34. Czynniki biotyczne: drobnoustroje (definicja, czynniki wpływające na hodowlędrobnoustrojów, metody namnażania) i enzymy (definicja, właściwości, podział, schemat działania, nazwy klas głównych, czynniki wpływające na szybkość reakcji enzymatycznej).

DROBNOUSTROJE:

Mikroorganizmy (drobne, zwykle jednokomórkowe organizmy widoczne pod mikroskopem. Należą do nich bakterie, pierwotniaki, wirusy, liczne glony, niektóre grzyby) wykorzystywane w wielu gałęziach biotechnologii.

Głównym źródłem mikroorganizmów są: środowisko naturalne oraz kolekcje czystych kultur.

• METODY NAMNAŻANIA:

Metody izolacji drobnoustrojów polegają na ich namnażaniu w warunkach faworyzujących kultury o pożądanej charakterystyce.

Hodowla wzbogacająca rozpoczyna się od kultury mieszanej i tworzy warunki korzystne dla wzrostu pożądanego mikroorganizmu poprzez dodatek odpowiedniego substratu promocyjnego lub inhibitora. Warunki selekcji można powtarzać przez wielokrotne przesiewanie kultury mikroorganizmów na świeże podłoże.

Wygodną techniką jest hodowla ciągła stwarzająca warunki preferencyjne dla kultur szybko rosnących w danych warunkach. W ten sposób można uzyskać szczepy, które będą wykorzystywane w procesach ciągłych. Często hodowla ciągła prowadzi do otrzymania stabilnej kultury mieszanej (formy symbiotyczne).

Do izolowania niektórych producentów enzymów stosuje się odpowiednią pożywkę selekcyjną, zawierającą substrat dla enzymu. Technika ta ułatwia często selekcję właściwych kolonii drobnoustrojów dzięki obserwacji stanu podłoża wokół kolonii. Dobór właściwych metod skaningowych może decydować o powodzeniu w uzyskaniu odpowiednich kultur.

Istotnym etapem skriningu drobnoustrojów jest wstępne opracowanie warunków biosyntezy określonego metabolitu, takich jak: skład podłoża fermentacyjnego, parametry hodowli i innych.

Podłoża hodowlane dla drobnoustrojów:

Podłoża dla drobnoustrojów muszą spełniać określone warunki ( odpowiednia wartość odżywcza, optymalny odczyn pH oraz całkowita jałowość ). Skład chemiczny musi być dostosowany do wymogów życiowych. Musi zapewniać dostateczną wilgotność, przyswajalne źródło energii i a niekiedy również określone czynniki wzrostowe.

Rodzaje podłoży, podział:

Ze względu na charakter składników i pochodzenie:

• Podłoża naturalne- zawierają podstawowe składniki odżywcze i energetyczne, a także czynniki wzrostowe. Skład chemiczny tych podłóż nie jest dokładnie znany. Należą tu bulion mięsny, brzeczka sodowa, mleko.

• Podłoża syntetyczne- mają ściśle określony skład chemiczny( jakościowy i ilościowy). Często używane są również podłoża syntetyczne z dodatkiem wyciągów z tkanek roślinnych i zwierzęcych dostarczających głównie czynników wzrostowych. Podłoża takie określane są, jako półsyntetyczne.

Ze względu na konsystencje:

• Podłoża płynne- są podłożami namnażającymi i pozwalającymi na szybki przyrost ilości komórek i masy drobnoustrojów.

• Podłoża stałe- mogą mieć naturalną konsystencję stałą lub można je otrzymać przez zestalenie podłóż płynnych poprzez agar czy żelatynę.

Agar- jest substancja polisacharydową otrzymywaną z glonów morskich. Posiada on właściwości żelujące i jest korzystnym podłożem zestalającym podłóż płynnych. Stałe podłoże agarowe umożliwiają hodowlę drobnoustrojów w szerokim przedziale temperatur.

Żelatyna- jest otrzymywana przez wodną ekstrakcję niektórych odpadów mięsnych bogatych w kolagen. Umożliwia hodowlę drobnoustrojów w znacznie mniejszym przedziale temperatur niż agar.

• Podłoża proste- służą do hodowli drobnoustrojów o niskich wymaganiach odżywczych. Mogą one stanowić podłoża wyjściowe do sporządzania podłóż złożonych.

• Podłoża złożone- oprócz podstawowego składu chemicznego zawierają substancje wzrostowe, niekiedy specjalne źródła węgla czy azotu lub inne specyficzne związki chemiczne.

Do podłóż złożonych należą:

• Podłoża selektywne- ( wybiórcze), oprócz składników odżywczych zawierają dodatkowy związek chemiczny o działaniu wybiórczo hamującym na wzrost jednych a umożliwiające wzrost innych drobnoustrojów. Podłoża takie pozwalają na izolację czystych kultur pożądanych drobnoustrojów z materiału zawierającego mieszaninę gatunków.

• Podłoża różnicujące- zawierają dodatek określonych substancji umożliwiających identyfikację określonych gatunków drobnoustrojów.

• Stosowane są również podłoża wybiórczo- różnicujące. Do czynników wybiórczo- różnicujących należą niektóre sole mineralne, sole kwasów organicznych, barwniki pH podłoża.

Hodowle drobnoustrojów można prowadzić na podłożach płynnych (hodowla okresowa lub ciągła) i stałych.

• Wzrost drobnoustrojów w hodowli okresowej (stacjonarnej):

Drobnoustroje wprowadzone do podłoża przez pewien czas rozmnażają się intensywnie. Jednak wskutek wyczerpania się przynajmniej jednego zasadniczego składnika pokarmowego lub kiedy istnieje wystarczająca ilość składników pokarmowych, a w podłożu znacznie wzrasta stężenie produktów przemiany materii działających toksycznie, wzrost drobnoustrojów ulega zahamowaniu, a nawet może dojść do całkowitego wyginięcia komórek. W hodowli okresowej uwidacznia się zatem zamknięty cykl rozwoju populacji.

• Wzrost drobnoustrojów w hodowli ciągłej:

Hodowla ciągła polega na utrzymywaniu w długim okresie czasu logarytmicznej fazy wzrostu. Utrzymywanie wykładniczego wzrostu może trwać przez czas nieograniczony pod warunkiem, że nie dopuści się do wytworzenia w środowisku warunków obniżających szybkość wzrostu.

• Wzrost drobnoustrojów na podłożach stałych:

Drobnoustroje rosnące na podłożach stałych tworzą charakterystyczne skupienia dużych ilości komórek, zwane koloniami. Podłoża stałe nie umożliwiają drobnoustrojom swobodnego przemieszczania się, jak to ma miejsce w pożywkach płynnych, i powstające w wyniku kolejnych podziałów olbrzymie ilości komórek zajmują ograniczoną przestrzeń.

• CZYNNIKI WPŁYWAJĄCE NA HODOWLĘ DROBNOUSTROJÓW:

Drobnoustroje, podobnie jak inne organizmy żywe, podlegają wpływowi wielu zewnętrznych czynników środowiska. Należą do nich między innymi: temperatura, różne rodzaje promieniowania, ciśnienie osmotyczne, pH środowiska, potencjał oksydo-redukcyjny i inne.

Różne czynniki mogą działać stymulująco na wzrost, mogą go hamować lub powodować śmierć organizmu. Zależy to od specyfiki, dawki, stężenia, czasu działania czynnika a także od rodzaju drobnoustrojów i ich wrażliwości na oddziaływanie danego czynnika.

Nie wszystkie drobnoustroje jednakowo reagują na określony czynnik.

• Temperatura:

Poszczególne grupy drobnoustrojów wykazują duże zróżnicowanie wymagań i tolerancji w stosunku do temperatury. Temperatura jest jednym z najważniejszych czynników środowiskowych warunkujących procesy życiowe drobnoustrojów. Czynnik ten oddziaływuje na organizmy bezpośrednio wpływając na szybkość wzrostu, aktywności enzymów, skład chemiczny komórek, wymagania pokarmowe.

Podział mikroorganizmów z punktu widzenia temperatur sprzyjających rozwojowi

GRUPA	ZAKRES TEMPERATUR [C]
		Minimalnych	Optymalnych	Maksymalnych
Psychrofilne: *obligatoryjne *fakultatywne	4	20-22	28
Mezofilne	20	37	40-45
Termofilne *obligatoryjne *fakultatywne *ekstremalne	20-45	40-60 >40 >80	60-98

Nadmierny wzrost temperatury powoduje poważne obniżenie efektywności procesu biosyntezy na skutek zwiększonego zużycia źródła energii na oddychanie, spadku wydajności produktu, powstawania produktów ubocznych..

Wzrost temperatury powyżej maksymalnej zawsze powoduje śmierć organizmów przy czym czas w którym komórka ginie jest tym krótszy, im wyższa jest temperatura .

Wysoka temperatura działa niszcząco na:

- aktywność biologiczną wszystkich części komórki

- białka kwasy nukleinowe ulegają dezaktywacji

Przyczyna śmierci cieplnej jest uszkodzenie błony cytoplazmatycznej w wyniku czego następuje liza i wypływ z komórki podstawowych składników niezbędnych do życia .

• Ciśnienie osmotyczne:

Ciśnienie osmotyczne wewnątrz komórek drobnoustrojów jest z reguły wyższe niż w otoczeniu.

Optymalne warunki osmotyczne wzrostu dla drobnoustrojów zapewnia środowisko 0,85% NaCl.

• Osmofile - wykazują zdolność do wzrostu na podłożach zawierających w dużym stężeniu sacharozę.

• Halofile - bakterie rosnące na podłożach zawierających powyżej 10 % NaCl.

Nadmierne obniżenie się ciśnienia osmotycznego w środowisku (środowisko hipotoniczne) powoduje intensywne przenikanie wody do wnętrza komórki. Niekiedy błony komórek nie wytrzymują silnego napięcia wywołanego nadmiernym ciśnienia wewnątrz komórki i następuje pęknięcie błon określane jako plazmoptyza.

Jeżeli drobnoustroje znajdują się w środowisku hipertonicznym wówczas zachodzi zjawisko plazmolizy, tj. odwodnienia cytoplazmy. Protoplast kurczy się wskutek utraty wody i procesy zostają zahamowanie.

Stężenie soli powyżej 5-7% lub cukru powyżej 40-60% powoduje nadmierny dla procesów życiowych większości drobnoustrojów wzrost ciśnienia osmotycznego.

• Potencjał oksydacyjno- redukcyjny:

Wyraża się wartością Eh określającą zdolność układu do oddawania lub przyjmowania elektronów.

Wartość Eh większości podłoży stosowanych dla drobnoustrojów tlenowych przy pH 7 oraz dostępie tlenu waha się do =0,2 do 0,4 wolta. Jeżeli potencjał podłoża obniży się poniżej 0,2wolta organizmy tlenowe nie mogą się rozwijać.

Pod względem zapotrzebowania na tlen bakterie dzielimy na:

• Aeroby (tlenowce) - rozwijające się w obecności tlenu (Eh +0,2 - +0,4 V)

• Względne beztlenowce - rosnące dobrze przy obniżonym Eh, ale również zdolne do wzrostu przy dodatnim potencjale red-oks

• Anaeroby ( beztlenowce bezwzględne) - nie rosną w obecności tlenu, rozwijaja się dobrze przy Eh poniżej - 0,2 V.

Tlen należy do kluczowych czynników kształtujących warunki rozwoju drobnoustrojów, decyduje o możliwości występowania lub braku ich wzrostu, wpływa na szybkość wzrostu i plon biomasy oraz na fizjologię komórek, a więc na rodzaj, wydajność i szybkość produkcji określonych metabolitów.

• Fale ultradźwiękowe:

Wywierają silne działanie niszczące na układy biologiczne. Polega ono na powstawaniu w płynie, a tym samym w cytoplazmie drobnoustrojów pęcherzyków gazu, które mechanicznie rozsadzają struktury komórkowe - jest to tzw. zjawisko kawitacji.

Fale ultradźwiękowe o częstości powyżej 20 000 Hz/s bardzo silnie oddziałują na żywe bakterie. Bardziej podatne na działanie ultradźwięków są bakterie Gram-ujemne niż Gram-dodatnie, z uwagi na różnicę w budowie ściany komórkowej.

• Uwodnienie środowiska:

Wszystkie drobnoustroje wymagają do swojego rozwoju środowiska zawierającego wodę. Dostępność drobnoustrojów do wody jest uzależniona od oddziaływań absorpcyjnych- w odniesieniu do wody zaabsorbowanej na powierzchni ciał stałych.

Dostępność wody charakteryzowana jest za pomocą aktywności wodnej a_w odpowiadającego prężności pary wodnej w otaczającej fazie gazowej :

a_{w =} p_w/p^o_w

gdzie : p_w- prężność równowagowa pary wodnej nad roztworem

p⁰_w- prężność równowagowa pary wodnej nad czystą wodą

Zmiana wilgotności względnej powietrza od 0 do 100 % odpowiada zmianie aktywności wodnej od 0 do 1.

Substancje rozpuszczone w wodzie obniżają jej aktywności w różnym stopniu, zależnie od:

-stężenia

- stopnia dysocjacji

-stopnia hydratacji

Drobnoustroje kserofilne - drobnoustroje, które mogą wyrastać w środowisku o obniżonej aktywności wodnej.

Większość drobnoustrojów wymaga do swojego rozwoju aktywności wodnej w zakresie 0,95-0,99. Minimalne wartości a_w przy których drobnoustroje mogą się rozmnażać zawierają się w granicach 0.60-0,98,zależnie od gatunku szczepu.

Pleśnie i drożdże wykazują większą tolerancję na odwodnienie niż bakterie.

Wyjątek stanowią bakterie halofilne rozwijające się przy a_w=0,75

• pH środowiska:

Należy do podstawowych parametrów fizykochemicznych decydujących o warunkach rozwoju drobnoustrojów.

• Neutrofile - drobnoustroje rosnące najlepiej w środowisku o wartości 6,5-7,5 pH

• Acydofile- drobnoustroje rosnące najlepiej w środowisku o wartości 2,0-5,5 pH (kwasolubne)

• Alkafile - drobnoustroje rosnące najlepiej w środowisku o wartości 8,0-11,0 pH (zasadolubne)

Początkowa wartość pH podłoża hodowlanego zależy od jego składu chemicznego, natomiast w czasie procesu biologicznego mogą zachodzić znaczne nieraz zmiany pH wynikające z charakteru metabolizmu i fizjologii drobnoustrojów. Zmiany są w dużym stopniu zależne również od stopnia zbuforowania środowiska.

Utrzymanie właściwego stałego lub zróżnicowanego pH w czasie trwania procesu mikrobiologicznego jest możliwe przez:

-dodatek do podłoża węglanu wapniowego neutralizującego kwasy

- automatyczną regulacje pH przez dozowanie amoniaku, mocznika, wodorotlenku sodowego

-dodatek kwasu siarkowego w wypadku neutralizacji substancji alkalicznych

• Napięcie powierzchniowe:

Napięciem powierzchniowym określamy siłę utrzymującą daną ilość płynu na określonej powierzchni. Związki obniżające napięcie powierzchniowe wpływają na wzrost drobnoustrojów w hodowlach płynnych lub w środowisku naturalnym.

Wzrost powierzchniowy wykazują drobnoustroje zawierające na swojej powierzchni dużą ilość lipidów, bakterie hodowane na podłożach wzbogaconych węglowodanami lub glicerolem. Rosną one w postaci błonki utrzymywanej przez siły napięcia powierzchniowego.

Czynniki obniżające napięcie powierzchniowe dodane do hodowli w większych ilościach zaburzają proces podziału komórek drobnoustrojów, co prowadzi do powstania form wydłużonych lub rozgałęzionych, a także do zahamowania wzrostu. Substancje obniżające napięcie powierzchniowe dzielimy na:

• anionowe (np. mydła) - działają bójczo na drobnoustroje Gram-dodatnie

• kationowe - działają bójczo na drobnoustroje Gram-ujemne

• substancje niejonowe - nie działają szkodliwie na bakterie

• Wpływ kationów i anionów na drobnoustroje:

Metale o niskim ciężarze cząsteczkowym są mniej toksyczne od metali ciężkich, kationy dwuwartościowe są bardziej toksyczne niż jednowartościowe.

Najbardziej toksyczne aniony to: Cr₂O₇^2-, JO^4-, najmniej zaś: SO₄^2-, PO₃^-. Wśród kationów najmniejszą toksycznością odznaczają się Na⁺, K⁺ i NH₄⁺, najbardziej zaś szkodliwymi są metale ciężkie Hg, Cd i Pb. Metale ciężkie działają na błonę cytoplazmatyczną, a także wiążą i inaktywują enzymy.

Działanie tych jonów zależy także od obecności w środowisku innych substancji. Najsilniejsze ich oddziaływanie obserwujemy w środowisku ubogim w substancje odżywcze, zwłaszcza białka.

---