Układ wskaźnikowy zawiera zawiesinę czerwonych krwinek barana oraz tzw. amboceptor hemolityczny, tj. inaktywowana surowicę królika uodpor­nionego krwinkami barana.

W przypadku związania dopełniacza w pierwszym układzie, uczulone krwinki układu wskaźnikowego nie ulegną lizie, natomiast liza krwinek w drugim układzie świadczy o braku swoistych przeciwciał w badanej suro­wicy układu testowego.

Przed nastawieniem odczynu wiązania dopełniacza, składniki obu ukła­dów, tzn. antygen, dopełniacz, zawiesina krwinek oraz amboceptor hemo­lityczny muszą być dokładnie wymiareczkowane. Dodanie ściśle określonej

ilości dopełniacza ma znaczenie zasadnicze; nadmiar komplementu będzie powodował zawsze rozpuszczenie krwinek, natomiast zbyt mała jego dawka wywoła niekompletną hemolizę.

Pewną trudność, spotykaną przy OWD, stanowi antykomplementarne działanie antygenu lub badanych surowic, polegające na nieswoistym wią­zaniu dopełniacza, a także prokomplementarność surowic trzody chlewnej, przejawiająca się nieswoistym wzmaganiem aktywności hemolitycznej do­pełniacza.

Odczyn wiązania dopełniacza znajduje szerokie zastosowanie w diagnos­tyce chorób zakaźnych (bruceloza, nosacizna, choroba pęcherzykowa świń), oraz w określaniu serotypów poszczególnych drobnoustrojów (wirus prysz­czycy, wirus osutki pęcherzykowej świń). W diagnostyce serologicznej bru­celozy OWD jako tzw. odczyn Holta służy niekiedy do wykrywania anty­genu w badanym materiale (np. w zawartości żołądka poronionego płodu) przy użyciu wzorcowej brucelozowej surowicy odpornościowej.

Modyfikacje odczynu wiązania dopełniacza. Spośród różnych modyfikacji OWD na uwagę zasługują pośredni odczyn wiązania dopełniacza i odczyn konglutynacji.

Pośredni odczyn wiązania dopełniacza. Odczyn ten stosuje się przy badaniu surowic ptaków, które po związaniu się ze swoistym antygenem nic przyłączają dopełniacza, świnki morskiej. Trudność tę rozwiązano wpro­wadzając do odczynu dodatkowy szósty składnik — surowicę odpornościową ssaka, zawierającą swojste przeciwciała dla użytego antygenu (surowica wskaźnikowa). W przypadku obecności w badanej surowicy ptasiej przeciw­ciał dochodzi do połączenia ich z antygenem. Kompleksy te nie wiążą jednak dopełniacza, który przechodzi do układu drugiego wywołując liżę krwinek barana.

Przy braku swoistych przeciwciał w testowanej surowicy ptasiej, antygen zwiąże się z przeciwciałami surowicy wskaźnikowej i przyłączy dopełniacz. Wobec braku dopełniacza w układzie drugim nie nastąpi hemoliza krwinek.

Odczyn konglutynacji. Podobnie jak OWD odczyn konglutynacji składa się z dwóch układów, z tym że:

1. Zamiast surowicy świnki morskiej jako źródła dopełniacza używa się świeżej surowicy końskiej zawierającej niekompletny dopełniacz;

2. W drugim układzie, miejsce amboceptora hemolitycznego zajmuje normalna surowica bydlęca, zawierająca tzw. konglutyninę wykorzystywaną jako wskaźnik wiązania niekompletnego dopełniacza.

Odczyn ten znajduje zastosowanie przy badaniu surowic źrebnych kla­czy, osłów i mułów, które często w klasycznym OWD wykazują właściwości antykomplementarne. Zastosowanie niekompletnego dopełniacza zapobiega nieswoistemu wiązaniu go przez badane surowice. Jeżeli w surowicy badanego zwierzęcia są obecne przeciwciała, wiążą one antygen i dopełniacz. Krwinki układu wskaźnikowego nie ulegają wówczas agregacji. W przypadku braku

swoistych przeciwciał w badanej surowicy (zwierzę zdrowe), niezwiązany dopełniacz z pierwszego układu przechodzi do układu drugiego, wywołując wraz z kongłutyniną silną aglutynację krwinek barana.

Konglutynina nie jest immunogłobuliną, ale jest normalnym, cieplosta-łym składnikiem surowicy bydlęcej; surowice człowieka i innych zwierząt nie zawierają konglutyniny.

Odczyny neutralizacyjne

Odczyny neutralizacyjne polegają na badaniu działania ochronnego surowic odpornościowych in vivo lub in vitro.

Odczyn ochronny in vivo przeprowadza się na zwierzętach doświadczal­nych, którym podaje się różne dawki surowicy odpornościowej, a potem jed-

naknwą dawkę zarazka lub toksyny. Sztuki kontrolne otrzymują jedynie drobnoustrój lub toksynę.

Ocena wyników polega na codziennej obserwacji zwierząt i notowaniu zejść śmiertelnych. Giną zwierzęta kontrolne i te, które otrzymały zbyt małą dawkę surowicy.

Odczyn ochronny służy do oceny wartości terapeutycznych i profilaktycz­nych badanych surowic odpornościowych.

Odczyny neutralizacyjne in uitro. Odczyny tego typu przeprowadza się w dwóch kolejnych etapach. Najpierw miesza się antygen (toksyny, bakterie, wirusy) ze swoistą surowicą odpornościową i pozostawia w temperaturze 37°C przez 1-2 godziny. Następnie podaje się zobojętniony antygen zwierzę­tom doświadczalnym, zarodkom kurzym lub wprowadza się do hodowli komórek.

Odczyny neutralizacyjne można wykonać dwoma metodami:

1. Seryjne rozcieńczenia badanej surowicy odpornościowej miesza się ze stałą dawką zarazka lub toksyny;

2. Seryjne rozcieńczenia zarazka lub toksyny miesza się ze stałą dawką surowicy.

Pierwszą metodę stosuje się zwykłe przy ocenie wartości ochronnej suro­wic, druga służy do oceny stopnia pokrewieństwa badanych wirusów. Na podstawie stopnia zobojętnienia przez daną surowicę dwócłi szczepów tego samego wirusa wnioskuje się o ich budowie antygenowej.

Testy neutralizacyjne wymagają z reguł}' mianowania wirusa, celem ścisłego określenia jego zakaźności. Zakaźność można ocenia?? na zwierzę­tach lub zarodkach kurzych, obliczając ID50 (ID — dawka infekcyjna), tj. dawkę powodującą w określonych warunkach śmierć 50% zakażonych zwierząt. iYlożna ją również oznaczyć in nitro, określając dawkę powodują­cą zmiany cytopatyczne (destrukcję komórek) wykazaną w 50% probó­wek 7. hodowlą komórkową, zakażoną określonym rozcieńczeniem wirusa (TCID50).

Testy neutralizacyjne przeprowadzane w hodowli komórek są szczególnie użyteczne, jeżeli wirus posiada właściwości wywoływania zmian cytopatyez-nych lub toż zdolności hemadsorbcji erytrocytów.

Odczyn seroneutralizacji

Udczyn znajduje zastosowanie m. in. do identyfikacji wirusów o właści­wościach cytopatycznych. Zasada odczynu polega na zmieszaniu badanego materiału zawierającego wirus ze znaną surowicą odpornościową; po wstępnej inkubacji w 37°C przez 60-90 minut wprowadza się taką zawiesinę do ho­dowli komórek.

W przypadku zobojętnienia wirusa przez swoiste przeciwciała nie docho­dzi do powstania zmian cytopatycznych w hodowli.

Kontrolę odczynu stanowi hodowla komórek zakażona badanym ma­teriałem (bez dodatku surowicy odpornościowej), wykazująca typowy efekt cytopatyczny.

Odczyn hamowania hemadsorpcji

Niektóre wirusy namnażając się w hodowli komórek powodują zjawisko hemadsorpcji. Polega ono na przyleganiu krwinek czerwonych do zakażo­nych komórek. Hemadsorpcja ulega zahamowaniu, jeżeli antygen uprzednio został zobojętniony przez swoiste przeciwciała. Metoda ta znajduje zastoso­wanie przy identyfikacji wirusów nie mających właściwości cytopatycznych.

Odczyn redukcji liczby łysinek

Test ten stanowi jeden z wariantów odczynu seroneutralizacji. Łysinki są wynikiem lokalnego namnażania się wirusa i wywoływania lizy w jedno­warstwowej hodowli komórek w miejscach zaadsorbowania się zarazka. Po zobojętnieniu wirusa przez swoiste przeciwciała, liczba wytwarzanych łysinek ulega redukcji. Im wyższe miano przeciwciał w badanej surowicy, tym mniejsza liczba wytworzonych łysinek.

---