Surowce i materiały w biotechnologii
Wymierne produkty procesów biotechnologii
Biomasa organizmów
Metabolit, np. aminokwas alfa-glutaminianowy
Metabolit wtórny np. penicylina
Transformacja – zamiana jednego substratu w drugi
Media hodowlane muszą zapewniać:
Maksymalną wydajność biomasy i produktu
Maxymalne stężenia produktu i biomasy
Maxymalną szybkość wytworzenia produktu
Minimum efektów ubocznych
Taniość i dostępność przez cały rok
Minimum trudności technologicznych
Składniki podłoża:
Woda
- odpowiedni skład mineralny
- dostępność w dużych ilościach
- czystość chemiczna i mikrobiologiczna
Źródła węgla i energii
- węglowodany – roczne zużycie jako składnika podłoża 30 mln ton – podstawowe źródło węgla
- glukoza – dobrze rozpuszczalna w wodzie, łatwo przyswajalna przez mikroorganizmy, czysty produkt końcowy, duża wydajność, powstaje podczas enzymatycznej lub kwasowej hydrolizy skrobi ziemniaczanej lub kukurydzianej, proszek, pasta albo syrop
- sacharoza – glukoza + fruktoza, jej źródłem jest melasa, wykorzystuje się w większości procesów
- melasa - produkt odpadowy w produkcji cukru z buraków cukrowych oraz trzciny, brązowy, gęsty syrop 50% to sacharoza, konsystencja i skład zależy od techniki produkcji cukru i jakości zbioru, mono- i disacharydy, przeważnie trzeba ją dostosować do konkretnego procesu, aby mogła być w podłożu, a to przez substancje niecukrowi, które zawiera, produkcja drożdży, kwasu cytrynowego, etanolu, azotu, aminokwasów, lotnych kwasów organicznych, związków wapnia, posiada właściwości buforujące, produkcja drożdży i etanolu – neutralizacja CaCO3, gromadzenie w środowisku kwaśnym, zasadowym; oddzielenie osadu i fermentacja tego, co zostało. Kwas cytrynowy + cyjanek żelazo-potasowy, potem dodanie pirosiarczanów lub wodorosiarczanów, które redukują złe działanie cyjanków (fermentacja kwasu cytrynowego)
Laktoza
Musi być używana w dużych ilościach np.: serwatki
Serwatka jako główne źródło laktozy
Produkowana przez Bacillus subtilis (proteazy serynowe)
Serwatka otrzymywana podczas produkcji serów z mleka (słodka pH=6) i twarogów (kwaśna pH=4)
Stosowana do produkcji drożdży paszowych i etanolu
Płynna, suszona, liofilizowana, odbiałczana
Zwana cukrem mlecznym
Laktoza jest słabo przyswajalna przez mikroorganizmy
W serwatce: His, Val, Leu, Asp, Ala, Tre, wit A, cholina
Maltoza
Hydroliza skrobii I glikogenu
Stanowi główny mechanizm napędowy drożdży w browarnictwie (słód, ekstrakt słodowy)
Cukier słodowy
Skrobia
Stosowana w postaci czystej (proszku) lub składnika np. ziemniaka
Polisacharyd
Ziemniaki, zboże, syrop
Wykorzystywana w produkcji etanolu, butanolu, acetonu.
Stosuje się upłynnioną postać (po podgrzaniu), bo wyciągnięta z rośliny jest w formie granulek.
Insulina
Substancja zapasowa np..: cykoria, Jeruzalem atrychotem (16% całości materiału zapasowego)
Liniowy polimer fruktozy i glukozy (80:20)
Rozpuszczalna w wodzie
Nie daje niebieskiego zabarwienia z jodem
Właściwości redukujące
Produkcja etanolu (frakcja)
Musi być proces wspomagany enzymatycznie – hydroliza enzymatyczna, przez insulinazę (powstaje lewulina + fruktoza =>fermentacja drożdży)
Celuloza
Odpady przemysłowe, rolne, np.: papier, słoma, łodygi, odpady rolne niewykorzystywane
Zbudowana z reszt glukozy (wiązanie beta-1,4-glikozydowe)
Występuje w ścianie komórkowej roślin
Celuloza – ligniny + hemicelulozy (to lignina stanowi problem wykorzystaniem odpadów)
Polisacharydy otrzymane z wodorostów morskich – karaginiany, alginiany, agary. Nie stanowią źródła węgla.
b. źródła niesacharydowe
Alkohole (etanol, metanol)
Do produkcji białka paszowego przez Methylophilis methylitropus
Produkowany z gazu naturalnego i nafty (czystość 99,8%)
Inni producenci SCP (białka z pojedynczej komórki, np.: drożdże)
Biosynteza B12 (Pseudomonas), alfa-seryna (Altobacter globiformis), L-Leu, Val (Alkaligenes eutrofen)
Glicerol
Bezbarwna, oleista ciecz
Łatwo miesza się z wodą
Produkowany przez hydrolizę tłuszczy lub z polipropylenu z ropy naftowej (syntetycznie)
Wykorzystywany do produkcji erytromycyny (Artrobacter), steroidów (Mycobacterium), dihydroksyacetonu (Acetobacter)
Tłuszcze
Synteza antybiotyków i sterydów
Olej bądź mąka (Soypan, Nurupan)
Produkcja lipazy, amylazy, proteazy
Standaryzowana ilość lecytyny (60-65%)
Jako samodzielne źródło węgla bądź dodatek do sacharydów.
Węglowodory
Metan jest zawsze zanieczyszczony siarką
Szczepy Methylomonas – otrzymywanie SCP jako białka paszowego
N-butan, jego utlenienie powoduje powstanie mieszaniny estrów, ketonów, aldehydów i kwasów, kwas cytrynowy, Candida, Saccharomyces, SCP
Substancje gazowe
CO, CO2, H2 – białka paszowe, źródła różnych pierwiastków
Kwasy karboksylowe
Produkcja alfa-Lys, alfa-Glu, alfa-Ile, Thr (Bredibacterium, Corynebacterium, Micrococus)
Białko paszowe (Candida utilis), kwas octowy + alkohol syntetyczny
Alfa-Glu – glukoza + kwas teinowy, linolenowy
Prodigiozyna – kwas oleinowy
Kwas octowy + glukoza + melasa + hydrolizat białkowy = produkcja tych aminokwasów
c. źródła azotu – ważniejsza funkcja niż źródło węgla (regulacja pH pożywki)
- sole amonowe (grzyby niższe) NH4SO4, NH4OH, NH3 – regulacja pH
- azotany, azot atmosferyczny
- mocznik – wrażliwy na temperaturę
- lepszy azot organiczny niż nieorganiczny
- mąki:
Sojowa – dużo Glu, mało Met, Cys, synteza streptomycyny przez Streptomyces griseus, inne antybiotyki, sterydy, podpuszczka mikroorganizmów
Bawełniana – Pharmamedia, Profila, składni – gassypol – antyutleniacz, eliminuje złe działanie utlenionych kwasów tłuszczowych (pieniacze), zwiększenie wydajności
Kukurydziana – biosynteza chlorotetracykliny, biomy cyny, amylazy glukonowej, proteaz (C i N).
- preparaty białek ziemniaka – produkcja enzymów i antybiotyków, Alburex – proces ekstrakcji skrobi, stosowany w produkcji antybiotyków i enzymów, gdzie zastępują mąkę sojową.
- mamok – nalot kukurydziany – zależy od ilości kukurydzy i technologii ekstrakcji skrobi kukurydzianej. Zawiera aminokwasy, witaminy, sole mineralne. Produkt uboczny otrzymywania w procesie ekstrakcji skrobi kukurydzianej. Może mieć małą jakość Solulys alfa. Wykorzystywany do produkcji izomerazy glukonowej przez Etinoflamens. Wada: różnica składu w zależności od technologii.
- autolizaty drożdżowe i suszone – źródło witamin z grupy B i N
- hydrolizaty białek zwierzęcych i roślinnych – proszki, roztwory, np.: hydrolizat kazeiny ze sterydów, antybiotyków.
- żelatyna – zawiera dużo Gly, Ala, a Małoty, Phe, nie zawiera Trp, wykorzystywana do produkcji żelatynazy i kalogenazy.
d. inne makroelementy
- tlen – sterylny : powietrze, u beztlenowców wystarcza to co jest w źródle C.
- fosfor – sole nieorganiczne (fosforan potasu, amonu, Mg, NH4, fosforan glicerolu). Zapotrzebowanie rośnie w miarę fermentacji
- siarka – SO42- , siarczan amonu
- potas – K2SO4, K2HPO4, KH2PO4
- magnez – MgSO4 * 7H2O
e. mikroelementy
- Mn2+, Zn2+, Fe3+, wyjątek Lactobacillus
- Cu, Co, Mo, Na, Cl, Ni, Se – zależy od środowiska
f. stymulatory wzrostu
- witaminy z grupy B (biotyna, tiamina)
- alfa-aminokwasy
- związki purynowe i pirymidynowe
g. detergenty
polepszenie wydajności biomasy z n-alkanów, aminokwasów, kwasów organicznych.
h. odpieniacze
- pożądane cechy dobrego odpieniacza:
Szybkie rozbicie piany
Zabezpieczenie przed ponownym powrotem piany
Aktywność w małych stężeniach
Nietoksyczność
Łatwy w stosowaniu
Niepolarny
Nielotny
Niska cena
Naturalne: olej słonecznikowy, kwas olejowy, tran
Syntetyczne: silikony, polipropyleny
Dla bakterii – silikon
Dla grzybów – lepsze naturalne
Substancje stałe – śruta rzepakowa, otręby pszenne, słoma, sieczka, wylot ki jabłkowe, suszony rozdrobniony chleb razowy
j. antyseptyki – formalina, furozolidyna
k. substancje buforujące – amoniak, wodorotlenek amonu
l. inne – prekursory (kwas fenylooctowy), inhibitory, chelatory (EDTA)
4. ważność pH Klebsiclla aerogenes – własności buforujące
pH 5 – glikol butylenowy
pH 6 – glikol butylenowy + etanol
pH 7 – glikol butylenowy + etanol + mleczan
pH 8 – glikol butylenowy + etanol + mleczan + octan + mrówczan
przez to zmienia się wydajność produkcji
pH powinno wypierać
5. rodzaje pożywek i optymalizacja ich składu
Pożywki mikrobiologiczne:
Stan skupienia
Stałe
Ciekłe
Roztwory rzeczywiste
Emulsje
Koloidy
Zawiesiny
Skład
Nieorganiczne
Organiczne
Naturalne
Syntetyczne
Ciekłe: naturalne i płynne serwatki, melasa, alkany, mleka, ścieki przemysłowe, naturalne płyny ustrojowe, wyciągi wodne z surowców naturalnych, wyciąg z mąki sojowej, bulion
Stałe: plewy, opady stałe, rozdrobnione ziemniaki przeważnie suplementowane pożywką ciekłą.
6. opracowywanie składu pożywki jest zasadniczą fazą w uzyskaniu współczynnika wydajności komórki.
W warunkach wzrostu tlenowego masę źródła węgla oblicza się z:
W = sucha masa komórkowa (g/dm3) / zastosowany substrat węglowy (g/dm3)
Wglukozy = 0,5 dla bakterii z 1 grama glukozy otrzymujemy o.5 grama suchej masy komórkowej.
Dla drożdży: Teoria Fiska – w procesie namnażanie biomasy 1/3 węgla w pożywce jest zużywana na procesy energetyczne, a 2/3 na przyrost biomasy.
Stosunek zawartości C:N:P 6:1:0.2
Źródło azotu i węgla – od tego rozpoczyna się obliczenia
7. sterylizacja
- uzyskanie czystej kultury do szczepienia fermentatora produkcyjnego
- sterylizacja pożywek oraz wszystkich składników dodawanych do fermentatora podczas hodowli
- sterylizacja fermentatora
- utrzymywanie aseptycznych warunków podczas kontroli
Rodzaje:
- sterylizacja termiczna ciągła lub okresowa (gorąca para) – fermentatory
- sterylizacja radiacyjna (promienie UV) – pomieszczenia
- sterylizacja chemiczna (gazy) – pokoje, przewody, np..: H2O2 działa na formy wegetatywne i generatywne, wykorzystywany w przemyśle spożywczym.
- sterylizacja „żywą parą”
- sterylizacja przez filtrację
Nie ma czegoś bardziej lub mniej sterylnego. Coś jest sterylne lub nie.
8. metody prowadzenia procesów
Hodowle:
- okresowe
- ciągłe
- okresowe z ciągłym dozowaniem pożywki
a. hodowle okresowe
Statyczne lub wstrząsane (umożliwia wymianę gazową, rozrost organizmów jednorodnych)
Fazy hodowli
Bakterie: wzrost populacji (liczba kom./cm3*h)
Promieniowce i grzyby – stężenie biomasy (stężenie suchej masy (g/dm3*h))
Badania precyzyjne – stężenie składników komórek związanych ze wzrostem lub ich rozmnażaniem (azot komórkowy, białko, DNA)
Krzywa wzrostu w hodowli okresowej:
- kształt sigmoidalny
- na początku brak hamowania metabolitami i dostępność substratu.
Najszybciej komórki powstają w fazie logarytmicznej, ale dopiero w fazie stacjonarnej komórek jest najwięcej.
Parametry:
Przyrost biomasy
X –różnica biomasy w danym czasie
X = Xmax – X0 [X]=[g]
Wydajność wzrostu – Y – charakterystyka zależności między stężeniem biomasy, a stężeniem substratu.
Y = sucha masa [g] / masa substratu [g]
Molowy współczynnik wydajności Ym=sucha masa/mol
Z niego wynika współczynnik energetyczny YATP.
Jest on zależny od sposobu metabolizowania substratu i od tego, ile energii przetworzą komórki
YATP = informuje ile gram biomasy otrzymujemy z 1 mola ATP.
Właściwa szybkość wzrostu μ – stosunek przyrostu biomasy w przeliczeniu na jednostkę czasu i jednostkę biomasy, która już istnieje, a także odniesieniu do liczby komórek.
μ = 1/x * dx/dT lub μ= 1/N * dN/dT
μ = (log xt – logx0 ) / log (t-t0)
Td= ln2/μ Td – czas podwojenia biomasy
Hodowle ciągłe
Stosowana do produkcji biomasy (np. drożdży) lub w przemyśle farmaceutycznym do biologicznej produkcji związków chemicznych
Stałe zasilanie fermentorów świeżą ilością pożywki i jednoczesny odbiór tej samej objętości płynu hodowlanego
Zasada chemostatu (stała szybkość rozcieńczenia) lub turbidostatu (stałe stężenie biomasy)
Szybkość rozcieńczania hodowli (wielkość stała)
D [1/h] D = F/ν F – natężenie objętościowego przepływu pożywki
W chemostacie μD = Dx
- jeśli przekracza D = biomasa gromadzi się w reaktorze
- jeśli jest mniejsze od D – biomasa wyrywana z reaktora
Stan ustalony – składniki chemiczne, stężenie biomasy i parametry od których zależy stan fizjologiczny komórki = const. Wzrost ma charakter ograniczony. Limitowany tylko natężeniem substratu.
μ = μmax *S / Ks + S
Ks – stała półnasycenia – takie stężenie substratu, przy którym μ osiąga połowę swojej wartości.
Wady: możliwość degradacji szczepów, selekcja osobników o gorszych cechach, biotechnologiczne problemy z czystością mikrobiologiczną, wzrost kłaczkowy mikroorganizmów.
Procesy produkowane ciągle: białko paszowe, etanol, butanol, aceton, kwas organiczny, antybiotyki, oczyszczanie ścieków metodą osadu czynnego.
9. hodowle synchronizowane
Do specjalnych celów, np.: w laboratorium
Komórki w populacji znajdują się zawsze w takiej samej fazie rozwoju osobniczego
Synchronizacja podziałów komórkowych – wydzielenie osobników o jednakowych np.: wymiarach komórek (wirowanie lub sączenie) będących w tym samym stanie fizjologicznym lub morfologicznym (szok cieplny w przetrwalnikach)
10. fermentory = bioreaktory
Służą do hodowli mikroorganizmów
Czasem bioreaktor to reaktor enzymatyczny
Musi tworzyć odpowiednie środowisko (chroni przed zanieczyszczeniami zewnętrznymi), ale także nie może wytwarzać zanieczyszczeń do środowiska
11. bioreaktory do hodowli wgłębnych
Hodowla beztlenowa
Stworzenie środowiska beztlenowego właściwego dla danej hodowli
Mieszanie nie jest konieczne (jeśli występuje to po to, żeby cząsteczki się nie osadzały)
Prosta budowa
Nie ma problemu piany, dlatego podłoża nie muszą być suplementowane odpieniaczami
Fermentacja etanolowa
Browarnictwo
Hodowla tlenowa
Wyposażone w elementy umożliwiające odprowadzenie gazu i jego rozproszenie w fazie ciekłej
Odpowiedni materiał fermentora – stal kwasoodporna polerowana – odporna na korozję i częste sterylizacje
Podział ze względu na sposób dostarczania energii, fermentory o mieszaniu mechanicznym, mieszanie cieczą (woda – muszą posiadać specjalną pompę, trudna sterylizacja), gazem
Istotna rola – koszt napowietrzania
Kontrola parametrów fizycznych i fizykochemicznych
Kontrola natężenia przepływu pożywki – hodowle ciągłe i okresowe z dozownikiem pożywki
Sterowanie: temperatura, pH, stężenie tlenu
Modelowanie procesów bioreaktorowych – relacje pomiędzy różnymi zmiennymi procesowymi i efektem procesu takim jak wydajność czy produktywność
Model wzrostu – formalne równanie podające zależność szybkości przyrostu biomasy od stężenia jednego lub kilku kluczowych substancji oraz warunków hodowli – model bardzo uproszczony
Ujęcie korelacyjne – sztuczne sieci neuronowe – podają wydajność od nieznanych warunków hodowli
12. bioreaktory do hodowli na podłożu stałym
Aparaty o działaniu okresowym
Do produkcji kwasu cytrynowego
Komora ze stałymi warunkami
Jest tam system tac i system odprowadzający powietrze
Odbiera ciepło od komórki, a dostarcza tlen
Na tace wlewa się pożywki z bakteriami, które produkują kwas cytrynowy
Czynnik limitujący – wymiana ciepła i masy między złożem a powietrzem
Cienka warstwa podłoża
Reaktor z grubą warstwą podłoża
W komorze panują odpowiednie warunki
Ruszt z podłożem o grubości 1 metra
Co pewien czas złoże jest wstrząsane, aby nie powstały bryły mikroorganizmów
Powietrze idzie pod ruszt
Reaktor węglowy
Pożywka sypka
Reaktor się obraca, aby nie rozgrzewały się dolne warstwy pożywki
13. bioreaktor z unieruchomionym materiałem biologicznym
Reaktory ze złożem nieruchomym lub cyrkulującym
Dobór metody immobilizacji do typu fermentora
Działanie okresowe lub ciągłe
14. bioreaktory membranowe
Różna wielkość porów
Funkcje membrany, oddzielenie biomasy, wydzielenie produktów, unieruchomienie materiału biologicznego, oddzielenie przestrzeni reakcyjnej
Reaktory mikrobiologiczne lub enzymatyczne
Proces fermentacji mlekowej
15. wydzielenie i oczyszczenie produktów fermentacji
- produkt procesu biotechnologicznego – biomasa lub produkty metabolizmu
- oddzielenie biomasy drobnoustrojów od płynu pohodowlanego, wydzielenie i oczyszczenie produktu
- dobór metody – tak, aby nie doprowadzić do obniżenia aktywności produktów.
16. wydzielanie biomasy
Nie każda substancja daje się wydzielić w ten sam sposób
Flokulacja i sedymentacja
Sedymentacja to metoda rozdzielania zawiesiny
Wstępna obróbka zawiesiny – aglomeracja komórek
Flokulacja odwracalna – neutralizacja ładunku na powierzchni komórki (dodatek elektrolitu)
Flokulacja nieodwracalna – efekt powstania wiązań pomiędzy mikroorganizmami
Flokulacja zależy od temperatury, pH, siły jonowej, właściwości komórek i ich stanu fizjologicznego
Czynniki flokulacyjne – sole nieorganiczne, hydrokoloidy mineralne, organiczne polielektrolity, białka
Flotacja – rozproszenie pęcherzyków gazu i na ich powierzchni absorbują się mikroorganizmy.
Filtracja
Zależy od tego, co obrabiamy (bakterie czy grzyby)
plackowa – cząsteczki stałe zatrzymują się na placku filtracyjnym, który jest wytworzony na przegrodzie filtracyjnej. Wykorzystuje się prasy filtracyjne, próżniowe, filtry obrotowe, filtry taśmowe. Stosowane do wydzielenia grzybni, bakterii poddanych flokulacji (większych)
objętościowa – przebiega podczas przepływu płynu (gazu) przez przegrodę filtracyjną (typu włókniowego). Stosowana do jałowienia powietrza oraz klasyfikacji zawiesin dobnych.
Dynamiczna – dzięki odpowiedniemu ukształtowaniu przepływu zawiesiny cząsteczek odpowiednio dużych rozmiarów nie przechodzą przez przegrodę filtracyjną, tylko zostają w środku
Wirowanie
17. dezintegracja komórek
Cel: zniszczenie struktury komórki oraz wydobycie substancji
Dezintegracja:
Metoda mechaniczna
W fazie ciekłej
Ultradźwięki
Ciśnienie
Mieszanie
W fazie stałej
Rozcieranie
Metody niemechaniczne
Odwadnianie
Suszenie powietrza
Suszenie próżniowe
Rozpuszczalnik
Liza
Fizyczna
Chemiczna
Enzymatyczna
Biologiczna
18. zagęszczanie roztworów
Zagęszczanie termiczne – krótki czas kontroli, aparaty próżniowe
Ekstrakcja
Ultrafiltracja – różnica ciśnień po obu stronach membrany
Odwrócona osmoza – mała masa składników
19. oczyszczanie substancji biologicznej
Krystalizacja
Metody membranowe
Chromatografia
20. suszenie
Podstawowa metoda uzyskania stabilnej formy bioproduktu
Suszenie rozpyłowe (próżniowe, liofilizacja)