Rozdział elektroforetyczny białek.

Izoenzymy.

Wstęp.

Elektroforeza.

Jedną z najwszechstronniejszych

i najpowszechniej stosowanych w
biochemii i dziedzinach pokrewnych
metod rozdziału związków jest
elektroforeza, znana w licznych
odmianach i modyfikacjach.
Podstawowym zjawiskiem
wykorzystywanym w tej metodzie jest
zróżnicowana ruchliwość jonów w polu
elektrycznym. W zależności od
posiadanego ładunku wypadkowego ruch
odbywa się w kierunku do katody lub do
anody. Szybkość i kierunek poruszania
się cząsteczek w polu elektrycznym są
uzależnione od wypadkowego ładunku
elektrycznego cząsteczki (zależnego z
kolei od jonizacji własnych grup
funkcyjnych lub grup funkcyjnych jonów
zaadsorbowanych ze środowiska, a co za
tym idzie od pH środowiska), wielkości i
kształtu cząsteczek (im większy stosunek
ładunku do wielkości, tym szybciej się
przemieszczają), siły jonowej elektrolitu
(im większa tym wędrówka jonów
wolniejsza), temperatury, sił tarcia w
ś

rodowisku, gradientu potencjału,

natężenia prądu i innych czynników.
Zależnie od sposobu przeprowadzania
rozdziału wyróżnia się dwa podstawowe
rodzaje elektroforezy: elektroforezę
swobodną (prowadzoną w roztworach,
np. stabilizowanych gradientem gęstości)
oraz prowadzoną na nośnikach, którymi
są materiały o strukturze porowatej lub
ż

elowej - np. bibuła

filtracyjna, żele poliakrylamidowe,
agarowe, krzemionkowe i inne.

(Dokładniejsze omówienie fizykochemiczne
elektroforezy patrz np.:Analiza instrumentalna w
biochemii. Skrypt dla studentów biologii (specjalność:
biologia molekularna) Praca zbiorowa pod red. A.
Kleina i A.Kozika; Wyd. UJ, Kraków 1989; do
wypożyczenia np.w bibliotece IBM. Informacje o
literaturze dot. zagadnień technicznych, analitycznych
itp. można uzyskać u prowadzącego ćwiczenia.).

Obecnie najbardziej

rozpowszechnione są trzy metody
elektroforetyczne:

•

elektroforeza żelowa; w żelu

poliakrylamidowym, agarozowym lub
skrobiowym. żel służy do stabilizowania
ś

rodowiska rozdziału, ponadto można

uzyskiwać żele o różnych średnicach
porów dla polepszenia rozdziału,
wykorzystując zasadę sita
molekularnego. Metoda elektroforezy w
ż

elu poliakrylamidowym (PAGE) jest

chyba najpowszechniej używaną metodą
elektroforetyczną - ćwiczenie opisane
poniżej będzie wykonywane właśnie tą
metodą. Odmiana PAGE w obecności
detergentu (najczęściej
dodecylosiarczanu sodu - SDS) może
służyć w odpowiednich warunkach do
oznaczania masy cząsteczkowej
nieznanych białek przez porównanie z
białkami o znanej masie cząsteczkowej.
SDS powoduje denaturację białek i
tworzy z nimi kompleksy o stałym
stosunku SDS-białko. Kompleksy takie
posiadają bardzo duży i prawie
jednakowy ujemny ładunek pochodzący
z dysocjacji reszt siarczanowych, w
związku z czym ruchliwość
elektroforetyczna jest uzależniona tylko
od wielkości cząsteczki kompleksu.

•

ogniskowanie izoelektryczne

(izoelektroogniskowanie) polega na
prowadzeniu elektroforezy w stałym
gradiencie pH otworzonym między
anodą i katodą. Wykorzystano tu
zjawisko nieoddziaływania pola
elektrycznego na cząsteczki o zerowym
ładunku wypadkowym. Substancje
rozdzielane elektroforetycznie mają
zazwyczaj własności amfoteryczne.
Cząsteczki obdarzone ładunkiem
wędrują w trakcie elektroforezy w
kierunku elektrody o przeciwnym znaku.
Podczas wędrówki przez gradient pH
ładunek będzie ulegał zmianie aż do
momentu gdy cząsteczka znajdzie się w
pH równym jej punktowi
izoelektrycznemu. W tym momencie
cząsteczka będzie elektrycznie obojętna -
a więc nie będzie się przemieszczać
dalej. Cząsteczki o jednakowym punkcie
izoelektrycznym będą się gromadziły
razem.

•

elektroforeza kapilarna -

najnowocześniejsza technika
elektroforetyczna, opierająca się na
rozdziale badanych substancji w bardzo
cienkiej kapilarze kwarcowej,
wypełnionej buforem lub żelem. Jest to
technika bardzo wszechstronna jeżeli
idzie o wielkość rozdzielanych cząstek -
można ją stosować zarówno do prostych
jonów nieorganicznych jak i do całych
komórek (!). Stosowanie bardzo cienkich
kapilar umożliwia intensywne
odprowadzanie ciepła, dzięki czemu
można stosować bardzo duże różnice
potencjałów między elektrodami, co
przyspiesza proces rozdziału.Zjawisko
przepływu elektroosmotycznego
umożliwia jednoczesny rozdział
cząsteczek naładowanych ujemnie i
dodatnio oraz pozbawionych ładunku: w
określonych warunkach cała objętość
elektrolitu znajdującego się w kapilarze

przepływa w kierunku jednej z elektrod,
a więc ruch cząsteczek w niej będzie
wypadkową szybkości ruchu
elektroosmotycznego i ruchu
elektroforetycznego. Monitorowanie
odbywa się przeważnie nie na całej
długości kapilary lecz tylko przy jednym
z jej końców. Można stosować różne
rodzaje detektorów - absorpcyjne,
fluorescencyjne, fotochemiczne itp.
Niektóre typy detektorów
fluorescencyjnych stosowanych w tej
metodzie (fluorescencja wzbudzana
ś

wiatłem laserowym) umożliwiają

wykrywanie substancji znajdujących się
w kapilarze w stężeniach 10-18 M
(kilkanaście do kilkudziesięciu
cząsteczek). Objętość próbki koniecznej
do analizy jest bardzo mała - wynosi od
kilku nl do kilku

µ

l. Najpoważniejszymi

wadami tej metody jest niemożliwość
przystosowania jej do skali
preparatywnej (co wynika z samej
zasady) a także kosztowność aparatury,
co jest po części spowodowane jej
nowością a po części bardzo wysokimi
wymaganiami stawianymi szczególnie
detektorom.

Substancje rozdzielane metodą

elektroforezy żelowej, o ile nie posiadają
własnego zabarwienia lub innych cech
fizycznych umożliwiających ich
wykrycie, można uwidocznić za pomocą
barwienia specyficznego dla określonych
klas związków. Dla białek podstawowe
metody barwienia to:

wybarwianie barwnikiem

organicznym Coomassie Brillant Blue,
który adsorbuje się na cząsteczkach
białka zawartych w żelu; metoda jest
stosunkowo prosta, ale czasochłonna i
niezbyt czuła, mogą się w niej również
wybarwiać inne cząsteczki
biopolimerów.

wybarwianie srebrem -

polegające na przekształceniu cząsteczek
białka w żelu w pochodne powodujące
redukcję AgNO3 do srebra
metalicznego. W porównaniu z metodą
Coomassie wybarwianie trwa krócej i
jest trwalsze. Jest to metoda bardzo czuła
ale skomplikowana i wrażliwa na
zanieczyszczenia żelu, które mogą
również powodować redukcję.

W wypadku kiedy chodzi o

wybarwienie w żelu białka o określonej
aktywności enzymatycznej można (o ile
elektroforezę przeprowadzano w
warunkach niedenaturu-jących)
przeprowadzić barwienie metodą
chemiczną, w którym jedna z reakcji jest
katalizowana przez ten enzym. Metoda
ta została opracowana do określania
lokalizacji enzymów w histologii, stąd
często określa się ją jako barwienie
histochemiczne. Reakcje dobiera się tak,
by produkt reakcji był zabarwiony lub
fluoryzował. W niektórych reakcjach na
barwnym tle pozostają bezbarwne plamy
w miejscu lokalizacji enzymu. Metody te
są przeważnie łatwe w stosowaniu i
działają bardzo specyficznie.

Izoenzymy

Barwienie histochemiczne

elektroferogramu homogenatu określonej
tkanki wykazuje często obecność w niej
kilku form tego samego enzymu.
Zróżnicowanie zawartości form
enzymów o tym samym działaniu
występuje również często między
różnymi organizmami, zarówno w
obrębie gatunku jak i wyższych
jednostek systematycznych. Różne
formy tego samego enzymu są nazywane
izoenzymami, izozymami lub izoformami
eznymów. Profil izoenzymatyczny

określonej aktywności w określonym
osobniku można traktować jako swego
rodzaju "fenotyp enzymatyczny", który
można interpretować w odniesieniu do
genotypu - do genów i alleli. Dzięki
temu że geny kodujące białka są
polimorficzne (występują w postaci kilku
alleli tego samego genu) oraz temu, że
obydwa allele są aktywne w procesie
biosyntezy białek i są widoczne w
profilu izoenzymatycz- nym (wykazują
kodominację).

Najważniejszym czynnikiem

wpływającym na różnice ruchliwości
elektroforetycznej izoenzymów są
zmiany w pierwszorzędowej strukturze
białka, będące odbiciem różnic w
allelach tego samego genu. Dla prostego
przedstawienia tych zależności
rozważmy hipotetyczny polipeptyd
złożony z dziewięciu aminokwasów:

OOC

NH

3

+

-

1

2

3

4

5

6

7

8

9

+

+

-

+

-

+

+

W środowisku w którym
przeprowadzamy elektroforezę reszty
aminokwasów 1,2,5,7 i 9 są zjonizowane
dodatnio; reszty aminokwasów 3 i 6 są
zjonizowane ujemnie. Wypadkowy
ładunek cząsteczki wynosi więc +3.
Załóżmy, że aminokwas 5 to lizyna,
kodowana w genie przez kodon TTC.
Możliwe jest kilka rodzajów mutacji
punktowych polegających na zamianie w
tym kodonie jednej zasady azotowej na
inną:
(1) zamiana kodonu TTC na TCC
spowoduje zamianę z lizyny na argininę,
dzięki czemu otrzymamy nowy allel,
kodujący nową alloproteinę (inną formę
tego samego białka). Ponieważ reszta
argininowa podobnie jak lizynowa ma

ładunek dodatni, białko będzie miało
wypadkowy ładunek nadal równy +3;
(2) Jeżeli kodon TTC zmutuje do TGC,
nowa alloproteina będzie miała treoninę
w poz. 5. Ponieważ aminokwas ten jest
neutralny, cząsteczka będzie miała
wypadkowy ładunek +2.
(3) Mutacja TTC do CTC spowoduje
wbudowywanie w miejscu lizyny
glutaminy, dysocjującej na jon ujemny.
Wypadkowy ładunek będzie wynosił +1.
(4) W końcu, jeżeli kodon TTC zmutuje
do TTT, jego znaczenie pozostanie takie
samo (będzie nadal kodował lizynę).
Jeżeli powstałe w efekcie mutacji
alloproteiny poddamy elektroforezie,
będą one migrować do katody z
szybkością proporcjonalną do ich

ładunku. Po przeprowadzeniu
elektroforezy ich pozycje będą
następujące: białko o budowie
pierwotnej (0) i produkt mutacji (1) będą
zlokalizowane w tej samej odległości od
linii startu. W tej samej odległości
będzie zlokalizowany produkt
zmutowanego genu (4), identyczny z
białkiem pierwotnym (0). Produkt
mutacji (2) będzie się znajdował bliżej
linii startu, gdyż jego ładunek
wypadkowy wynosi +2, a więc jest
mniejszy w stosunku do białka
pierwotnego, a produkt mutacji (3) o
ładunku +1 będzie najbliżej linii startu.

(Wg. N.Pasteur et al. "Practical isozyme genetics", Ellis
Horwood Ltd. Publishers, Chichester 1988)

Wykonanie

1. Złożyć aparat do elektroforezy,
napełnić zbiorniki buforami.
2. Przyniesione próbki roślinne (np.
liście dwóch spokrewnionych gatunków
lub tego samego gatunku z różnych
siedlisk itp.) umieścić w moździerzu z
tłuczonym szkłem i buforem do
zawieszania próbki i rozetrzeć na
jednolitą masę. Umieścić w probówkach
Eppendorfa, podpisać i odwirować przez
15 s. Przechowywać na lodzie lub w
lodówce.
3. Pipetą automatyczną nanosić próbki
do studzienek w dwu żelach - po 3 i 10

µ

l; ew. w dwu studzienkach każdego

ż

elu umieścić po 2 lub 5

µ

l roztworu

oczyszczonej reduktazy ferredoksyna-
NADP+ z dodatkiem błękitu
bromofenolowego. Prowadzić
elektroforezę do momentu gdy błekit
bromofenolowy znajdzie się ok. 0.5 cm
od dolnej krawędzi żelu.

4. Odłączyć prąd, rozmontować aparat,
wyciągnąć żele.
5. Jeden z żeli poddać barwieniu
wykazującemu obecność diaforaz
zależnych od NAD(P)H: umieścić w
roztworze barwiącym (ostrożnie -
zawiera bardzo szkodliwe związki) w
ciemności i sprawdzać intensywność
zabarwienia co 5-10 min. Po otrzymaniu
wyraźnego zabarwienia odczekać jeszcze
10 min, żel wyciągnąć z kąpieli
barwiącej, wypłukać w kuwecie
fotograficznej kilkakrotnie wodą
wodociągową, delikatnie osuszyć bibułą
i włożyć między dwa arkusze folii.
Odrysować otrzymany układ prążków,
zaznaczając miejsca naniesienia
poszczególnych próbek. Można również
sfotografować żel (najlepiej przy użyciu
transiluminatora)
(6. Drugi z żeli poddać barwieniu
srebrem w celu uwidocznienia
wszystkich białek.)

Opracowanie wyników:

Na podstawie otrzymanych wyników:
podać liczbę izoenzymów diaforaz w
badanych próbkach porównać profil
izoenzymatyczny badanych
roślin,wskazać hetero- i homozygoty pod

względem badanego genu określić (o ile
to możliwe) położenie diaforaz w żelu
barwionym srebrem i oszacować ich
ilość w porównaniu z innymi białkami.

Matriały:
Próbki roślinne, najlepiej z osobników ze spokrewnionych gatunków lub z różnych populacji tego samego gatunku.
Liście szpinaku (Spinacia oleracea), Primula sp., Triticum sp. lub innej rośliny hodowlanej.
Wstępnie oczyszczony preparat reduktazy ferredoksyna:NADP+ ze szpinaku.
Spolimeryzowane żele do elektroforezy

Odczynniki:
Roztwory do barwienia srebrem - wg. przepisów podanych niżej lub

do barwienia met. Coomasie

Odczynniki do elektroforezy:

Bufor do zawieszania próbki (5 x stężony):

Tris

312.5

mM

glicerol lub sacharoza 50

%

błękit bromofenolowy 0.05

%

pH = 6.8

Roztwory do elektroforezy:

Roztwór A

Akrylamid

30

%

Bis-akrylamid

0.8

%

Roztwór B (bufor do żelu rozdzielającego)

Tris

18.2

g

rozpuścić w 40 ml wody
doprowadzić do pH 8.8 przy pomocy HCl
i dopełnić do 100 ml

Roztwór C (bufor do żelu zagęszczającego)

Tris

6.0

g

rozpuścić w 40 ml wody
doprowadzić do pH 6.8 przy pomocy HCl
i dopełnić do 100 ml

Roztwór nadsiarczanu amonu

0.5 g nadsiarczanu amonu rozpuścić w 5 ml wody

Bufor elektrodowy

Tris

3

g

Glicyna

14.4

g

woda do

1000

ml

pH powinno wynosić ok. 8.8. Jeżeli byłoby inne, zmienić ilość glicyny.

Przygotowanie żelu uszczelniającego i rozdzielającego (10% wzgl. akrylamidu)

Zmieszać wody

8.3 ml

roztworu A

6.7 ml

roztworu B

5.0 ml

Z przygotowanego roztworu pobrać 3 ml, dodać:

r-ru nadsiarczanu

100

µ

l

TEMED-u 10

µ

l

Wlać natychmiast mieszaninę do uprzednio przygotowanego zestawu szybek aparatu do elektroforezy tak,

by utworzyła się na dnie warstwa ok. 0.5 cm. Po jej spolimeryzowaniu dodać do pozostałej części przygotowanego roztworu 150

µ

l r-

ru nadsiarczanu i 15

µ

l TEMED-u i wlać do aparatu do wysokości ok. 2 cm od górnej krawędzi szyb. Na roztwór między szybkami

nanieść ostrożnie ok. 1 cm warstwę wody, co powoduje wyrównanie powierzchni żelu.

Przy wszystkich operacjach zachowywać ostrożność, ponieważ niespolimeryzowany akrylamid jest silną neurotoksyną. Strzykawki,
igły itp. natychmiast po użyciu wypłukać zimną wodą aby zapobiec polimeryzacji akrylamidu w nich.

Po ok. 60 min. odsączyć z powierzchni żelu wodę i wlać uprzednio przygotowany roztwór dla otrzymania żelu zagęszczającego o
składzie:

woda

4.6 ml

roztwór A 1.34 ml
roztwór C 2 ml
r-r nadsiarczanu

100

µ

l

TEMED

10

µ

l,

postępując zgodnie z przepisem dotyczącym danego typu aparatu.

Roztwór do barwienia histochemicznego diaforaz:

DCIP

5

mg

MTT

7.5

mg

rozpuścić w 50 ml buforu 0.025 M Tris-HCl, pH 8.5

Bezpośrednio przed barwieniem w 20 ml tego roztworu rozpuścić

NADH lub NADPH* 4

mg (przygotować wcześniej naważkę w eppendorfce)

* odpowiednio dla diaforaz zależnych od NADH lub NADPH

Barwienie wszystkich białek srebrem
A: żel przez 60 min utrwalać w kąpieli odwadniającej

metanol

100 ml

kwas octowy

24 ml

formalina 37%

100

µ

l

woda

76 ml

B: Płukać w 50% etanolu przez 20 min. 2 razy, zmieniając roztwór.
C: Zanurzyć żel w roztworze 40mg Na2S2O3

. 5H

2O na 1 min.

D: Płukać wodą destylowaną 3 x po 20 s.
E: Umieścić żel w kąpieli impregnującej na 20 min:

AgNO3

400 mg

formalina 37%

150

µ

l

woda

200 ml

F: Plukać wodą dest. 2 x po 20 s.
G: Wywoływać w roztworze:

Na2CO3

12 g

r-r z pktu C

4 ml

formalina 37%

0.1 ml

woda

195 ml

przez 10 min

H: Płukać 2x w wodzie dest. przez 2 min.
I: Umieścić w kąpieli przerywającej :

metanol

50 ml

kwas octowy

12 ml

woda

38 ml

na 10 min

J: Płukać w 50% r-rze metanolu przez co najmniej 20 min. W tej kąpieli żel może pozostawać przez dłuższy czas.

Sprzęt
Dwupłytkowy aparat do elektroforezy
Moździerz z kurantem
Naczynia do barwienia żeli (np. przykrywki płytek 96-dołkowych).