EDUKACJA

Wykład im. prof. Janiny Misiewicz Lecture in memory of Prof. Janina Misiewicz Marek Jakóbisiak

Zakład Immunologii Centrum Biostruktury Warszawskiego Uniwersytetu Medycznego Perspektywy terapii genowej

Perspectives in gene therapy

Pneumonol. Alergol. Pol. 2009; 77: 289–293

Terapię genową można zdefiniować jako tera-

—

wektory wirusowe mogą być niebezpieczne pię opartą na wprowadzaniu genów do komórek pa-dla pacjentów;

cjenta w celu uzyskania efektu terapeutycznego. Do

—

użycie wektorów retrowirusowych może do-wprowadzania genów do komórek używa się jako prowadzić do powstania „nowych” wirusów; nośników tak zwanych wektorów. Najczęściej

—

istnieje ryzyko, że zmianom genetycznym w próbach klinicznych używane są: adenowirusy, mogą ulec komórki płciowe pacjenta; retrowirusy, nagie plazmidowe DNA, a także wiru-

—

powstaną pokusy genetycznego „ulepszania”

sy krowianki, tak zwane wirusy związane z adeno-człowieka;

wirusami i lipofektyną [1, 2]. Zalety i wady najczę-

—

wiedza zdobyta w trakcie doskonalenia tera-

ściej stosowanych wektorów podano w tabeli 1.

pii genowej może być wykorzystana do celów Chociaż na świecie przeprowadzono lub pro-wojny biologicznej;

wadzi się już w sumie około 1500 prób klinicznych,

—

w wyniku terapii genowej zmarło już kilku pa-obejmujących kilka tysięcy pacjentów cierpiących cjentów.

na wiele chorób, to nadal terapia genowa u ludzi Wielu ludzi dopatruje się w terapii genowej budzi wiele dyskusji i emocji. W ocenie jej dotych-wręcz zagrożenia dla ciągłości naszego gatunku.

czasowych dokonań należy podkreślić, że nie sta-Padają też oskarżenia o marnotrawienie olbrzy-

ła się ona dotąd wiodącą metodą w leczeniu jakiej-mich pieniędzy, które można by spożytkować na kolwiek choroby. W większości przypadków pró-

bardziej konkretne i realne cele medyczne.

by tej terapii dały wyniki bardzo skromne albo nie Żadna z zatwierdzonych ani planowanych te-dały żadnych pozytywnych rezultatów. Orędow-rapii genowych nie dotyczy jednak wprowadzania nicy terapii genowej przewidują jednak, że w nad-genów do komórek płciowych lub ich prekursorów, chodzących latach stanie się ona wiodącą metodą a więc nie powinno być realnego niebezpieczeń-

w leczeniu wielu chorób. Krytycy terapii genowej stwa, że poddany terapii genowej osobnik będzie z kolei dopatrują się w niej wielu zagrożeń i nie-przekazywać wprowadzony gen swojemu potom-bezpieczeństw. Oto niektóre z nich: stwu. Istnieją opinie, że prędzej czy później zde-Adres do korespondecji: prof. dr hab. n. med. Marek Jakóbisiak, Zakład Immunologii, Centrum Biostruktury, Warszawski Uniwersytet Medyczny, ul. Banacha 1a, budynek F, 02–097 Warszawa, tel.: [phone], faks: (022) 599 21 94, e-mail: [e-mail] Praca wpłynęła do Redakcji: 28.01.2009 r.

Copyright © 2009 Via Medica

ISSN 0867–7077

www.pneumonologia.viamedica.pl

289

Pneumonologia i Alergologia Polska 2009, tom 77, nr 3, strony 289–293

Tabela 1. Zalety i wady wektorów najczęściej używanych w terapii genowej u ludzi Table 1. Advantages and disadvantages of gene therapy Wektory

Zalety

Wady

Adenowirusy

Komórki dzielące się i niedzielące się Immunogenność

Retrowirusy

Łatwość użycia

Tylko komórki dzielące się, mutageneza Plazmidowe DNA

Łatwość produkcji, duża wielkość genu Mała wydajność wprowadzania genu cydujemy się na to, ponieważ tylko wymiana zmu-Wydaje się, że u dzieci, które zachorowały na ostrą towanego genu — odpowiedzialnego za dzie-białaczkę limfatyczną, ważną przyczyną transfor-dziczną chorobę — na gen prawidłowy może na macji nowotworowej prowadzącej do białaczki stałe znieść ryzyko przenoszenia jej z pokolenia na było wbudowanie się wektora retrowirusowego pokolenie. Na razie nie jest znana skuteczna i niew pobliżu protoonkogenu LMO-2 [4]. Niestety, jed-zawodna metoda wymiany uszkodzonego genu. Pra-no z tych dzieci już zmarło. Od tego czasu uczy-cuje się nad przystosowaniem do tego celu rekom-niono wiele, aby zmniejszyć ryzyko związane binacji homologicznej. Dotychczas nie wydano rów-z użyciem wektorów wirusowych w terapii genowej, nież zgody na próby genetycznego manipulowania a także doskonali się niewirusowe metody wpro-inteligencją człowieka, ale zakaz ten jest o tyle łatwy wadzania genów do komórek. Można by zapytać, do przestrzegania, że ludzie jeszcze tego nie potra-dlaczego w przypadku ciężkiego złożonego niedo-fią. Gdy sztuka ta zostanie opanowana, zapewne boru odporności próbuje się stosować nadal obcią-

trudno będzie upilnować przestrzegania takiego żoną ryzykiem terapię genową, zamiast przeszcze-zakazu. Natomiast rzeczywiście terapia ta jest, przy-pienia szpiku. Należy jednak pamiętać, że prze-najmniej na razie, bardzo kosztowna.

szczepienie szpiku też jest obarczone ryzykiem (od-Pierwszą próbę terapii genowej u ludzi prze-rzucenie, reakcja przeszczepu przeciw gospodarzo-prowadzono w Stanach Zjednoczonych w 1990

wi), a w dodatku nie dla wszystkich pacjentów roku u dwojga dzieci cierpiących na ciężki złożo-można znaleźć odpowiedniego dawcę. Krytycy te-ny niedobór odporności wywołany brakiem deza-rapii genowej głoszą, że choć zabiła ona już pierw-minazy adenozyny. Ostatnie lata przyniosły zarów-szych pacjentów, to jeszcze nikogo nie uratowała.

no pierwsze poważne porażki, jak i sukcesy tera-Twierdzenie to jest tylko w połowie prawdziwe, pii genowej. W 1999 roku zmarł w następstwie te-ponieważ żyją młodzi pacjenci poddani terapii rapii genowej młody pacjent cierpiący na niedo-genowej z powodu ciężkiego, złożonego niedobo-bór transkarbamylazy ornityny, ale w 2000 roku ru odporności związanego z chromosomem X, któ-

z kolei opublikowano pierwsze udane wyniki tej te-rzy zawdzięczają życie tej właśnie terapii. Jedną rapii u dzieci z ciężkim złożonym niedoborem od-z niewirusowych metod wprowadzania genów do porności, związanym z chromosomem X. Spośród komórek jest użycie w tym celu plazmidowego około 20 dzieci cierpiących na ten niedobór i pod-DNA, które można zamknąć w liposomach albo danych terapii genowej, czworo zachorowało na można opłaszczyć nim na przykład mikroskopijne białaczkę będącą powikłaniem terapii [3]. Był to kulki złota i wstrzeliwać je przy użyciu tak zwane-wielki cios w nadzieje pokładane w tej metodzie go pistoletu genowego do warstwy podstawnej na-leczniczej. Jako „narzędzi” (wektorów) do wprowa-skórka lub do odsłoniętych operacyjnie mięśni.

dzania genów do ludzkich komórek używa się, jak Chociaż nie można obecnie rozstrzygnąć wspomniano, najczęściej wirusów. W przypadku wszystkich sporów dotyczących terapii genowej, porażki w 1999 roku użyto w tym celu adenowi-to powinniśmy przynajmniej bardzo pilnie i uważ-

rusów, a w przypadku dzieci leczonych z powodu nie śledzić jej postępy. Ci lekarze, którzy z góry niedoboru odporności były to retrowirusy. W tym odrzucają i wyśmiewają terapię genową, próbują ostatnim przypadku spełniły się niestety obawy ge-często po prostu zamaskować swoją ignorancję netyków, którzy ostrzegali, że używając wektorów i brak podstawowej wiedzy, niezbędnej do zrozu-retrowirusowych, stwarza się ryzyko, że któryś mienia zasad, na których się ona opiera.

z nich wbuduje się przypadkowo w pobliżu które-Terapię genową próbuje się stosować w około goś z protoonkogenów, wzmacniacze ( enhancers) stu chorobach u ludzi [1] (tab. 2). Najwięcej prób obecne w genach wirusowych przekształcą go klinicznych terapii genowej dotyczy nowotworów.

w onkogen, a komórkę, w której doszło do tego nie-Terapia genowa nowotworów opiera się na wielu fortunnego zdarzenia, w komórkę nowotworową.

różnych podejściach terapeutycznych [5]. Te spo-290

www.pneumonologia.viamedica.pl

Marek Jakóbisiak, Perspektywy terapii genowej Należy przyznać, że w doświadczeniach na Tabela 2. Próby stosowania terapii genowej u ludzi (nie-zwierzętach wiele spośród tych terapii genowych które choroby)

dało bardzo zachęcające wyniki, a nawet prowa-Table 2. Clinical trials of gene therapy (selected diseases) dziło w niektórych przypadkach do całkowitych wyleczeń. Chodzi prawdopodobnie o to, że limfo-Nowotwory

cyty, pobudzone przez tak sztucznie otrzymane Wrodzone niedobory odporności

komórki nowotworowe, potrafią wyjść ze stanu Ciężki złożony niedobór odporności związany z brakiem swoistego uśpienia i rozwinąć skuteczną odpo-dezaminazy adenozyny

wiedź przeciwnowotworową, zdolną do zabicia nie Ciężki złożony niedobór odporności związany z mutacją genu tylko sztucznie otrzymanych komórek nowotwo-dla łańcucha gc receptora dla interleukin: 2, 4, 7, 9, 15 i 21

rowych, ale także pozostałych, niezmienionych Przewlekła choroba ziarniniakowa komórek nowotworowych — nawet tych, które Choroby płuc

tkwią gdzieś ukryte w przerzutach. Nic dziwnego, Mukowiscydoza

że rozpoczęto już próby kliniczne. Pacjentów Niedobór a-1-antytrypsyny

szczepiono komórkami nowotworowymi transfe-Hemofilia

kowanymi genami dla: interferonu-g, IL-2, IL-4, IL-6, Choroby naczyń

IL-7, IL-12, IL-24, czynnika martwicy nowotworu (TNF, tumor necrosis factor) i czynnika stymu-Choroba wieńcowa

lującego tworzenie kolonii granulocytów i makro-Choroba tętnic obwodowych

fagów (GM-CSF, granulocyte-macrophage colony-Zaburzenia wzwodu

-stimulating factor). Rozważa się również szczepie-Choroby spichrzeniowe, np. Huntera, Hurlera, Gauchera nie komórkami nowotworowymi z genami dla Reumatoidalne zapalenie stawów

dwóch różnych cytokin wzmacniających swoje Choroba Parkinsona

działanie przeciwnowotworowe. Do komórek no-Choroba Alzheimera

wotworowych pacjenta, które mają być użyte jako szczepionka, wprowadza się również geny dla czą-

Padaczka

steczek głównego układu zgodności tkankowej Dystrofia mięśniowa Duchenne’a

(MHC, major histocompatibility complex), aby mo-Degeneracja siatkówki

gły prezentować antygeny nowotworowe albo geny AIDS

dla cząsteczek kostymulujących, których brakuje Hemoglobinopatie

na ogół na komórkach nowotworowych.

W innej metodzie terapii genowej antygen nowotworowy poddaje się takim manipulacjom, że śród nich, które dały najbardziej obiecujące wyni-staje się bardziej immunogenny, a więc skutecz-ki w doświadczeniach na zwierzętach, próbuje się niej pobudza odpowiedź immunologiczną przeciw już realizować w terapii genowej nowotworów komórkom nowotworowym pacjenta. Efekt ten człowieka.

uzyskuje się, zmieniając antygen, tak żeby lepiej Największa grupa terapii genowych wypróbo-pasował do rowka prezentującej go limfocytom T

wywanych w klinice opiera się na wprowadzaniu cząsteczki MHC albo żeby lepiej pasował do recep-do pobranych od pacjenta komórek nowotworo-tora rozpoznającego go limfocytu T.

wych genów dla tych cytokin, które wydzielane Zachęcające wyniki otrzymano w próbach te-w normalnych warunkach przez limfocyty lub ma-rapii genowej u pacjentów z czerniakiem, izolując krofagi najefektywniej pobudzają układ odporno-od nich, namnażając i „udoskonalając” ich limfo-

ściowy przeciw nowotworowi [6].

cyty T cytotoksyczne (Tc) [7]. Jak wspomniano, Chodzi o to, żeby układ odpornościowy wy-u chorego na nowotwór rozwija się bardzo często prowadzić ze stanu anergii i tolerancji w stosun-tolerancja immunologiczna na antygeny nowotwo-ku do antygenów nowotworowych. Sztucznie rowe, co uniemożliwia pobudzenie odpowiedzi otrzymane komórki nowotworowe wydzielają lo-jego limfocytów T przeciw komórkom nowotwo-kalnie cytokiny, mające na celu przełamanie tego rowym. Aby ominąć ten problem, izoluje się od niekorzystnego dla pacjenta stanu tolerancji. Przed chorego limfocyty T, pobudza się je bardzo immu-podaniem w formie szczepionki tych zmienionych nogennymi antygenami nienowotworowymi, na komórek nowotworowych, na wszelki wypadek przykład wirusowymi lub transplantacyjnymi, tak poddaje się je działaniu promieniowania jonizują-

żeby wytworzyć efektywne limfocyty Tc, namna-cego w dawce na tyle wysokiej, żeby nie mogły ża się je przez inkubację z odpowiednimi cytoki-proliferować.

nami, zwiększając nawet tysiące razy ich liczbę, www.pneumonologia.viamedica.pl

291

Pneumonologia i Alergologia Polska 2009, tom 77, nr 3, strony 289–293

i wprowadza się do nich geny kodujące „sztuczne”

aparatu rentgenowskiego. Otrzymano zachęcające receptory rozpoznające antygeny nowotworowe.

wyniki. U trzech spośród dziewięciu pacjentów za-Kolejne podejście w terapii genowej nowotwo-obserwowano regresję guza. Kolejne próby tej te-rów oparte jest paradoksalnie na wykorzystaniu rapii podjęto nie tylko w przypadku raka płuc, ale niepowodzeń obserwowanych w trakcie chemio-także raka głowy i szyi, w przypadku raka wątro-terapii niektórych nowotworów. Wiadomo, że re-by oraz w przypadku innych nowotworów. Warto misja nowotworu, którą obserwuje się po pierw-dodać, że wzmaga ona działanie chemioterapii i ra-szym kursie chemioterapii, kończy się często dioterapii. W raku jajnika próbuje się z kolei wpro-wznową procesu nowotworowego. Jeżeli pacjenta wadzać do komórek nowotworowych antyonkogen z tak odnawiającym się nowotworem podda się po-BRCA1. Terapia oparta na podawaniu p53 jest nownie chemioterapii, to niestety nierzadko obser-pierwszą zatwierdzoną terapią genową na świecie.

wowany jest brak lub znaczne osłabienie odpowie-Została dopuszczona w Chinach do leczenia raka dzi na zastosowane leczenie. Okazało się, że za głowy i szyi [8]. Należy wspomnieć, że próbuje się takie niepowodzenie często odpowiada pojawienie również tak zmodyfikować antyonkogeny, żeby się w błonie komórek nowotworowych glikoprote-skuteczniej sprawowały swoje funkcje supresji no-iny P kodowanej przez gen oporności wieloleko-wotworów. Niestety niektóre zmienione w ten spo-wej (MDR, multi-drug resistance). Glikoproteina ta sób antyonkogeny zmniejszają co prawda ryzyko działa — w najprostszym ujęciu — jak pompa usu-rozwoju nowotworu, ale za cenę przyspieszonego wająca lek z komórki. Nic więc dziwnego, że wy-starzenia się.

posażone w nią komórki nowotworowe będą opor-Interesującym podejściem w terapii genowej ne nie tylko na jeden, ale na wiele chemioterapeu-nowotworów jest użycie tak zwanych wirusów tyków — stąd nazwa genu.

onkolitycznych [9]. Najbardziej zaawansowane są Aby zrozumieć, jak powyższe obserwacje wy-próby stosowania u pacjentów chorujących na raka korzystuje się w terapii genowej, należy jeszcze głowy i szyi adenowirusa Onyx-015, który wydaje zastanowić się, dlaczego w chemioterapii nowo-się wybiórczo niszczyć komórki nowotworowe ze tworów nie stosuje się dostatecznie wysokich da-zmutowanym antyonkogenem p53.

wek leków gwarantujących eliminację wszystkich Dla powstania nowotworu często dominujące komórek nowotworowych w organizmie pacjenta znaczenie ma aktywacja protoonkogenu, prze-i pewne wyleczenie bez groźby wznowy nowotwo-kształcająca go w onkogen, który w sposób niekon-ru. Dawek takich nie stosuje się dlatego, że byłyby trolowany pobudza proliferację komórek lub —

one również toksyczne dla szybko proliferujących rzadziej — chroni je przed apoptozą. W tych przy-komórek krwiotwórczych i choć zniszczyłyby no-padkach pomyślano o metodach, które blokowa-wotwór, to spowodowałyby śmierć pacjenta. Pomy-

łyby czynność takiego onkogenu. Do tego celu pró-

ślano więc, żeby najpierw wyposażyć komórki buje się stosować tak zwane oligonukleotydy an-krwiotwórcze pacjenta w glikoproteinę P, a dopie-tysensowne, rybozymy albo mały interferujący ro potem poddać go chemioterapii w wysokiej daw-RNA (siRNA, small interfering RNA). Czynniki te są ce. W tym celu izoluje się macierzyste komórki komplementarne dla nici określonego RNA, hybry-krwiotwórcze pacjenta, wprowadza się do nich gen dyzując w związku z tym tylko z mRNA, na które-MDR, zapewniając w nich odpowiednio wysoką go matrycy ma powstać produkt białkowy określo-ekspresję glikoproteiny P, i zwraca się je ponow-nego onkogenu. W wyniku tego połączenia swoiście nie pacjentowi. Teraz można mu podać nawet kil-blokują one ekspresję określonego onkogenu. Prze-kakrotnie wyższą dawkę leków w porównaniu prowadzono już wiele prób inaktywacji określonych z dawką normalnie dopuszczalną. Pomysł ten re-onkogenów przy użyciu oligonukleotydów antysen-alizuje się już obecnie w kilku próbach klinicz-sownych u chorych na różne nowotwory, ale jak na nych, między innymi w leczeniu raka sutka, raka razie ten kierunek poszukiwań nie dał zachęcających jajnika, raka pęcherza i chłoniaka nieziarniczego.

wyników [10]. Rybozymy blokujące funkcje określo-Wiele emocji budzi terapia genowa oparta na nych genów HIV próbowano stosować u pacjentów wprowadzaniu do komórek nowotworowych —

z AIDS, natomiast siRNA , między innymi do hamo-pozostałych w miejscu usuniętego chirurgicznie wania syntezy VEGF ( vascular endothelial growth guza — antyonkogenu, który w komórkach tego factor) u chorych ze związaną z wiekiem degeneracją nowotworu uległ unieczynnieniu. Pierwsze próby siatkówki i u pacjentów z AIDS, którzy nie odpowia-terapii genowej z zastosowaniem antyonkogenu dają na stosowaną standardowo terapię wielolekową.

p53 podjęto w przypadku raka płuc. Do ognisk no-Wdzięcznym obiektem terapii genowej jest wotworowych wprowadzono prawidłowy gen p53

hemofilia. Wynika to z tego, że nawet jeżeli w na-przy użyciu bronchoskopu lub igły pod kontrolą stępstwie terapii genowej uzyska się poziom czyn-292

www.pneumonologia.viamedica.pl

Marek Jakóbisiak, Perspektywy terapii genowej nika krzepnięcia VIII lub IX około 2% normy, chro-ryny, która jest białkiem neurotropowym podobni się już leczone dziecko przed najbardziej uciąż-

nym do czynnika neurotrofowego pochodzącego liwymi powikłaniami hemofilii, jakimi są sponta-z komórek glejowych. Z kolei w chorobie Alzheime-niczne wylewy do mięśni i stawów, które prowadzą ra prowadzone są próby wprowadzania do mózgu nieuchronnie do kalectwa. W próbach terapii ge-pacjentów autologicznych fibroblastów, wyposa-nowej w hemofilii uzyskano już nawet poziom żonych w gen dla czynnika wzrostu nerwu.

czynnika krzepnięcia rzędu kilkunastu procent normy, ale jak na razie, niestety tylko przejściowo.

Piśmiennictwo

W próbach leczenia choroby wieńcowej lub 1.

Edelstein M.L., Abedi M.R., Wixon J. Gene therapy clinical trials choroby naczyń obwodowych wprowadza się do-worldwide to 2007 — a update. J. Gene Med. 2007; 9: 833–842.

mięśniowo lub dotętniczo geny dla czynników sty-2.

Flotte T.R. Gene therapy: the first two decades and the current state-of-the-art. Cell. Physiol. 2007; 213: 301–305.

mulujących powstawanie naczyń, takich jak: czyn-3.

Hacein-Bey-Abina S., Garrigue A., Wang G.P., Soulier J., Lim A., nik wzrostu śródbłonka naczyń, czynnik wzrostu Morillon E. Insertional oncogenesis in 4 patients after retrovi-rus-mediated gene therapy of SCID-X1. J. Clin. Invest. 2008; fibroblastów, czynnik wzrostu hepatocytów i czyn-118: 3132–3142.

nik indukowany przez hipoksję [11].

4.

Thrasher A.J. Gene therapy for primary immunodeficiencies.

Immunol. Allergy Clin. N. Am. 2008; 28: 457–471.

Zachęcające są wstępne wyniki prób leczenia 5.

Prados J., Melguizo C., Boulaiz H., Marchal J.A., Aranega A.

przy użyciu terapii genowej wrodzonej degenera-Cancer gene therapy: strategies and clinical trials. Cell. Mol.

Biol. 2005; 51: 23–36.

cji siatkówki [12]. Jeżeli chodzi o schorzenia neu-6.

Podhajcer O.L., Lopez M.V., Mazzolini G. Cytokine gene transfer for rologiczne, to bardzo zaawansowane wydają się cancer therapy. Cytokine Growth Factor Rev. 2007; 18: 183–194.

7.

Leen A.M., Rooney C.M., Foster A.E. Improving T cell therapy próby terapii genowej w chorobie Parkinsona [13].

for cancer. Ann. Rev. Immunol. 2007; 25: 243–265.

W próbach tych wprowadza się między innymi gen 8.

Jia H. Gene therapy finds welcoming environment in China.

Nature Med. 2006; 12: 263.

dla dekarboksylazy kwasu glutaminowego do ją-

9.

Liu T.C., Kirn D. Gene therapy progress and prospects in can-der niskowzgórzowych mózgu, który odpowiada za cer: oncolytic viruses. Nature Med. 2008; 15: 877–884.

10.

Gleave M.E., Monia B.P. Antisense therapy for cancer. Nature syntezę neurotransmitera o właściwościach hamu-Rev. Cancer 2005; 5: 468–479.

jących — kwasu g-aminomasłowego. W innej pró-

11.

Rissanen T.T., Yla-Herttuala S. Current status of cardiovascular gene therapy. Mol. Ther. 2007; 15: 1233–1247.

bie wprowadzano do prążkowia gen dla hydro-12.

Miller J.W. Preliminary results of gene therapy for retinal de-ksylazy tyrozyny — nadający zdolność do syntezy generation. N. Engl. J. Med. 2008; 358: 2282–2284.

13.

Alton E., Ferrari S., Griesenbach U. Progress and prospect: Gene L-dopa lub do skorupy ( putamen) gen dla neurtu-therapy clinical trials (Part 1). Gene Ther. 2007; 14: 1439–1447.

www.pneumonologia.viamedica.pl

293