Białka i kwasy nukleinowe

Notatki te z pewnością zawierają błędy i braki, więc jeżeli ktoś takowe zauważy prosiłbym by nie

zachowywał tego dla siebie, tylko dał mi znać na maila

[e-mail]

, postaram się je

jak najszybciej poprawić/ uzupełnić.

Slajdy dostępne pod adresem

http://www.biol.uw.edu.pl/zbm/wyklad/

hasło: mimoza

Wykład 5

Transport białek:

Wstęp:

Większość białek jest syntetyzowana w cytozolu, ale mają różne miejsca docelowe, niektóre są
wręcz błonowe, albo sekrecjonowane.
Pytanie na egzamin brzmi – skąd wiedzą gdzie trafić i jakie są mechanizmy transportu?

Za kierowanie białek w 1999 Nobel dla Grüntza Blobela (ten z kolei dostał chyba za nazwisko...).
W białkach istnieją sekwencje kierujące:

•

mogą być w 1 miejscu, albo mogą być rozdzielone

•

Mogą być usuwane (np. mitochondrialne, albo chloroplastowe), a mogą zostawać (np.
jądrowe)

Transport do jądra – sekwencja na N-końcu, powtórzone aa zasadowe (K i R, czasem jeszcze P).
Tzw. NLS = sygnał lokalizacji jądrowej, zniszczenie 1 aa niszczy jego funkcję. Są 2 rodzaje:

•

Sekwencja zwarta => oczywiste

•

Sekwencja rozdzielona => kilka aa zasadowych, przerwa na ~10aa i znowu kilka aa
zasadowych

NLSy często bywają powtórzone.
Chociaż większość białek wędruje do jądra, to istnieje również sekwencja eksportu jądrowego w
białkach wędrujących jądro → cytoplazma.

Sekwencja kierująca do mitochondriów – ~10-30aa, bardziej zdegenerowana od NLS, trudno
wręcz wyznaczyć konsensus, ma jednak strukturę II rzędową o charakterze amfipatycznym.

Sekwencja kierująca do chloroplastów – jak do mitochondriów, ale bez aa naładowanych (stricte
hydrofobowa)

Sekwencja kierująca do ER – tyle, że jest i jest zdegenerowana

Sekwencja kierująca do peroksysomó – są dwie:

•

10 aa – kiepsko określona

•

3 aa – SKL, dobrze określona

Sekwencja kierująca do lizosomów – w zasadzie to nie sekwencja a modyfikacje posttranslacyjne
tzn. glikozylacja z mannozą na końcu i fosforylacja w 6 pozycji.

Badanie:

•

Tagi fluorescencyjne bardzo ułatwiły

•

Tego typu kod (sekwencja) świetnie się analizuje bioinformatycznie

Rodzaje transportu – tu 2 podziały:

1. Przez pory jądrowe

– selektywne bramki w dwu warstwowej błonie

2. Transport przez ciągłe błony

– mitochondria, chloroplasty, ER i peroksysomy

3. Transport pęcherzykowy

– odpączkowanie i dyfuzja (blisko), lub przy użyciu cytoszkieletu

(dalego) np. między ER i GA

I. Transport posttranslacyjny

– zwykły, czyli w postaci gotowego białka np. do jądra

II. Transport kotranslacyjny

– rybosom siada na błonie w okolicy miejsca transportu i

translując przerzuca np. ER

Transport przez pory jądrowe:

Tak naprawdę przechodzą przez nie, nie tylko białka, ale wszystko i jest zarówno aktywny, jak
również bierny.

Pory są spoko, bo są duże i dają się ładnie izolować. Mają ośmiokrotna symetrię z korkiem w
środku. Mogą przez nie swobodnie przechodzić jony, ale również małe białka – do ~20 kDa (np.
histony!).

Aktywny GTP zależny transpor:
Dwóch głównych graczy:
Importyny = receptory importu jądrowego, zbudowane z 2 podjednostek. α – rozpoznają NLS i β –
łączy się z białkami budującymi pory jądrowe.
RanGTP – białko wiążące się z importynami.

Importyny są eksportowane z jądra, gdy są związane z RanGTP. Hydroliza GTP powoduje rozpad
tego kompleksu. W jądrze z kolei przyłączenie RanGTP przyłącza się do importyny, co powoduje
odłączenie cargo.

W eksporcie biorą udział eksportyny.
Eksportyna w jądrze wiąże cargo, z kolei dopiero gdy jest związana z RanGTP. Rozpad całego
kompleksu w cytoplazmie (eksportyna-cargo-RanGTP) zachodzi pod wpływem hydrolizy GTP.

Żeby całość działała są potrzebne jeszcze 2 białka, których asymetryczne rozłożenie (są tylko w
cytoplazmie) zapewnia ukierunkowany charakter transporty:
RanGAP – stymuluje hydrolizę GTP
RCC1 – katalizuje wymianę GDP na GTP w białku Ran

Kompleks jądrowy:

Zbudowany z 3 pierścieni. Asymetryczny, od strony cytoplazmatycznej wystają filamenty, a od
strony jądra jest „koszyczek”. Środek tworzący wąskie gardło ma Ø=45nm.

Białka budujące por jądrowy to nukleoproteiny, których jest ~100, ale są zorganizowane w ośmiu
powtarzających się okręgach.
Przynajmniej część nukleoprotein ma strukturę zawierającą domeny WD 40 i α-helisy tworzące
zachodzące na siebie „guzki i ogonki”.

Dla transportu kluczowa jest właściwość niektórych nukleoproteiny → obecność długich (kilkaset
aa) nieustrukturalizowanych witek. Mają one określoną sekwencję np. powtórzone FG (tzw.

domena FG), albo GLFG, czy FXFG.
Witki te wnikają do środka poru, mają hydrofobowy charakter i wypełniają całą jego przestrzeń,
tworząc tzw. hydrożel (o konsystencji porównywalnej z 0,4% agarozą).

Mechanizm transportu:
Są dwa modele, oba zakładają, że przyczyną przejścia są oddziaływania z witkami, ale przyjmują
inną strukturę „żelu”.

1. Model sita

– zakłada silne oddziaływania witek ze sobą i tworzenie sieci uniemożliwiającej

przejście białkom. Rolą importyn jest tu konkurencja o te oddziaływania i rozrywanie sieci.

2. Model szczotki

– podobny, jednak przyjmuje mniejszą siłę oddziaływań i brak struktury

witek, więc przy przechodzeniu nie ma potrzeby wykluczania.

Oddziaływania z nukleoporami – może być albo tak, że na 1 importynie są 2 miejsca wiązania
nukleoporyn, albo, że jedno białko (cargo) zwiąże 2 importyny.

Kluczowe z perspektywy białka jest to, czy NLS jest widoczny dla importyn. Istnieją białka
maskujące, które z kolei np. na sygnał fosforylacji mogą się odłączać.

Wewnątrz jądra:
Są tam struktury subjądrowe np. jąderka, w których z kolei można jeszcze wyróżnić struktury np.
część fibrylarna jąderka.
Znajdują się tam też dwa rodzaje granularności → ciałka Cajala i speckle.
Oznacza to, że różne białka mają jeszcze różną lokalizację wew. jądra! Jest ona co więcej
niezwykle szybka – sekundy do minut (tu histony).

Od czego ona zależy?
Zasadniczo od powinowactwa do innych białek, albo kwasów nukleinowych.
W związku z tym może być kontrolowana np. przez modyfikacje.
np. kompleks ASF/SF2 (udział w splicingu), magazynowany w specklach, a jego lokalizacja jest
na każdym etapie kontrolowana przez kinazy (transport do jądra, do speckli i potem uwalnianie z
nich)

Technika badania lokalizacji → FRAP (fluorescence recovery after photobleaching)

•

„prześwietlamy” białka punktowo laserem

•

mierzymy szybkość powrotu fluorescencji

Transport do mitochondriów:

Transport białek do mitochondriów in vitro był znany już w latach 70 i wiedzieliśmy, że zależy od
sekwencji, które są odcinane.

1. Mamy białko, o którym podejrzewamy, że jest kierowane do mitochondriów
2. Dodajemy wyizolowanych, naładowanych mitochondriów
3. Jak puścimy na żelu do dostaniemy 2 prążki – duży jak wcześniej i mały
4. Dodamy trypsyny – dostaniemy tylko mały
5. Gdy oprócz trypsyny dodamy też detergentu (rozwalimy mitochondria), to nie mamy

żadnego prążka

Dzisiaj wiemy, że do białek transportowanych do mitochondriów dołączany jest Hsp70. Dołącza się
przed kwaśną częścią sekwencji, która jest rozpoznawana przez TOM, mający w wew. błonie
parntera TIM (zależnego od potencjału błonowego). W matrix znajduje się proteaza o charakterze
bakteryjnym (okrągła metaloproteaza), która odcina sekwencję liderową. Tam też białko jest
przejmowane przez chaperony mitochondrialne.

Białka lokalizujące się w przestrzeni międzybłonowej mają zasadniczo 2 sekwencje sygnałowe
(najpierw do matrix a potem do przestrzeni międzybłonowej). Transportowane są również przez
TIM.
Wyjątek → cytochrom c, który przez zewnętrzną błonę dostaje się przez TOM, ale potem
następuje cud (istnieją jakieś mętne tłumaczenia, że to wpływ ładunku cytochromu c na lipidy) i
lokalizuje się on w wewnętrznej części zewnętrznej błony. Wtedy jest jeszcze tak naprawdę
apocytochromem c i dopiero liaza hemowa cytochromu c przyłączając do niego hem zmienia
jego powinowactwo do błon i lokuje teraz już cytochrom c w wewnętrznej błonie.

Pamiętaj:
Mitochondria syntetyzują 13 białek, a transportują ~1000.
Transport do chloroplastów jest podobny, z tym, że ich sekwencja jest nienaładowana.

Wykład 5

Transport do ER:

To również transport przez błonę, z tym, że jest kotranslacyjny. Zasadniczo translacja zaczyna się w
cytoplazmie, dochodzi do pierwszych kilkudziesięciu aa i one są rozpoznawane przez SRP (signal
recognition protein). Zatrzymuje ono translację i lokalizuje całość przy translokonie na ER, gdyż
znajdują się tam receptory dla SRP. Rybosom przyłącza się do ER a SRP oddysocjowuje i
translacja idzie już do światła ER.
Pamiętaj, że w cytoplazmie istnieje konkurencja między SRP a Hsp70.

Receptor SRP to zasadniczo dimer składający się z podjednostek α w cytozolu i β w błonie,
położony obok translokonu.

Energia tego transportu pochodzi z cyklu GTP-GDP. GTP jest przyłączone do podjednostki α
receptora SRP, a potem do samego SRP, jego hydroliza zachodzi w momencie odłączenia się
SRP.

W skład całego systemu wchodzą, więc:

•

sekwencja liderowa

•

SRP

•

receptor SRP

•

translokon

•

proteaza odcinająca sekwencję liderową

Samo SRP to ryboproteina, z rozgałęzionym i wydłużonym fragmentem RNA i z białkową
„łapką”.

W kompleksie SRP – rybosom i syntezowane białko są też inne białka. p54 odpowiedzialne za
metabolizm GTP, oraz posiadające zestaw Met rozpoznających hydrofobową część sekwencji
liderowej i białka oddziałujące z rybosomem i odpowiedzialne za translokację.

SRP stopuje translację, bo wiąże się z rybosomem w miejscu wiązania czynników elongacyjnych.

Translokon zbudowany jest z 2 kluczowych białek – Sec61 od strony cytoplazmy z którym wiąże
się rybosom i TRAM od strony ER. Przyłączenie rybosomu otwiera go.

Po wejściu do ER białka ulegają błyskawicznym modyfikacjom posttranslacyjnym. Głównie
glikozylacji (związanej najczęściej z cyklem dolicholu), ale też metylacji czy fosforylacji.
W ER jest też sporo izomeraz disiarczkowych, oraz charakterystyczny zestaw chaperonów.

Istnieją również białka transportowane klasycznie, posttranlacyjnie

Transport pęcherzykowy:

Zachodzi:

•

Między ER a GA

•

w GA

•

między GA a błoną komórkową

W GA mamy do czynienia z sortowaniem, ale również wprowadzaniem licznych modyfikacji (w
różnych kompartmentach GA różnych, są to np. fosforylacja, czy różne glikozylacje). Istnieje też
sporo powrotnego transportu np. do ER żeby dalej modyfikować.

Pytanie na egzamin → Czemu akurat w danym miejscu tworzy się pęcherzyk? Skąd specyficzność
co do celu?
Odpowiedź, to zasadniczo to, że jest on otoczony specyficznymi białkami

Czemu akurat to i tu w pęcherzyku:

Od wewnątrz są receptory decydujące o składzie pęcherzyka. Od zewnątrz główną osłonę stanowią
klatryny (tworzą superkoszyczki), oraz białka ARF mające aktywność GTPaz zaginających błonę.

Skąd specyficzność celu:

rozpoznawanie opiera się na α-helikalnych białkach SNARE:

•

v-SNARE – są na pęcherzyku

•

t-SNARE – są na błonie celu

Istnieje kilkadziesiąt możliwych kombinacji różnych izoform SNARE, co prawdopodobnie jest
związane ze specyficznością.

Ostatecznie tworzy się hybryda tych 2 białek i pęcherzyk jest włączany na zasadzie zamka
zatrzaskowego ich końców generującego siłę przerywającą ciągłość błon.

Mogą też występować inne białka niż SNARE np. SM z zagłębieniem do którego pasuje SNARE.
Cały ten układ izoform + innych białek dodatkowo komplikują modyfikacje posttranslacyjne.
np. występują dwa rodzaje receptorów, z których tylko jeden jest ubikwitynowany i to on będzie
decydował o tym, gdzie ma trafić pęcherzyk.

Substancje swobodnie wnikające do komórki to małe, nienaładowane lub hydrofobowe cząsteczki.

CPP (Cell penetrating peptides):

Dodajemy je, gdy chcemy coś wsadzić do komórki, a one mają zdolność do zabierania ze sobą innej
cząsteczki. Odkryte po zaobserwowaniu swobodnego wnikania HIV-Tat. Dziś mamy:

•

Naturalne – HIV-Tat, penetratyna, pVEC

•

Chimery – transportan, pep-1

•

Sztuczne – peptyd poliargininowy

CPP są zwykle amfipatyczne, i są 2 opcje:

•

A – do powstania amfipatyczności potrzebne jest zwinięcie

•

B – do powstania amfipatyczności nie potrzebne jest zwinięcie

Mechanizmy transportu CPP:

1. Bezpośrednia translokacja

przez wykorzystanie fragmentów naładowanych oddziałujących z

fosfolipidami

2. Endocytoza

= przez wytworzenie pęcherzyków

3. Tworzenie porów

= odwrotne micele

Wydaje się, że rodzaj zależy od konkretnego peptydu.

Zalety nad wektorami ekspresyjnymi to:

•

Precyzyjna kontrola poziomu biała – przynajmniej w porównaniu z niedokładnością siły
promotorów

•

Można wprowadzić białka, których komórka nie mogłaby zsyntetyzować np. dziwne, albo
ze znakowanymi aa

Są takie CPP, które wiążą czynniki kowalencyjnie i takie co niekowalencyjnie.

HIV-Tat wiąże kowalencyjnie i jest w stanie przenieść ~200aa.

Zastosowania w medycynie – apoptoza:



Indukcja apoptozy przez podanie p53 (patrz legendarny projekt iGEM 2009)



Protekcja przed apoptozą w anoksji (ubikwitynacja białka TOP3)

Zastosowanie w badaniach – wprowadzenie znakowanych białek, niezbędnych do badania ich
funkcjonowania w komórce in vivo.

Ostatnio aktualizowane: 2009r.