ZASZCZEPY MIKROBIOLOGICZNE

Charakterystyka wzrostu mikroorganizmów:

- bakterie – podział

- drożdże – paczkowanie

- grzyby – plecha

Pomiary ilości komórek:

- stężenie komórek

- stężenie masy komórek

Są to dwa zasadniczo różniące sie parametry np. zaraz po podziale komórki

bakteryjnej mam dwie komórki, ale są jeszcze małe i ich masą sie nie zmieniła, jest jak masą

jednej komórki. W praktyce mierzy sie zarówno masę i ilość komórek.

Pobieramy próbkę o znanej objętości, robi sie posiew i zlicza sie liczbę komórek lub

liczymy komórki pod mikroskopem

Obecnie można automatycznie zliczać liczbę komórek, jednak automat nie rozróżnia

komórek martwych i żywych

Pomiar przez posiew jest jednak długotrwały (24-48h), co jest problemem, gdy chcemy

na bieżąco kontrolować hodowle

Pomiar masy – mierzymy komórki żywe i martwe pozostałości komórek, ale są to pomiary

szybkie

• Wprost – oddziela sie na sączkach mikroorganizmy (lub przez wirowanie) od płynu

pohodowlanego, próbkę suszymy i ważymy

• Pomiar turbidometryczny – mierzymy rozpraszanie światła

Możemy robić również pomiary niebezpośrednie mierząc jakiś składnik np. wydzielany przez

komórki – CO2.

Trzeba wyznaczyć współczynnik opisujący zależność miedzy masą (ilością) komórek a

mierzonym składnikiem. Jednak ilość pewnych składników może zależeć od warunków

fizjologicznych, a masą sie nie zmienia.

Można mierzyć również: białka, ATP, kwasy nukleinowe.

!!! Problem jest z grzybami, gdyż one nie rosną w postaci pojedynczych komórek tylko w

koloniach, dlatego nie wiadomo, co mierzyć.

Dobry zaszczep mikrobiologiczny

1. Zawiera żywe i aktywne komórki

2. Jest dostępny w dużych ilościach

3. Wolny od zanieczyszczeń

4. Jego komórki musza mieć zachowana zdolność do wytwarzania interesującego nas

produktu

Dlaczego żywe i aktywne komórki?

Dążymy do tego, aby skracać do minimum fazę adaptacyjna hodowli. Podłoże do hodowli

inokulum różni sie od podłoża produkcyjnego. Podłoże takie ma taki skład, aby komórki

mnożyły sie jak najszybciej, natomiast podłoże produkcyjne ma taki skład, aby powstało jak

najwięcej pożądanego produktu

Czemu skracamy okres adaptacyjny:

Ekonomia – jest to czas, gdy nic sie nie produkuje

Jest to czas, w którym najłatwiej o zakażenie hodowli

Staramy sie również, aby podłoża nie różniły sie drastycznie. Ważne jest również, aby

zaszczepu było dużo, jest to około 3% objętości hodowli.

Hodowla inokulum jest procesem wieloetapowym:

- Bakterie przechowywane są na skosąch

- Hodowla w pożywce płynnej w kolbach (max. 0,5 litra)

- Hodowla w mini-reaktorach – przelewamy całość kolb (kilkadziesiąt litrów)

- Przenosimy zaszczep do reaktora produkcyjnego

Po drodze sprawdzamy czystość hodowli, oraz czy nasze komórki nadal potrafią produkować

oczekiwany produkt tzn. jak sie komórki zestresują, to zapomną, czego je nauczyliśmy

Gdy używamy drożdży często jest tak, że jako zaszczepu używamy organizmów z

poprzedniej szarży np. w produkcji piwa drożdże osądzają sie, osąd taki przemywamy woda,

antybiotykami, filtrujemy i można je ponownie użyć. Istnieje jednak niebezpieczeństwo

degeneracji komórek np. wytwarzają jakiś produkt uboczny, dlatego tego samego zaszczepu

używamy około 5 razy i dajemy nowy zaszczep (nowe zastepy dzielnych drożdży gotowych,

by zmierzyć sie z chmielem i jeczmieniem).

Inokulum do procesów grzybowych

W większości wypadków używamy spor do inokulum.

1. Doprowadzamy grzyby do sporulacji przez ustalenie odpowiednich warunków np.

ograniczamy dostęp źródeł azotu, jako podłoża używamy np. zmielona kukurydze, kromki

chleba, w warunkach wysokiej wilgotności

2. Zbieramy spory, liczymy i możemy dalej postępować na dwa sposoby:

- Używamy spor do zasiewu – wydłuża sie faza adaptacyjna, nie potrzeba

dodatkowej instalacji

- Skiełkowujemy spory w osobnej instalacji, dopiero potem zaszczepiamy w

reaktorze produkcyjnym

Gdy mamy grzyby niesporulujace:

- homogenizacja grzybni

- zaszczepiamy reaktor

Wzrost grzybów może mieć charakter rozproszony lub w agregatach.

Skąd możemy otrzymywać zaszczepy?

- Z komórek macierzystych, w większości krajów są przedmiotem opatentowanym

- Zakupienie z kolekcji szczepów

- Wyizolowanie szczepów ze środowiska – długa droga

- Kradzież szczepów

Przechowywanie szczepów

Musimy je przechowywać tak, aby nie uległy zmianom genetycznym, aby nie doszło do

zakażenia, musza zachować żywotność i praktyczność

1. Obniżanie temperatury – spowolnienie procesów metabolicznych lub ich całkowite

zahamowanie

Na skosąch agarowych, w lodówce w temperaturze 5-10°C, można je przechowywać

maksymalnie pół roku

W ciekłym azocie (<150°C) – można przechowywać do kilkudziesięciu lat, komórki

musza być odpowiednio przygotowane, zawiesza sie je w glicerolu, zamyka w

ampułkach, poddaje powolnemu zamrażaniu, wysokie koszty przechowywania

Do bieżącego użytku przechowujemy bakterie na skosach w lodówce, ale zawsze

przechowujemy żelazna rezerwę komórek trzymanych w inny sposób np. w ciekłym azocie

2. Odwadnianie komórek – powoduje to spowolnienie procesów metabolicznych

Posiew na podłoże stałe np. gleba, produkty spożywcze, doprowadza sie do wzrostu i

powoli suszy (w temperaturze pokojowej przez kilka tygodni), pozwala przechowywać

szczepy przez długi czas (kilkadziesiąt lat), głównie przechowuje sie w ten sposób

grzyby promieniowce

Liofilizacja – odwadnia sie komórki w obniżonej temperaturze, zamraża sie komórki

w płynnym podłożu, następnie odpompowuje sie powietrze, obniża sie ciśnienie, co

powoduje, że lód przechodzi ze stanu stałego w parę, podłoże zawiera czynniki

chroniące np. mleko, surowica, glutaminian sodu, ampułki z takimi zliofilizowanymi

komórkami można przechowywać minimum 10 lat, nie trzeba utrzymywać niskiej

temperatury, przy zamrażaniu komórki mogą ulec zniszczeniu i nie wszystkie komórki

mogą być zliofilizowane

IZOLACJA SZCZEPÓW UŻYTECZNYCH PRZEMYSŁOWO

Gdy pobieramy szczep ze środowiska, musimy go sobie wyizolować. Jakie kryteria musi

spełniać ten szczep?

1. Czy szczep produkuje interesujący nas metabolit?

- Musimy zastanowić sie, gdzie, w jakim środowisku, Bedzie największa szansą na

znalezienie organizmu o interesujących nas właściwościach

- Często poszukuje sie organizmów ekstremofilnych, produkują one enzymy, które są

przystosowane do katalizowania reakcji w warunkach ekstremalnych np. odporne na

bardzo wysokie temperatury, różne zakresy pH, zasolenie, dzięki użyciu takich

enzymów nie musimy zapewniać komórkom cieplarnianych warunków

Aby wyizolować interesujący nas szczep z dużej ilości mikroorganizmów, używamy testów

przesiewowych (screeningowych). Test przesiewowy musi być prosty i tani, aby pozwolić na

szybkie przesiewanie dużej ilości komórek.

Przykład:

- Poszukujemy enzymów proteolitycznych

- Posiewamy mikroorganizmy na podłoże zawierające białko, zazwyczaj kazeina, białko

mleka

- Na podłożu rośna sobie różne szczepy

- Po 48h wlewamy na płytkę kwas trójchlorooctowy, powoduje on wytracanie

(koagulacje) białka

- W miejscach, gdzie kolonia nie rozkłada białka, otrzymujemy mętny „placek” wokół

kolonii, wokół tych, które rozkładają białko, pojawia sie rozjaśnienie

- Teraz już można łatwo wyizolować kolonie produkujące enzymy proteolityczne.

Gdy nie mamy testu przesiewowego, można brać pod uwagę grupę taksonomiczna. Izolujemy

dana grupe np. Streptomyces, gdy szukamy jakiegoś antybiotyku, i dopiero w tej grupie

szukamy konkretnego szczepu.

Po przesiewach nadal mamy bardzo dużo organizmów producenckich. Do selekcji używamy

kolejnych kryteriów.

2. Wymagania żywieniowe – szukamy szczepu, który pożywia sie na tanim źródle węgla,

posiewamy komórki na określone podłoża z różnymi źródłami węgla, sprawdzamy, czy

szybko sie mnożą i czy produkują nasz związek, odrzucamy organizmy, które wymagają

drogich źródeł węgla, wybieramy te, które wymagają tanich.

3. Optymalna temperatura wzrostu – zazwyczaj wybieramy te, dla których optimum

temperatury jest powyżej 40°C, w produkcji przemysłowej łatwiej jest podgrzać niż

ochłodzić, izolacja jest bardzo prosta, prowadzimy hodowle w danej temperaturze,

sprawdzamy, które sie szybciej mnożą, produkują więcej metabolitu

4. Czy organizm Bedzie można hodować w urządzeniach, które już posiadamy?

Np. jeśli mamy aparaturę tlenowa, nie szukamy beztlenowców, można przetestować

efektywność organizmów stosując różne rodzaje mieszania, natleniania, itp