Ćwiczenie 9

Cukry proste

Wyciąg z kart charakterystyki substancji niebezpiecznych

-

α-naftol – T+

-

etanol 96% – F

-

kwas siarkowy – C

-

benzydyna – T, N, R/M1

-

kwas octowy – C

-

kwas solny – C

-

odczynniki Fehlinga I – N

-

odczynniki Fehlinga II – C

-

odczynnik Nylandera – C

-

rezorcyna – Xn, N

Cukry proste (monosacharydy, jednocukry) to najprostsze węglowodany. Są one syntetyzowane w organizmach samożywnych w procesie fotosyntezy i chemosyntezy. Ich nazewnictwo chemiczne opiera się na ilości atomów węgla w cząsteczce, których może być od 3 do 8. Stąd mówimy o triozach posiadających 3 atomy węgla i konsekwentnie o tetrozach, pentozach (zwyczajowe nazwy: arabinoza, ksyloza, ryboza), heksozach (zwyczajowo: glukoza, fruktoza, galaktoza, mannoza), heptozach i oktozach, które mają odpowiednio 4, 5, 6, 7 i 8 atomów węgla. Ogólny, sumaryczny wzór cząsteczki monosacharydu to CnH2nOn.

Ze względu na klasyfikacje chemiczną monocukry należą do polihydroksyketonów lub polihydroksyaldehydów, w zależności od występującej w cząsteczce grupy ketonowej lub aldehydowej.

Charakterystyczna jest także obecność w cząsteczce cukru asymetrycznych atomów węgla, które połączone z 4 rożnymi podstawnikami, tworzą tzw. centra chiralności. Efektem tego jest występowanie cząsteczek cukrów w formach stereoizomerów.

Charakterystyka fizykochemiczna: monosacharydy są substancjami krystalicznymi, bez zapachu, o słodkim smaku. Dobrze rozpuszczają się w wodzie a słabo w alkoholu etylowym. Dają reakcje właściwe aldehydom i ketonom, np. redukują odczynniki Tollensa i Fehlinga, utleniając się do kwasów aldonowych (D-glukoza do kwasu D-glukonowego), redukowane tworzą alditole (np. D-glukoza — sorbitol), z alkoholami lub fenolami tworzą glikozydy, a z innymi cząsteczkami sacharydów — di-, oligo- lub polisacharydy; monosacharydy ulegają także reakcjom właściwym alkoholom — tworzą estry z kwasami (np. glukozo-6-fosforan), utleniają się do kwasu uronowego (np. kwas glukuronowy). Wchodzą także w skład glikolipidów, glikoprotein oraz kwasów nukleinowych.

Literatura:

„Biochemia” J. Berg, J. Tymoczko, L. Stryer, PWN, 2005

„Biochemia Harpera” R.K. Murray i in., Wydanictwo Lekarskie PZWL, 2006

1. Analiza jakościowa monosacharydów

Reakcje kondensacji

Pod wpływem stężonych kwasów nieorganicznych cukry ulegają dehydratacji z utworzeniem pochodnych furfuralowych, przy czym heksozy tworzą 5-hydroksymetylenofurfural, a pentozy – furfural. Powstałe związki kondensują z fenolami, chinonami czy aminami aromatycznymi tworząc połączenia triarylometanowe o charakterystycznym zabarwieniu. Reakcje te są wykorzystywane do identyfikacji, różnicowania i oznaczeń ilościowych cukrów.

Dehydratacja

OH H (lub

CH OH)

H (lub

CH OH)

2

2

HC

CH

OH

H +

HC

C

O

HC

CH

OH

- 3 H O

2

HC

C

O

O

OH C

C

H

H

pentoza (lub heksoza)

furfural (lub 5-hydroksymetylenofurfural)

1.1 Reakcja Molischa (kondensacja z fenolem)

Jest to najbardziej ogólna reakcja wykrywająca cukry i to zarówno te wolne jak i związane. Jest jednak mało specyficzna, gdyż jej dodatni wynik może również świadczyć o obecności aldehydów i ketonów.

1

o

dczynniki : 1% glukoza, 20% α-naftol w 95% etanolu (przechowywać w ciemności w temp.

pokojowej), stęż. H2SO4

s

przęt : 1 probówka szklana długa, pipeta szklana, pipety automatyczne, worteks w

ykonanie : do 1 ml roztworu glukozy dodać 0,5 ml świeżo przygotowanego roztworu α-naftolu i wymieszać. Następnie podwarstwić 1 ml stężonego H2SO4, nie mieszać (do pipetowania stężonego H2SO4 używać szklanej pipety Pasteur’a). Na granicy faz pojawia się fiołkowo-malinowe zabarwienie.

O

OH

C

H

2

+

O

O

C

OH

H lub (

CH OH)

2

O

furfural lub

H

lub (

CH OH)

hydroksymetylenofurfural

2

α − naftol

fiolkowomalinowy

1.2 Reakcja Taubera (kondensacja z benzydyną – aminą aromatyczną) o

dczynniki : 0,5% arabinoza, 1% glukoza, 4% benzydyna w lodowatym kwasie octowym s

przęt : 2 probówki szklane długie, pipety automatyczne, worteks wykonanie: do dwóch probówek odpipetować po 0,5 ml roztworu benzydyny. Do jednej probówki dodać 1 ml roztworu arabinozy, a do drugiej 1 ml roztworu glukozy, wymieszać i ogrzewać do wrzenia. Pentozy w tych warunkach dają zabarwienie czerwone, a heksozy żółte lub brunatne.

O

C

H

H

H

- 3 H O

2

H N

NH

2 O

+

H

C

N

N

C

H

2

2

O

O

lub (

CH OH)

2

H lub (

CH OH)

lub (

CH OH)

2

2

benzydyna

furfural lub

czerwony (lub zóltobrunatny)

hydroksymetylenofurfural

1.3 Reakcja Seliwanowa (kondensacja z rezorcyną – fenodiol) Pozwala na odróżnienie aldoz od ketoz. Ważne jest zachowanie odpowiednich warunków reakcji, tzn.: stężenie użytego kwasu solnego powinno wynosić 12% a czas ogrzewania - 30 sekund. W tych warunkach ketozy przechodzą w hydroksymetylenofurfural, natomiast aldozy pozostają niezmienione. Jeżeli użyje się bardziej stężonego kwasu lub wydłuży czas ogrzewania, to wówczas aldozy również ulegają dehydratacji i dają odczyn dodatni – pojawia się czerwono-wiśniowe zabarwienie.

o

dczynniki : 0,5% fruktoza, 1% glukoza, stężony HCl, rezorcyna kryst s

przęt : 3 probówki szklane długie, pipety automatyczne, łaźnia wodna, szpatułka, stoper, worteks w

ykonanie : do pierwszej probówki odpipetowć 1 ml roztworu fruktozy, a do drugiej i trzeciej probówki po 1 ml roztworu glukozy. Do wszystkich probówek dodać po 0,5 ml stężonego HCl (otrzymuje się roztwór o stężeniu 12%), ogrzać do wrzenia w łaźni wodnej, a następnie probówki pierwszą i drugą utrzymywać we wrzeniu przez 30 sekund, natomiast probówkę trzecią utrzymywać we wrzeniu przez 3 min. Mieszaniny ostudzić, dodać kilka kryształków rezorcyny i ogrzać do wrzenia w łaźni wodnej. Porównać wyniki dla obu roztworów cukrów.

2

O

C

H

O

O

HO

HO

OH

O

2

+

H lub (

CH OH)

O

2

rezorcyna

furfural lub

H lub (

CH OH)

2

hydroksymetylenofurfural

czerwonowisniowy

1.4 Odczyn Fehlinga

W odczynie Fehlinga redukcji ulegają jony miedzi z Cu2+ do Cu+. Używa się odczynnika Fehlinga I, który zawiera CuSO4 oraz odczynnika Fehlinga II, który zawiera NaOH i winian sodowo-potasowy. Winian sodowo-potasowy zapobiega wytrącaniu się osadu Cu(OH)2, co może mieć miejsce przy małym stężeniu cukru. Sól ta wiąże jony Cu2+ tworząc kompleksową sól kwasu winowego.

odczynniki: 1% glukoza, odczynnik Fehlinga I i II

s

przęt : 2 długie probówki, palnik, worteks, pipety automatyczne w

ykonanie : w jednej probówce zmieszać 0,5 ml odczynnika Felinga I i 0,5 ml odczynnika Felinga II. Do drugiej probówki nalać 1 ml roztworu glukozy. Zawartość obu probówek ogrzewać do wrzenia. Oba roztwory zlać razem. Występuje zabarwienie lub brunatnoczerwony osad wydzielonego Cu2O.

CuSO4 + 2NaOH → Cu(OH)2 + Na 2SO4

COONa

COONa

HC

OH

HO

HC

O

+

Cu

Cu

2 H O

+

2

HC

OH

HO

HC

O

COOK

COOK

COONa

O

O

COONa

HC

O

C

H

+ H O

C

OH

HC

OH

Cu

2

+

+

+

Cu O

2

HC

O

CHOH

CHOH

HC

OH

c z e rw o n y o

COOK

R

R

COOK

o s a d

1.5 Odczyn Nylandera

Odczynnik Nylandera zawiera zasadowy azotan bizmutu, KOH i winian sodowo-potasowy, który spełnia tu tę samą rolę, co w odczynie Felinga i co cytrynian w odczynie Benedicta. Pod wpływem cukrów redukcji ulega Bi3+ do Bi0.

o

dczynniki : 1% glukoza, odczynnik Nylandera

s

przęt : probówka szklana długa, łaźnia wodna, worteks, pipety automatyczne w

ykonanie : do 5 ml 1% roztworu glukozy dodać kilka kropel odczynnika Nylandera, wymieszać i wstawić do wrzącej łaźni wodnej na 5 min. Wytrąca się czarny osad metalicznego bizmutu Bi(OH)2NO3 + KOH → Bi(OH)3 + KNO3

Bi(OH)

Bi 3+ +

3 OH -

3

3

O

O

3 C

H

+

+ 2 Bi(OH)

3 C

3

OH +

+ 2 Bi 0

+

+ 3 H O

2

winian

Na-K

R

R

czarny osad

glukoza

kwas glukonowy

2. Oznaczanie ilościowe monocukrów

Metoda antronowa

Jest to kolorymetryczna metoda oznaczania zawartości cukru w roztworze wykorzystująca powstawanie kompleksów pomiędzy furfuralowymi i hydroksymetylenofurfuralowymi pochodnymi cukrów a antronem.

Powstający kompleks o barwie niebiesko-zielonej ma maksimum absorpcji przy długości fali 600 nm. Jest to metoda niestechiometryczna więc wymaga sporządzenia krzywej kalibracyjnej.

O

C

H

H

H

O

O

C

O

2

+

O

H

H lub (

CH OH)

O

2

furfural lub

H

lub (

CH OH)

2

antron

hydroksymetylenofurfural

zielononiebieski

o

dczynniki : 1% glukoza (roztwór wzorcowy), próbki badane (roztwory cukru o nieznanym stężeniu), odczynnik antronowy

s

przęt : 20 probówek szklanych krótkich, szklana bagietka, pipety automatyczne, worteks, łaźnia wodna, czytnik do płytek titracyjnych, papier milimetrowy, stoper

w

ykonanie :

a) w krótkich szklanych probówkach przygotować zgodnie z tabelą wzrastające stężenia roztworu wzorcowego do krzywej kalibracyjnej oraz dwa roztwory z próbek o nieznanym stężeniu cukru; roztwory po przygotowaniu wymieszać.

Próbka

Obj. roztworu

Obj. wody

Stężenie cukru

A 600

badana

wzorcowego (µl)

(µl)

(mg/ml)

∅

0

1000

1

5

995

2

10

990

3

20

980

4

30

970

5

40

960

6

50

950

7

60

940

Obj. próbki

Obj.

Rozcieńczenie

A 600

Stężenie

badanej

wody (µl)

próbki

cukru (mg/ml)

(µl)

P1

50

950

P2

50

950

4

b) do 12-stu krótkich szklanych probówek odmierzyć 1,25 ml odczynnika antronowego i przy oziębianiu w zlewce z zimną wodą ostrożnie dodawać, mieszając bagietką szklaną, 0,25 ml badanego roztworu. Całość umieścić we wrzącej łaźni wodnej lna 10

minut, po wyjęciu oziębić pod bieżącą wodą. Z każdej probówki przenieść po 100 µl mieszaniny do dołków w płytce titracyjnej i zmierzyć wartość absorbancji przy λ = 600

nm wobec próby ślepej przy użyciu czytnika do płytek titracyjnych. Wyniki stężenia cukru dla badanych próbek odczytać w mg/ml z wykreślonej krzywej kalibracyjnej.

Odczynniki:

0,5% arabinoza, 0,5% fruktoza, 1% glukoza, 4% benzydyna w lodowatym kwasie octowym, 20% -naftol w 95% etanolu, stężony H2SO4, stężony HCl, rezorcyna kryst., odczynnik Fehlinga I i II, odczynnik Nylandera, odczynnik antronowy – 40 mg antronu w 25 ml stężonego H2SO4.

5