Ćwiczenie 13 - praktyka
Część praktyczna:
1. Wykonać preparaty mikroskopowe z następujących materiałów:
- próbki świeżego i zsiadłego mleka,
- zalewy z ogórków,
- soku z kiszonej kapusty,
- żurku,
- kefiru,
- jogurtu.
Technika sporządzania preparatów z mleka:
Próbki mleka przelać do probówek (po około 5 cm3) i ogrzewać w łaz
ni wodnej o
temp. 45 50ºC do momentu oddzielenia siÄ™ skrzepu od serwatki. Wykonać rozmaz z
serwatki. Preparat suszyć na powietrzu (nie ogrzewać nad płomieniem!). Utrwalić w metanolu
przez 3 minuty, odtłuścić kilkanaście sekund w eterze, spłukać wodą destylowaną przez
zanurzenie preparatu w zlewce z dużą ilością wody. Wysuszyć na powietrzu. Barwić fuksyną
do Grama około 2 minuty. Fuksynę spłukać delikatnie wodą w sposób podany wyżej.
Pozostałe preparaty:
Przygotować w sposób standardowy i barwić metodą Grama.
2. Analiza preparatów mikroskopowych
a) obserwacja mikroflory próbki świeżego i kwaśnego mleka
b) obserwacja mikroflory jogurtu i kefiru
c) ocena kiszonek
Na podstawie obrazu mikroskopowego oraz pomiaru pH ocenić jakość kiszonek, biorąc pod
uwagę następujące kryteria:
Stosunek drożdży do bakterii
kiszonka bardzo dobra
od 1:80 do 1:200; pH 3,5
kiszonka dobra
od 1:3 do 1:30; pH 4,5
Przy większej ilości drożdży i wyższym pH kiszonka złej jakości.
3. Wykonanie próby reduktazowej
a) 10 cm3 dokładnie wymieszanego mleka przenieść do sterylnej probówki i jałowo
dodać 0,5 cm3 błękitu metylenowego, zamienić korek z waty na jałowy korek z
tworzywa sztucznego lub zakleić parafilmem,
b) Dokładnie wymieszać zawartość probówki, obracając ją kilkakrotnie do góry
dnem,
c) Probówkę wstawić do łaz
ni wodnej o temp. 35 37ºC,
d) Jednocześnie umieścić w łaz
ni probówkę z 1 cm3 mleka i z termometrem w celu
stwierdzenia, kiedy zawartość probówki osiÄ…gnie temp. 37ºC,
e) Od tego momentu liczyć czas inkubacji mleka w łaz
ni. Obserwacje prowadzić na
początku, co 10 min., a póz
niej co 30 min. Co 30 min należy probówkę odwrócić
do góry dnem i z powrotem co zapobiega powstawaniu warstwy tłuszczu
unieruchamiajÄ…cej drobnoustroje,
f) Oznaczenie uznać za zakończone, gdy mleko w probówce (0,5-1 cm górnej
warstwy) zostanie odbarwione,
g) Zależność między czasem odbarwienia, a zawartością drobnoustrojów
przedstawia tabela:
Czas odbarwiania błękitu Liczba bakterii w 1 cm3
Jakość mleka
metylenowego (mln)
< 20 min. > 20 Bardzo zła
20 min.  2 godz. 20  4 ZÅ‚a
2,0  5,5 godz. 4  0,5 Åšrednia
5,5  7,0 godz. 0,5  0,1 Dobra
> 7,0 godz. < 0,1 Bardzo dobra
Próba reduktazowa jest oparta na oznaczeniu momentu wyczerpania tlenu rozpuszczonego w
mleku przez bakterie. Czas, w jakim tlen zostaje zużyty zależy od ilości, rodzaju i aktywności
drobnoustrojów. Po zużyciu tlenu rolę akceptora wodoru pełni dodany barwnik (błękit
metylenowy), który w wyniku zmiany potencjału oksydoredukcyjnego przechodzi z formy
barwnej w bezbarwną. Do bakterii zużywających tlen należą przede wszystkim bakterie
mlekowe i pałeczki z grupy coli.
4. Wykonanie posiewów mikrobiologicznych pozwalających odróżnić paciorkowce
mleczne od enterokoków
W tym celu wysiać metodą powierzchniową badane próbki mleka w ilości 0,5 cm3 na
płytki Petriego z podłożem:
a) bulion o pH 9,6
b) bulion z dodatkiem 6,5% NaCl
PodÅ‚oża inkubować w temp. 28ºC.