Diagnostyka chorób genetycznych
Wykorzystanie:
1. wykrywanie chorób przed objawami
2. możliwość wykrywania nosicielstwa
3. diagnostyka prenatalna
4. rozróżnianie chorób objawiających się kliniczne tak samo
Pozyskiwanie materiału do badań (ilość zależy od techniki)z :
krew obwodowa (limfocyty), fibroblasty skóry, płyn owodniowy, komórki kosmówki, mocz, kał, nasienie, fragmenty włosów,
wycinki tkankowe, szpik kostny, materiały z biopsji
Izolacja DNA:
1. Metoda fenolowa daje preparaty DNA o wysokiej wydajności oraz dużą czystość; można stosować z krwi zamrożonej i
długo przechowywanej. Potrzeba dużo (10ml) krwi, stosuje się toksyczne odczynniki.
Przebieg izolacji:
a) Wstępna obróbka  izolacja z np. limfocytów, rozwarstwianie w fenolu oraz wirowanie z dodatkiem
substancji powodujących lizę erytrocytów
b) Liza erytrocytów
c) Trawienie białek (proteinaza K) (24-48h) w temp 37*C
d) Oczyszczanie preparatu (fenol + chloroform)  denaturacja białek i lipidów
e) WytrÄ…canie (precipitacja DNA)
f) Zawieszenie DNA w odpowiednim buforze  zabezpieczenie przed działaniem odpowiednich
endonukleaz
2. Metoda wysalania białek trwa 2dni, brak tox odczynników, ilość krwi  5ml
a) Jw. pkt a i b
b) Trawienie białek przez 12-24h w temp 50*C
c) Oczyszczanie roztworem NaCl powodującym odsolenie białek
d) Reszta jw.
3. Metoda Grindberga ilość krwi 1ml, czas 6h, max przechowywanie krwi 1miesiąc.
Po przeprowadzeniu w/w procesów należy sprawdzić czystość i ilość DNA w preparacie przy pomocy badania
spektrofotometrycznego dla długości fali 260,260 i 280nm.
Ilość wyraża siÄ™ w µg/ml i oblicza z wzoru
Z = A260 × 50 × R
gdzie: 50  stały współczynnik R- rozcieńczenie
Czystość jest podawania w % i jest wyliczana ze stosunku wartości absorbancji dla wartości dla 260/280nm (1,8 dla 100% czystości
DNA)  wartości 1,8-1,6 uznaje się za poprawne.
Przy A /A < 2 w roztworze mukopolisacharydy; A / A > 2 białko.
260 230 260 280
1
Metoda PCR
Polega na powielaniu (amplifikacji) in vitro fragmentu genomowego DNA o wielkości od kilkudziesięciu do kilku tysięcy
par zasad.
Etapy PCR
1. Denaturacja dwuniciowego DNA w temp 93-95*C
2. Przyłączenie starterów (primerów)  temperatura zależy od sekwencji (50-60*C)
3. Polimeryzacja DNA w temp 72*C
W/w etapy powtarza się ok. 20-30 razy. Dzięki temu zwiększamy ile chcemy ilość DNA potrzebnego do dalszych badań.
Skład mieszaniny DNA matrycowy, primery (startery), wolne nukleotydy (dNTP: dATP, dGTP, dTTP, dCTP), Mg2+ , polimeraza
Taq
Startery  syntetycznie uzyskane zawierają 20PZ, przyłączają się do 3`. Ograniczają zasięg syntezy.
Polimeraza Taq- wyizolowana z Thermus aquatiqus jest aktywa w temp 95*C, w przeciwieństwie do polimerazy z E. Coli.
Reakcja PCR przebiega w bloku grzejnym pozwalajÄ…cym na szybkie zmiany temperatury  termocykler
Reakcja PCR  multiplex  w mieszaninie reakcyjnej znajduję się kilka par starterów dla różnych genów lub dla odmiennych
fragmentów tego samego genu.
Reakcja RT-PCR (technika izolacji RNA) proces PCR jest poprzedzony przepisaniem mRNA na komplementarne DNA (cDNA)
w reakcji odwrotnej transkrypcji w obecności startera, najczęściej uniwersalnego oligo dT lub oligonukleotydu swoistego dla
mRNA.
Stosuje się gdy nie wiadomo gdzie szukać.
Zastosowanie PCR:
" Biologia molekularna
" Medycyna (choroby genetyczne, zakaz
ne, diagnostyka prenatalna), medycyna sÄ…dowa (kryminalistyka, ustalanie ojcostwa)
" Antropologia
ANALIZA PRODUKTÓW PCR
Enzymy restrykcyjne
Są izolowane z bakterii (np. Eco I  E. Coli restryktaza I), mają zdolność rozpoznania specyficznych miejsc w DNA- dając
fragmenty o określonych końcach.
Enzymy restrykcyjne :
" Miejsca rozpoznania i nacięcia są oddalone do 1000 par zasad
" Nacięcie występuje w miejscu rozpoznania
" Nacięcie oddalone od miejsca rozpoznania o 25  100 par zasad
Rodzaje generowanych końców:
" Nacięcie o 1 osi symetrii daje tępe końce
" Przecięcie wzdłuż różnych osi symetrii co daje tzw lepkie końce
Hybrydyzacja z sondÄ… molekularnÄ…:
2