Spektroskopia Fluorescencyjna

Definicja: promienisty powrót cząsteczki z elektronowo
wzbudzonego stanu do stanu podstawowego

S

0

+ h

ν

S

1

S

1

S

0

+ h

ν

’

Cząsteczka w stanie wzbudzonym staje się innym indywiduum

chemicznym

Procesy rozpraszania
energii wzbudzenia

1. Promieniste

•

Fluorescencja - emisja ze

wzbudzonego stanu singletowego
S

1

S

0

(czas życia rzędu kilku

ns)

•

Fosforescencja - emisja z

trypletowego stanu wzbudzonego
poprzedzona

przejściem

ISC

(czas życia 10

-4

10

2

s)

2. Bezpromieniste

•

Relaksacja oscylacyjna

•

Konwersja wewnętrzna

(IC-

internal conversion) - przejścia
między wyższymi stanami o tej
samej multipletowości

•

Przejścia interkombinacyjne

(ISC – InterSystem Crossing) –
przejście między stanami o
różnej multipletowości, S

1

T

1

•

Przenoszenie energii

•

Wygaszanie

Diagram

Jabłońskiego

OR

OR

OR

1)

Różnica energii pasm wibracyjnych w widmie emisji

odpowiada rozkładowi poziomów oscylacyjnych w stanie
podstawowym

2)

Widmo absorpcji i widmo fluorescencji są położone

symetrycznie względem nakładających się na siebie pasm 0

0 (w

roztworach występuje rozsunięcie)

3)

Przesunięcie Stokesa – widmo emisyjne jest przesunięte

względem widma absorpcji w stronę fal dłuższych. Przesunięcie
wzrasta gdy geometria stanu wzbudzonego i stanu podstawowego
znacznie się różnią.

Reguła symetrii zwierciadlanej

Widmo absorpcji i widmo emisji

Przejścia oscylacyjne –symetria zwierciadlana

Reguła Wawiłowa

Wydajność kwantowa fluorescencji (

φ

) nie zależy od długości fali światła

wzbudzającego

Zależy od względnej szybkości (czasów życia) wszystkich procesów

dezaktywacyjnych

(k = 1/

τ

)

Metoda pomiaru wydajności kwantowej fluorescencji

Względna – porównanie ze standardem (np siarczan chininy)

Wydajność kwantowa fluorescencji

F

Q

τ

τ

ϕ

=

+

+

+

=

]

[

k

k

k

k

k

Q

ISC

n

F

F

anych

zaabsorbow

fotonow

liczba

h

emitowanyc

fotonow

liczba

=

ϕ

A

Awz

wz

d

d

−

−

∞

∞

−

−

×

=

∫

∫

10

1

10

1

~

)

~

(

I

~

)

~

I(

0

wz

0

ν

ν

ν

ν

ϕ

ϕ

Aparatura – fluorymetr i spektrofluorymetr

Ź

ródło promieniowania

wzbudzającego

Monochromator
wzbudzający

Próbka w komorze

pomiarowej

(geometria 90

o

)

Monochromator

emisyjny

Detektor

Spektrofluorymetr

1.

Włókno optyczne

2.

Szczelina wejściowa

3.

Filtr

4.

Kolimator

5.

Siatka dyfrakcyjna

6.

Zwierciadło

7.

Płytka optyczna

8.

Detektor CCD

Miniaturowe spektrofotometry i spektrofluorymetry

Wymiary: 89 x 63 x 34.4 mm

Masa: 190 g (bez kabla)

Włókno optyczne

Zasada działania polichromatora w

miniaturowym spektrofluorymetrze

Zasada działania detektora diodowego CCD

w miniaturowym spektrofluorymetrze

Idealny spektrofluorymetr powinien powinien posiadać
komponenty o następujących cechach:
Intensywność źródła niezależna od dł. fali
Wydajność monochromatora niezależna od

λ

Stała czułość detektoera w całym zakresie UV Vis.
Rzeczywistość jest daleka od ideału!!!

Chatrakterystyka spektrofluorymetru

Light Source

Intensywność lampy

zależy od długości

fali promieniowania

Aparatura – fluorymetr i spektrofluorymetr

Ź

ródło promieniowania

wzbudzającego

Monochromator
wzbudzający

Próbka w komorze

pomiarowej

(geometria 90

o

)

Monochromato

r emisyjny

Detektor

¨

Widmo wzbudzenia – monochromator emisyjny

ustawiony jest na określoną długość fali w zakresie
fluorescencji,

natomiast

monochromator

wzbudzający

przemiata długość fali promieniowania wzbudzającego

(l (

λ

em

= constant,

λ

wzb

zmienia się)

¨

Widmo emisji – monochromator wzbudzający

ustawiony na określoną długość fali absorbowaną przez
próbkę, natomiast monochromator emisyjny przemiata i
analizuje emitowane światło

(

λ

wzb

= constant,

λ

em

zmienia się)

Rodzaje widm fluorescencji

Widma wzbudzenia (E), fluorescencji (F) i

fosforescencji (P)

gdzie k stała charakterystyczna dla danej substancji i warunków pomiarowych.

Ponieważ

ε

cl w pomiarach fluorescencyjnych jest <0.1, pomija się dalsze wyrazy

w szeregu wykładniczym i

Zależność ta jest podstawą pomiarów ilościowych i jest spełniana w

ograniczonym zakresie stężeń (roztwory bardzo rozcieńczone

)

Natężenie promieniowania fluorescencyjnego

...)

38

.

0

15

.

1

30

.

2

(

)

10

1

(

3

3

3

2

2

2

0

0

−

−

−

=

−

=

−

b

c

b

c

cb

kI

kI

F

cb

ε

ε

ε

ε

cb

kI

F

ε

0

30

.

2

=

Błędy w pomiarach

fluorescencji

Fluorescencyjny czas życia

(τ

F

) – pomiar

Bardzo krótki impuls światła (<10

-9

sec z lasera pulsowego)

wzbudza cząsteczki do stanu S

n

Po błysku następuje pomiar natężenia fluorescencji w funkcji

czasu

Mierzony zanik fluorescencji jest procesem pierwszego rzędu

(zależy tylko od stężenia wzbudzonym czasteczek i stałej
zaniku, k = 1 /

τ

F

.

Wyrażony za pomocą mierzonej intensywności (F):

F = exp (t

/

τ

F

) i

k = 1/

τ

F

Wieloparametrowość Fluorescencji

Fluorescencyjny czas życia stanu wzbudzonego

Fluorescencja czasowo rozdzielcza
Time Resolved Fluorescence (TRF)

Zastosowanie spektroskopii fluorescencyjnej

Bardzo wysoka czułość; niskie granice oznaczalności (do 10

-10

M)

1)

Medycyna i analiza kliniczna –ozn. witamin, enzymów, hormonów, środków

dopingujących.

2) Farmacja –badania metabolizmu (barbiturany, amfetamina, LSD)

3)

Biochemia – detekcja i oznaczanie śladów enzymów, koenzymów, lipidów, kwasów

nukleinowych, protein, chlorofilu

4)

ś

ywność – detekcja śladowych komponentów w produktach spożywczych

(aminokwasy, witaminy, proteiny, toksyny)

5)

Ś

rodowisko –powietrze, woda i gleby (policykliczne węglowodory aromatyczne PAH,

aflatoksyny, PCB, fenole, pestycydy)

6) Analiza organiczna i nieorganiczna – oznaczanie wszelkich substancji fluoryzujących

Inne – detekcja w HPLC, sensory fluorescencyjne, badania fotochemiczne i fotofizyczne

stanów wzbudzonych, spektroskopia czasów życia - techniki impulsowe ,

mikroskopia

Wizualizacja obiektów biologicznych z

wykorzystaniem fluorescencji

Mikroskopia Fluorescencyjna

–Bazuje na detekcji cząsteczek fluoryzujących,
które barwią obiekt

–Absorbują światło o danej dł. Fali i emitują światło
o innej

λ

•Obiekt oglądany przez filtr, który przepuszcza tylko
emitowane światło

–Tło jest czarne

Układ optyczny
Mikroskopu
Fluorescencyjnego

Fluoresceina

-wzbudzona

blue

light

(450-490)

-emituje

green

light

(520-560)

Białka szkieletowe
widoczne jako
zielona
fluorescencja

Centromery –

czerwona
fluorescencja

DNA – niebieski
barwnik
fluorescencyjny

Fluorescencyjny obraz
komórki w mitozie

Mieszanina żywych i martwych chromosomów (zabitych
izopropanolem) bakterii Micrococcus luteus.

Barwione dwoma barwnikami DNA: DAPI i SYTOX Green.

ś

ywe i martwe

Chromosomy

Obraz fluorescencyjny dwóch
pantofelków Tetrahymena
thermophila, sześć godzin po
połączeniu. Jądra i jąderka są
barwione barwnikiem DNA,
SYTOX Green.

Reprodukcja pantofelka