Identyfikacja mikroorganizmów
Proces identyfikacji organizmu polega na określeniu przynależności badanego organizmu do organizmu do odpowiedniej jednostki taksonomicznej, najczęściej gatunku.
Szczep referencyjny – izolant danego gatunku opisany jako pierwszy i najlepiej scharakteryzowany
Gatunek – grupa szczepów w tym szczep referencyjny wykazując y co najmniej 70% homologii pełnego genomowego DNA; grupa szczepów różniąca się G+C w genomowym DNA nie więcej niż 3% molowe
dla prokariotów :
- Metody klasyczne: morfologia komórki, skład chemiczny ściany komórkowej, obecność inkluzji komórkowej i substancji zapasowych, zdolność do tworzenia pigmentów, wymagania pokarmowe, skład i ilość produktów fermentacji, stosunek do tlenu, charakterystyka temperaturowa, pH, wrażliwość na antybiotyki, patogenność, środowisko występowania, interakcje z innymi organizmami.
- Metody biologii molekularnej: analiza ilościowa kwasów nukleinowych (% G+C) , homologia kwasów nukleinowych (metoda hybrydyzacji)
dla eukariota:
-metody klasyczne: sposób rozmnażania generatywnego, morfologia komórki, sposób rozmnażania wegetatywnego, cechy hodowlane populacji, tworzenie pigmentu, tworzenie pseudogrzybni/grzybni właściwej, tworzenie ureazy, wymagania pokarmowe, osmotolerancyjność i osmofilność, budowa ściany komórkowej, ekologia, patogenność
- Metody biologii molekularnej: analiza ilościowa kwasów nukleinowych (% G+C) , homologia kwasów nukleinowych
metody biochemiczne:
- określenie zdolności mikroorganizmów do asymilacji, fermentacji, rozkładu zw chemicznych
( cechy biologiczne określa się na podstawie reakcji w odpowiednich pożywkach, odczyt: gapimy się )
metody biofizyczne:
- identyfikacja taksonomiczna przez oznaczanie produktów ich metabolizmu lub wybranych związków wchodzących w skład struktur komórkowych (elektroforetyczne-skład białek charakterystyczny dla danej jednostki taksonomicznej i chromatograficzne-skład kw tłuszczowych ściany kom )
homologia >60% -> gatunek, homologia >20% -> rodzaj
metody immunologiczne: reakcja przeciwko przeciwciałem i antygenem, testy aglutynacyjne , testy immunofluorescencyjne (przeciwciała znakowane barwinkami), testy immunoenzymatyczne (reakcje enzymatyczne), ELISA,
Identyfikacja mikroorganizmów
Proces identyfikacji mikroorganizmów polega na określeniu przynależności badanego organizmu do odpowiedniej jednostki taksonomicznej, najczęściej gatunku.
Szczep referencyjny – izolant danego gatunku, opisany jako pierwszy i najlepiej scharakteryzowany (wzorzec).
Gatunek – grupa szczepów, w tym szczep referencyjny, wykazujący co najmniej 70% homologii pełnego genomowego DNA.
Identyfikacja taksonomiczna bakterii
Gatunek – grupa szczepów różniących się zawartością G+C w genomowym DNA nie więcej niż o 3% molowe.
%G+C = (nG + nC)/(nA + nT + nC + nG) *100%
W obrębie rodzaju różnice w % molowych G+C nie mogą przekroczyć 10%
Klucz Bergey’a dotyczy tylko bakterii!!
Metody klasyczne – Procaryota
- morfologia komórki
- skład chemiczny ściany komórkowej
- obecność inkluzji komórkowych i substancji zapasowych
- interakcje z innymi organizmami
- środowisko występowania
- patogenność
- wrażliwość na antybiotyki
- charakterystyka temperaturowa, pH
- stosunek do tlenu
- skład i ilość produktów fermentacji
- wymagania pokarmowe
- zdolność do tworzenia pigmentów
Metody biologii molekularnej – Procaryota
- analiza ilościowa kwasów nukleinowych (%G+C)
- homologia kwasów nukleinowych
Sekwencja polinukleotydów 16S rRNA
Metody klasyczne – Eucaryota
- sposób rozmnażania generatywnego
- patogenność
- ekologia
- budowa ściany komórkowej
- osmotolerancyjność i osmofilność
- czynniki pokarmowe
- tworzenie ureazy – drożdże
- zdolność do wytwarzania pseudogrzybni lub grzybni
- tworzenie pigmentów
- cechy hodowlane populacji
- sposób rozmnażania wegetatywnego
- cechy morfologiczne komórki.
Metody biologii molekularnej – Eucaryota
Takie same jak u Procaryota
Sekwencja polinukleotydów 18S rRNA
Metody biochemiczne – polegają na określeniu zdolności mikroorganizmów do asymilacji, fermentacji lub rozkładu określonych związków chemicznych.
Cechy biochemiczne określa się na podstawie reakcji chemicznych zachodzących w odpowiednio skomponowanych pożywkach wzrostowych. Wyniki testów biochemicznych odczytuje się makroskopowo:
- wzrost lub jego brak
- reakcja barwna po wprowadzeniu odczynnika reagującego z wytwarzanym metabolitem
- na podstawie reakcji chemicznej
Metody biofizyczne
Umożliwiają one identyfikację taksonomiczną mikroorganizmów przez oznaczanie produktów ich metabolizmu lub wybranych związków wchodzących w skład struktur komórkowych. Wyróżniamy tutaj metody elektroforetyczne i chromatograficzne.
Metody elektroforetyczne – skład białek jest charakterystyczny dla danej jednostki taksonomicznej. Izolacja białek, elektroforeza w żelu poliakrylamidowym – profil białkowy.
Metody chromatograficzne – skład kwasów tłuszczowych ściany komórkowej jest charakterystyczny dla danego gatunku przy zachowaniu kontrolowanych warunków hodowli.
Metody biologii molekularnej
Metody oparte na badaniu homologii kwasów nukleinowych
Metoda hybrydyzacji – sondy genetyczne
Homologia > 60% - przynależność do gatunku
Homologia > 20 % - zgodność z danym rodzajem
Homologia < 5% - organizmy niespokrewnione
Gene Trak (sonda znakowana peroksydazą)
Gene Probe (sonda znakowana estrem akrydynowym)
Metoda PCR
Metody immunologiczne
Metody oparte na reakcji pomiędzy przeciwciałem a antygenem.
Testy aglutynacyjne (identyfikacja bakterii, pleśni), testy immunoenzymatyczne ( wykorzystują reakcje enzymatyczne do uwidocznienia reakcji immunologicznej, cząsteczki enzymu związane są kowalencyjnie z przeciwciałami lub biotyną [peroksydaza chrzanowa, alkaliczna fosfataza]), testy immunofluorescencyjne (wykorzystują przeciwciała znakowane barwnikami fluorescencyjnymi, cząsteczki barwnika przyłączone są do cząsteczek immunoglobulin kowalencyjnie)
Elisa – test bezpośredni
Elisa – test pośredni
Elisa – test podwójnego wiązania „kanapkowy”
Test selekcyjny – podstawowa metoda identyfikacji mikroorganizmów w przemyśle.
W konstrukcji tego rodzaju testów poszukuje się cechy biochemicznej, powiązanej bezpośrednio lub pośrednio ze zdolnością mikroorganizmów do produkcji wybranego bioproduktu.
Obecnie dąży się do opracowania testów selekcyjnych umożliwiających prostą i szybką identyfikację mikroorganizmów o poszukiwanych właściwościach biochemicznych.
Test selekcyjny – poszukiwanie mikroorganizmu odpornego na wysokie stężenie substancji toksycznej – metoda płytek gradientowych.
Z kolonii, które przeszły testy selekcyjne z wynikiem pozytywnym za pomocą posiewu redukcyjnego zostają wyprodukowane czyste kultury, które poddawane są następnie testom fermentacyjnym.
Testy fermentacyjne
Pozwalają na ocenę stopnia przydatności w przemyśle poszczególnych izolantów mikroorganizmów wyselekcjonowanych w testach selekcyjnych.
Ich celem jest wybór mikroorganizmu przeprowadzającego określony proces biotechnologiczny z największą wydajnością pod względem kosztów ekonomicznych związanych z prowadzeniem procesu produkcji wybranego bioproduktu na skalę przemysłową.
- prowadzone są w niewielkich bioreaktorach o pojemności 5-20l
- w testach tych ustala się optymalną metodę hodowli badanego mikroorganizmu
- wybór określonego rozwiązania konstrukcyjnego bioreaktora
- wybór sposobu hodowli (ciągła, dolewana, okresowa)
-
warunki fizyko-chemiczne
- skład pożywki hodowlanej
Identyfikacja
Wybrane na podstawie testów fermentacyjnych mikroorganizmy zostają poddane badaniom mającym ustalić ich przynależność gatunkową.
Promieniowce – Actinobacteria/ Actinomycetales
Rodzaje: Steptomyces, Mycobacterium, Micrococcus
- żyją: gleba, nawozy
-wiążą azot atmosferyczny(niektóre)
- producenci
- wytwarzają:
1) antybiotyki: tetracykliny(Streptomyces), makrolidy, β-laktamy, chloramfenikole, antracykliny, amino glikozydy
2) substancje do fitopatologii (choroby roślin): blastycydyna, polioksyna, ezomycyna, celocydyna, aktydion
3) przeciw przetrwalnikom: kokcydiostatyki, polieterowe
4) Bioinsektycydy : salinomycyna (Streptomyces) , maduromycyna, inhibitory trehalozy (trehazolina izolowana z Micromonospora)
5) enzymy: do mleczarstwa, garbarstwa, biologii molek
6) czynniki imunostymulujące :
-bestatyna (Streptomyces olicerticuli ) ->stymulacja interleukiny ->działanie przeciwrakowe
-diestry trehalozy + kw mikolowe -> adiuwanty (subst. Powodujące pojawienie się odp. Odpornościowej na antygen)
- diestry trehalozy + monofosfolipid A -> działanie synergistyczne(wzajemnego wzmocnienia działania kilku substancji)
- trimikolan trehalozy (Gordonia) -> odp komórkowa i humoralna u myszy
Królestwo – Grzyby (fungi)
Rodzaj- Drożdże (nie stanowią homogennej grupy taksonomicznej)
Klasyfikacja drożdży:
- cechy morfologiczne komórki
- sposób rozmnażania
- cechy hodowlane
- tworzenie pigmentu
- tworzenie spor
- tworzenie pseudogrzybni/grzybni właściwej
- tworzenie ureazy (enzym katalizuje rozkład mocznika )
- asymilacja i fermentacja źródeł C
- asymilacja azotanów
- budowa ściany komórkowej
- % molowy G+C w DNA
TYPY:
1) Ascomycetes (workowce)
- 7 rodzin , najliczniejsza Saccharomycetaceae
- rozmnażanie generatywne(askospory-zarodniki workowe, stąd nazwa), wegetatywne ( pączkowanie wieloboczne, podział komórki)
- formują grzybnię
- nie wytwarzają ureazy (wyj Schizosaccharomyces)
- ściana kom 3 warstwy (glukan, mannan)
-nie tworzą pigmentów
- biomasa na czerwono pod wpływem błękitu diazoniowego
- %G+C= 30-52%
2) basidiomycetes (podstawczaki)
-3 rodziny
- rozmnażanie generatywne(basidiospory), wegetatywne (pączkowanie biegunowe)
-formują grzybnię(dikariotyczną, podzielona septami)
-wytwarzają ureazę
-nie fermentują sacharydów
-ściana kom – budowa lamellarna(struktura tworzące warstwy, między którymi występują obszary puste), (chityna, mannan)
-rzadko tworzą pigmenty
-biomasa na czerwono pod wpływem błękitu diazoniowego
-%G+C = 40-70%
3)deuteromycetes (grzyby niedoskonałe)
-4 rodziny
- nie rozmnażają się płciowo
- cechy charakterystyczne zarówno workowców i podstawczaków
ROZMNAŻANIE:
Pączkowanie
Podział (schizosaccharomyces, endomycetaceae)
Tworzenie artrospor (zarodniki przetrwalnikowe, żyją w szybko zmieniających się warunkach), (trichosporon, dipodascus)
Tworzenie blastospor i balisto spor
Chlamydospory ( twory aseksualne, tylko do przetrwania) (Candida albicans)
Spory: aktywność zależy od wieku drożdży, temperatury inkubacji, kwasowości, składu i natlenienia pożywki; lab: pożywka sporulacyjna (pełen skład, octan sodu zamiast sacharydów); liczba spor zależna od gatunku; kształt typowy dla gatunku (ważne w diagnostyce), odporne na środowisko
HODOWLA
Podłoże płynne – zmętnienie, tworzą błonkę, kożuszek, pierścień
Pożywki zestalone (stałe, with agar)
Czynniki niezbędne:
Woda : zawartość min 30%, pobierają tlen tylko z wody, gatunki halofilne (rosną na podłożu silnie zasolonym (powyżej 10% NaCl)), gatunki osmofilne ( Rosną na podłożu zawierającym w dużym stężeniu sacharozę, stęż glukozy=60%-miód, suszone owoce), gatunki osmotolerancyjne (tolerują duże stężenia soli nieorganicznych (20%), stężenie glukozy=50%- kiszonki, marynaty)
Źródło węgla: organiczne (monosacharydy, disacharydy, tri sacharydy), alkohole (etanol, metanol, etanodiol, glicerol), poliole (rybitol, galacticol), kw. Organiczne, niekonwencjonalne
Źródło azotu: pepton, ekstrakt drożdżowy, brzeczka, sole nieorganiczne (fosforan amonu), aminokwasy
Źródło fosforu: KH2PO4 (buforujący), K2HPO4 (obniża pH)
Wapń, magnez: woda wodociągowa, destylowana suplementowana solami
Witaminy: mezo-inozytol, kw pantotenowy, biotyna, tiamina, pirydoksyna, niacyna
Temp optymalna: 25-28®C, psychrofile (zdolne do życia od -5 do 20C – głębokie jeziora, żarcie w lodówce-Candida psychrofila), termofile (wymaga pow 20C-saccharomyces telluris)
TEORIA FINKA
W procesie namnażania biomasy 1/3 C zużywana na procesy energetyczne, 2/3 na przyrost biomasy
Stosunek C:N:P 6:1:0,2
Rodzaj- Grzyby strzępkowe (pleśnie) (w systematyce to nie rodzaj, ale łatwiej zapisać tak)
-wielokomórkowe
- cudzożywne: saprofity, komensale, symbionty, pasożyty
- charakter oligomorficzny, kosmopolityczny
- organizm tlenowy, chemoorganotrof,
-azot organiczny i nieorganiczny
-termofile, mezofile, psychrofile
- lubią wilgotność (11-14% w powietrzu) i niskie pH (3-5,5)
Morfologia:
Ściana komórkowa: chityna i pochodne (chitozan), polisacharydy nieaminowe, celuloza,glukany,białka,lipidy
Klasyfikacja:
Eumycota
Mastigomycetes
Zygomycetes (sprzężniaki)- np. Rhizopus (gnicie owoców)
Ascomycetes (workowce) - np. Chaetomium (pleśń w domu) , Byssochlamys fulva i B. nivea (rozpad owoców)
Deuteromycetes (grzyby niedoskonałe) – np. Aspergillius(kropidlak), Penicillium (pędzlak) , Fusarium, Botrytis (gronkowiec szary), Alternaria, Cladosporium, Geotrichum
Glaucus, A. Niger => mała zawartość wody
Ochraceus, A. Oryzae, A. Flavus, A.Parasiticus =>zboża, nasiona, orzechy
Niger, A. flavus, A.oryzae => ściany, materiały budowlane
Niger=> produkcja kw. Cytrynowego
- rozmnażanie: wegetatywne, cykl pseudoseksualny, heterokarion (komórka zawierająca co najmniej dwa genetycznie różne jądra.)
P. digitatum (zielona zgnilizna)
P. italicium (niebieska zgnilizna)
P. expansum (mokra zgnilizna)
P. camemberti, P. roquefort ii (sery)
F. solani, F. oxysporum, F.moniliforme, => zboża, fuzarioza (choroba roślin)
B. cinerea => fasola, pomidor, maliny, winogrona, truskawki
A. alternata => w suchym powietrzu
C. herbarium, C.fulvum =>wilgotne powietrze, pomidory
G. candidum => produkty mleczne, ziemia,
Basidiomycetes (podstawczaki)