MIKROBIOLOGIA

OGÓLNA I ŻYWNOŚCI

ĆWICZENIA

dr M.Synowiec

DIETETYKA

semestr I

ZADANIA I PODZIAŁ MIKROBIOLOGII

Mikrobiologia zajmuje się:

• Warunkami rozwoju i przejawami życiowymi drobnoustrojów

• Przemianami wywołanymi przez nie w tych środowiskach, w których bytują

• Opracowaniem metod wykorzystania drobnoustrojów na potrzeby człowieka

Działy mikrobiologii:

• Mikrobiologia ogólna - zajmuje się budową, czynnościami życiowymi, metodami badań i hodowlą drobnoustrojów

• Mikrobiologia przemysłowa - zajmuje się wykorzystywaniem określonych gatunków mikroorganizmów w przemyśle z jednoczesnym zwalczaniem mikroflory szkodliwej

• Mikrobiologia rolnicza - bada głównie procesy mikrobiologiczne zachodzące w glebie w celu wykorzystania ich do zwiększania żyzności gleby

• Mikrobiologia lekarska - diagnostyka chorób, profilaktyka, walka drobnoustrojami chorobotwórczymi człowieka

• Mikrobiologia sanitarna - bada zagadnienia czystości wody, powietrza, pomieszczeń produkcyjnych, urządzeń, opakowań oraz problemy oczyszczania ścieków metodą biologiczną, higiena osobista pracowników przemysłu spożywczego

• Mikrobiologia weterynaryjna - choroby zwierząt domowych i dzikich.

ŚRODOWISKA BYTOWANIA MIKROORGANIZMÓW

GLEBA - główne środowisko bytowania drobnoustrojów. W jej skład wchodzą grzyby, bakterie i pierwotniaki. Mineralizują one substancje organiczne dostarczając roślinom niezbędnych pierwiastków.

BAKTERIE GLEBOWE

(wg Winogradskiego)

Bakterie autochtoniczne Występują mniej więcej w stałej liczbie dla danego typu gleby

Bakterie zymogenne Rozwijają się w glebie tylko okresowo, dostają się tam ze szczątkami zwierząt

Drobnoustroje przypadkowe Np. bakterie chorobotwórcze, dostające się do gleby wraz z odchodami ludzi i zwierząt, padliną oraz chorymi tkankami roślin

WODA - naturalne środowisko bytowania drobnoustrojów. Uboga w mikroflorę jest woda opadowa, natomiast wody podziemne zawierają różne ilości drobnoustrojów w zależności od głębokości występowania.

Drobnoustroje wód powierzchniowych mineralizują związki organiczne i w ten sposób biorą udział w procesie samooczyszczania wody.

Drobnoustroje występujące w wodzie w zależności od pochodzenia dzielimy na cztery grupy:

1. mikroflorę naturalną wody

2. mikroflorę dostającą się do wody z gleby i powietrza

3. mikroflorę przewodu pokarmowego ludzi i zwierząt

4. mikroflorę pochodzącą ze ścieków przemysłowych

POWIETRZE - środowisko wtórne bytowania drobnoustrojów, do którego dostają się one z cząsteczkami pyłu, kurzu lub pary wodnej i są przenoszone przez wiatr.

ZASADY, TECHNIKA PRACY ORAZ SPRZĘT W LABORATORIUM MIKROBIOLOGICZNYM

Podstawowa aparatura w pracowni:

• Mikroskop z obiektywem immersyjnym

• Autoklaw oraz aparat Kocha do wyjaławiania pożywek i niszczenia drobnoustrojów

• Sterylizator na suche i gorące powietrze

• Suszarka do suszenia szkła laboratoryjnego

• Cieplarka do hodowli drobnoustrojów

• Chłodziarka do przechowywania szczepów i pożywek

• Lupy do oglądania hodowli drobnoustrojów

• Waga techniczna i analityczna

• Pehametr do oznaczania pH pożywek

• Aparat do hodowli w warunkach beztlenowych

Podstawowy sprzęt:

• Ezy

• Pincety

• Skalpele

• Nożyczki

• Palniki

• Trójnogi

• Siatki laboratoryjne

• Statywy do probówek

• Puszki metalowe to pipet i płytek

• Termometry

Podstawowe szkło laboratoryjne:

• Probówki bakteriologiczne duże i małe

• Płytki Petriego o różnych średnicach

• Pipety bakteriologiczne z podziałką (pojemność 10 cm³, 1 cm³)

• Pipety pasteurowskie

• Kolby i butelki do przechowywania pożywek i odczynników

• Kolby płaskodenne różnej pojemności

• Cylindry pomiarowe

• Szkiełka przedmiotowe i nakrywkowe do preparatów mikroskopowych

• Bagietki szklane, łyżeczki porcelanowe

MIKROSKOPY

ŚWIETLNE (OPTYCZNE) Z jasnym polem widzenia Z ciemnym polem widzenia Do oglądania w ultrafiolecie Fluorescencyjny Kontrastowo-fazowy Konfokalny

ELEKTRONOWE

Mikroskop do oglądania w ciemnym polu widzenia - przy jego konstrukcji wykorzystano tzw. Efekt Teyndalla. Specjalnie skonstruowany kondensor kieruje promienie światła ukośnie do powierzchni szkiełka przedmiotowego. Pole widzenia pozostaje ciemne, komórki są jasne.

Mikroskop do oglądania w ultrafiolecie - używając jako źródła światła promieni ultrafioletowych (180-400 nm), możemy oglądać komórki o wielkości 0,1 μm. Soczewki w tym mikroskopie są wykonane z kwarcu, gdyż przepuszcza on promienie ultrafioletowe. Promieniowanie jest niewidoczne. Obrazy otrzymujemy na fotografii, kliszy.

Mikroskop fluorescencyjny - pewne substancje chemiczne absorbują energię fal ultrafioletowych i emitują ją jako fale widzialne większej długości. Takie substancje mogą mieć określone zabarwienie w świetle normalnym i całkowicie inną barwę w świetle ultrafioletowym. Związki te nazywa się związkami fluorescencyjnymi, a zjawisko fluorescencją.

Mikroskop kontrastowo-fazowy - jest szczególnie przydatny do badania żywych komórek. Większość mikroorganizmów jest bezbarwna i prawie przezroczysta, w skutek czego są one słabo widoczne pod mikroskopem. Dlatego też stosuje się różne metody barwienia umożliwiające dostrzeżenie zabarwionych komórek. Metoda kontrastu fazowego umożliwia dokładną obserwację obiektów bez konieczności ich barwienia.

Mikroskop konfokalny - użycie światła laserowego wprowadzonego do mikroskopu od strony okularu skanuje pole widzenia. Dzięki temu obraz jest oświetlany punkt po punkcie, wyłącznie w płaszczyźnie ostrości obrazu. Mikroskop ten ma duże zastosowanie w badaniach cytologicznych.

Mikroskop ELEKTRONOWY - tutaj rolę światła odgrywają wiązki elektronów o bardzo małej długości fali biegnących w wysokiej próżni. Rolę soczewek spełniają soczewki elektrostatyczne lub elektromagnetyczne. Obraz przedmiotu może być widoczny na specjalnym ekranie fluorescencyjnym lub fotografowany na płytce fotograficznej przez wmontowany w mikroskop aparat fotograficzny.

METODY NISZCZENIA DROBNOUSTROJÓW

METODY FIZYCZNE

• sterylizacja cieplna sucha oraz wyjaławianie szkła laboratoryjnego w suszarce w temperaturze około 160°C przez 2 godziny

• sterylizacja cieplna z parą wodną (zaliczamy tutaj sterylizację w autoklawie w temperaturze powyżej 100°C i pod ciśnieniem około 1,5 atmosfery przez 20 minut oraz w aparacie Kocha. Można w tym aparacie przeprowadzić zabieg jednokrotny w temperaturze około 95°C przez 30 minut.)

• sterylizacja przez gotowanie

• wyjaławianie promieniami ultrafioletowymi przy pomocy lamp kwarcowych

METODY MECHANICZNE

Wyjaławianie cieczy możemy uzyskać poprzez oddzielenie mikroorganizmów przy pomocy specjalnych filtrów bakteriologicznych o drobnych porach.

Rodzaje filtrów (różnią się materiałem i konstrukcją):

1. filtry Berkefelda - z ziemi okrzemkowej

2. filtry Chamberlaina - z nieglazurowanej porcelany

3. filtry azbestowe

4. filtry Schotta - ze spiekanego szkła

5. filtry membranowe - z kolodium, żelatyny

METODY CHEMICZNE (DEZYNFEKCJA)

Przy pomocy substancji chemicznych można przeprowadzić różnych przedmiotów, płynów, pomieszczeń.

Można zastosować:

• kwasy i zasady, tj. mleko wapienne, gorące roztwory węglanu sodowego (1-10 %)

• środki utleniające - jodyna (roztwór 10%), chloramina (chlorowce i ich pochodne)

• sole metali ciężkich (rtęci i srebra)

• rozpuszczalniki organiczne (60-70% alkohol, 5% roztwór fenolu, krezole, lizol, formalina)

• detergenty (substancje zmniejszające napięcie powierzchniowe wody)

BARWIENIE BAKTERII

Tylko w mikroskopie kontrastowo-fazowym można oglądać żywe bakterie bez barwienia.

Aby zaobserwować bakterie w mikroskopie świetlnym, ocenić właściwie ich wielkość, kształt, niektóre cechy morfologiczne, należy je zabarwić. Bakterie słabo załamują promienie świetlne. Związki stosowane do barwienia to głównie sole. Najczęściej stosowane są barwniki o charakterze zasadowym, w których barwny jest kation; barwniki obojętne lub kwaśne są stosowane znacznie rzadziej.

Najczęściej stosowane barwniki:

• błękit metylenowy

• fiolet krystaliczny

• fuksyna zasadowa - różowy

• fuksyna kwaśna - różowy

• safranina - czerwony

• zieleń malachitowa - zielony

Techniki barwienia:

• Proste (jeden barwnik)

• Złożone (dwa lub więcej)

Podział technik barwienia ze względu na rodzaj barwników:

• Barwienie pozytywowe - zabarwienie komórek, tło zostaje bezbarwne. Może być proste lub złożone.

• Barwienie negatywowe - ciemne tło i niezabarwione komórki (zwykle komórki krętków i otoczek bakterii). Wykorzystuje się roztwór nigrozyny, tuszu chińskiego lub cyjanochiny. Rozmaz wykonuje się z zawiesiny komórek zmieszanych z barwnikiem. Może być proste lub złożone

• Pozytywowo-negatywowe - najpierw wykonuje się barwienie negatywowe, a po wyschnięciu dobarwia się barwnikiem pozytywowym. Jest to barwienie złożone.

Technika barwienia złożonego polega na pokrywaniu szkiełka podstawowego z naniesionym i utrwalonym badanym preparatem. Potem nanosimy barwnik na określony czas i spłukujemy wodą, przed nalaniem kolejnego barwnika. Do lepszego wypłukania stosuje się alkohol lub płyn Lugola, a także podgrzewanie preparatu nad palnikiem.

Inny podział barwienia:

• Przyżyciowe (rzadkie)

• Pośmiertne - utrwalone (częściej stosowane)

Przyżyciowe - stosowane w celu odróżnienia komórek żywych od martwych, stwierdzenia substancji zapasowych w komórce, w badaniu przepuszczalności błony cytoplazmatycznej.

Polega ono na wprowadzeniu do żywych komórek nietoksycznego barwnika o dużej kontrastowości, musi być bardzo rozcieńczony. Bakterie barwione w ten sposób przestają się rozmnażać.

Do przygotowania preparatu barwionego na „żywo” na szkiełku podstawowym, obok kropli zawiesiny drobnoustrojów umieszcza się kroplę barwnika. Obie krople miesza się np. ezą, przykrywa szkiełkiem nakrywkowym i po upływie określonego czasu ogląda pod mikroskopem.

*Barwienie przyżyciowe charakteryzuje się tym, że preparat jest mokry. Nie utrwala się preparatu!

Pośmiertne - preparat „utrwalony”. Przed sporządzeniem preparatu należy odtłuścić szkiełko podstawowe (nap płomieniem palnika gazowego).

Sporządzanie rozmazu

Na odtłuszczone szkiełko nanosi się kroplę hodowli lub badanego materiału i sporządza zawiesinę, którą rozprowadza się jałową ezą na powierzchni całego szkiełka i pozostawia do wyschnięcia na wolnym powietrzu. Po wysuszeniu rozmaz powinien być cienki, ledwo widoczny. Wysuszony preparat utrwala się.

Rodzaje utrwalania:

1. Utrwalanie termiczne - polega na kilkakrotnym przesunięciu szkiełka przedmiotowego z rozmazem nad płomieniem palnika od spodu preparatu, przerywając, kiedy szkło zacznie lekko parzyć.

2. Utrwalanie chemiczne - stosuje się przy badaniu struktur komórkowych. Do tego utrwalania używa się związków odwadniających (alkohol etylowy, metylowy, mieszanina alkoholu i eteru w stosunku 1:1, 10-procentowy roztwór formaliny, sublimatu itp.

Utrwalanie chemiczne polega na zalaniu wysuszonego rozmazu na określony czas utrwalaczem. Następnie utrwalacz się zlewa i preparat suszy na powietrzu. Używając formaliny lub sublimatu, preparat należy dobrze przemyć woda i wysuszyć.

Metoda Grama

Pozwala na zróżnicowanie organizmów na dwie grupy (Gram-dodatnie i Gram-ujemne inaczej się barwią), ze względu na różnice w budowie ściany komórkowej - różnice w fizjologii i podatności na leki. (Barwienie pośmiertne, złożone, utrwalone)

Odczynniki: Fiolet krystaliczny i roztwór fuksyny zasadowej, płyn Lugola, alkohol etylowy

1. Nanieść bakterie na szkiełko podstawowe (kropla hodowli)

2. Nanieść na preparat kroplę fioletu krystalicznego. Po dwóch minutach zmyć wodą destylowaną

3. Nanieść płyn Lugola na 1 minutę. Spłukać obficie alkoholem etylowym, a później woda destylowaną.

4. Nanieść Na preparat roztwór fuksyny zasadowej na 40 sek. Spłukać szkiełko wodą destylowaną i wysuszyć. Przed umieszczeniem na stoliku mikroskopu nanieść na szkiełko krople lejku immersyjnego. Oglądać używając obiektywu dającego stukrotne powiększenie.

Barwienie metodą Grama należy przeprowadzać na hodowlach 18-24 godzinnych. Starsze komórki maja mniejszą zdolność do tworzenia trwałego kompleksu z fioletem.

Bakterie po barwieniu metodą Grama:

• G(+) gram-dodatnie - barwią się na kolor niebiesko-fioletowy,

• G(-) gram-ujemne - barwią się na kolor czerwono-różowy,

• gramozmienne - część komórek barwi się na fioletowo, a część na czerwono.

Barwienie przetrwalników

Budowa przetrwalników, a szczególnie obecność wielowarstwowych błon powoduje, że przetrwalniki należą do słabo barwiących się i konwencjonalne metody nie dają efektu. W zabarwionych komórkach są widoczne jako bezbarwne obszary. Barwniki mogą przenikać do wnętrza po podgrzaniu preparatu. Nieprzepuszczalność ściany przetrwalnika zapobiega ich odbarwianiu podczas płukania woda lub alkoholem. Dlatego stosuje się barwienie kontrastowe przetrwalników i komórek wegetatywnych (dwoma kontrastowymi barwnikami).

Metoda Schaeffera-Fultona

1. Utrwalony preparat zalać 5-procentowym wodnym roztworem zieleni malachitowej na 5 minut, po czym nie zlewając barwnika, delikatnie podgrzać palnikiem od spodu preparatu do momentu ukazania się obłoczka pary. Podgrzewanie powtarza się 3-krotnie, nie dopuszczając do odparowania barwnika

2. Po skończonym ogrzewaniu preparat spłukać delikatnym strumieniem wody destylowanej w czasie 30 sekund

3. Preparat dobarwić 0,5-procentowym roztworem safraniny w czasie 30 sekund

4. Po zakończeniu barwienia, preparat spłukać wodą destylowaną i osuszyć.

Przetrwalniki barwią się na zielono, a komórki wegetatywne na czerwono.

Bakterie alkoholo-kwaso-oporne

Do znanych metod barwienia złożonego należą metody barwienia bakterii zawierających w swych ścianach duże ilości tłuszczu i wosków.

Bakterie te zabarwione na gorąco barwnikiem, nie odbarwiają się pod działaniem alkoholu i innych silnych kwasów mineralnych

Dla tej grupy najczęściej jest polecana metoda barwienia prątków Ziehl-Neelsena, w której podstawowym barwnikiem jest fuksyna karbonowa.

Barwienie otoczek

Polega na barwieniu otoczek bakterii w celu ułatwienia obserwacji.

Otoczki bakteryjne bardzo trudno zaobserwować w mikroskopie świetlnym, bez zastosowania specjalnych metod barwienia. Jest to związane z tym, jak otoczki załamują światło. Stosuje się barwienie negatywne (negatywowe) z pewnymi modyfikacjami.

Na szkiełko podstawowe nanosi się kroplę zawiesiny drobnoustrojów i kroplę nigrozyny lub tuszu. Używając drugiego szkiełka podstawowego wykonuje się rozmaz i suszy na powietrzu; preparat po wyschnięciu jest gotowy do obserwowania.

Na ciemnym tle są widoczne jasne komórki z otoczkami.

Inna metodą jest barwienie różnicujące Anthony'ego w modyfikacji Tylera. Rozmaz komórek, po wysuszeniu na powietrzu i utrwaleniu, barwi się 4-7 minut fioletem krystalicznym według metody Anthony'ego-Tylera. Barwnik zlewa się i preparat zmywa roztworem siarczanu miedzi. Otoczki przyjmują barwę niebieskofioletowa, a komórki są ciemnoniebieskie.

Barwienie substancji zapasowych

Przy wykrywaniu wolutyny, rozmaz komórek po wysuszeniu i utrwaleniu barwi się przez kilka sekund błękitem wg Tofflera, spłukuje wodą destylowaną, suszy. Ziarnistości metachromatyczne barwią się na fioletowo, a komórki na niebiesko.

Do barwienia glikogenu i granulozy stosuje się płyn Lugola. Glikogen barwi się na czerwonobrunatno, a granuloza na ciemnoniebiesko.

HODOWLA DROBNOUSTROJÓW W WARUNKACH LABORATORYJNYCH

Pożywki hodowlane - nazywane też podłożami mikrobiologicznymi, są to mieszaniny odpowiednio dobranych składników. Służą do hodowli mikroorganizmów w warunkach laboratoryjnych, w naczyniach (hodowle in vitro - w szkle).

Wzrost i rozwój drobnoustrojów na pożywkach pozwala na wyodrębnienie czystych kultur, na prowadzenie badań morfologicznych, fizjologicznych, diagnostycznych o raz wszelkiego rodzaju hodowli doświadczalnych.

Pożywka powinna spełniać następujące warunki:

• zapewniać odpowiednią ilość składników pokarmowych (organicznych i nie organicznych) energetycznych i budulcowych

• zawierać określone czynniki wzrostowe (np. witaminy, aminokwasy)

• mieś odpowiednie ciśnienie osmotyczne

• zawierać optymalny dostęp tlenu

• wykazywać właściwą temperaturę i pH

Nie ma uniwersalnych pożywek dla wszystkich drobnoustrojów (jest to spowodowane zróżnicowaniem wymagań pokarmowym)

Wyróżniamy:

• Podłoża dla autotrofów - nieskomplikowane, zawierają tylko związki mineralne

• Podłoża dla heterotrofów -muszą spełniać większe wymagania

SKŁADNIKI POŻYWEK

Źródło węgla

Najłatwiej przyswajalne źródło węgla to: cukry (glukoza, maltoza, laktoza, skrobia, celuloza). Dodatek cukru do pożywki może służyć celom diagnostycznym lub wybiórczym, gdyż dany gatunek wykorzystuje określony rodzaj cukru. Zawartość cukru w pożywce waha się od 0,5 do 2%. Oprócz cukrów, jako źródło węgla drobnoustroje mogą wykorzystywać glicerol i mannitol oraz niektóre kwasy organiczne.

Źródła azotu

Większość drobnoustrojów wykorzystuje azot z połączeń nieorganicznych (sole amonowe, wodorotlenek amonu, azotany). Jon amonowy stanowi podstawowy związek w przemianach azotowych.

Niektóre drobnoustroje mogę pobierać wolny azot atmosferyczny. Poza tym, drobnoustroje czerpią azot również ze związków organicznych, niekiedy bardzo skomplikowanych. Należy tu wymieć przede wszystkim ekstrakty (wyciągi) z tkanek roślinnych i zwierzęcych oraz różnego typu hydrolizaty białek zwierzęcych i roślinnych. Wszystkie te składniki są dostępne już jako preparatu handlowe, w postaci proszków lub past. Dodatek związków białkowych do pożywek wynosi 0,5-2%.

Do źródeł azotu zaliczamy:

Ekstrakty mięsne - wodne wyciągi z tkanki mięsnej, ale także ekstrakty z serc i wątroby, zawierają one substancje azotowe oraz węglowodany i witaminy rozpuszczalne w wodzie

Ekstrakty drożdżowe - obok związków azotu i węgla organicznego są bogatym źródłem witamin z gr. B

Peptony - specyficzne produkty częściowej, enzymatycznej hydrolizy białka, są głównym źródłem azotu w pożywce, zawierają liczne wolne aminokwasy i krótkie łańcuchy peptydowe, pewne witaminy, czasami węglowodany

Hydrolizaty enzymatyczne lub kwasowe białek mięsa, kazeiny, jaj, nasion soi - bogate źródło aminokwasów, jedno z najczęściej wykorzystywanych źródeł azotu organicznego w pożywce

Czyste białka -(żelatyna, kazeina) oraz białka rodzime (np. białka jaja, surowicy krwi) - opcjonalne źródło azoty wykorzystywane przez bakterie proteolityczne

Wolne aminokwasy - czasami dodawane do podłoża (jest to droga metoda).

Sole mineralne

Dodawane do pożywek w niewielkich ilościach, są źródłem składników nieorganicznych (fosforu, siarki, potasu, sodu, magnezu, manganu, żelaza i in.

Drobnoustroje pobierają je w postaci odpowiednich soli, najczęściej KH₂PO₄, K₂HPO₄, Na₂HPO₄, NaH₂PO₄, NaCl, siarczany i chlorki żelaza, magnezu.

Niektóre z tych soli regulują ciśnienie osmotyczne, np. NaCl, dodawane w ilościach 3-5 ^g/_l pożywki, Inne, np. fosforany potasu, działają buforująco i utrzymują właściwy odczyn pożywki.

Czynniki wzrostowe

Wprowadza się je do podłoża w postaci roztworów syntetycznych witamin (jest to kosztowne) lub w formie wyciągów (mięsnego wątrobowego i drożdżowego, a także wyciągów roślinnych (sok pomidorowy, brzeczka słodowa, ekstrakt glebowy lub ziemniaczany).

Związki korygujące

Większość bakterii rośnie w pH obojętnym lub lekko alkalicznym (6,8-7,4).

Grzyby preferują środowisko lekko kwaśne (pH 5-6,0).

Korektę pH pożywek przeprowadza się najczęściej za pomocą 1-5 moli roztworów NaOH i HCl.

Substancje różnicujące i wybiórcze

Wprowadzone do podłoża czynniki różnicujące ulegają pod wpływem mikroorganizmów modyfikacji bądź rozkładowi. Uwidocznia się to np. w zmianie barwy kolonii lub podłoża lub powstaniu strefy przejaśnienia.

Czynniki wybiórcze (sole kwasów żółciowych, niektóre barwniki np. zieleń brylantowa, fiolet krystaliczny, związki chemiczne np. azydek sodu) hamują rozwój pewnych grup bakterii umożliwiając rozwój tylko określonej grupie drobnoustrojów.

CZYNNIKI ZESTALAJĄCE

Pozwalają na uzyskanie pożywek w formie stałej.

Agar

Jest to dostępny handlowo w formie proszku lub włókien, wielocukier otrzymywany z glonów morskich. Odznacza się właściwościami żelującymi, silnie chłonie wodę i w zależności od stopnia oczyszczenia upłynnia się w temperaturze 90-100°C, a zestala w 45-48°C.

Chemicznie agar jest polisacharydem - galaktonem (zawiera m.in. galaktozę), który nie jest wykorzystywany przez drobnoustroje jako składnik odżywczy, a tylko przez niektóre drobnoustroje może być rozkładana. W celu zestalenia podłoża wystarczy 1,5-3% agaru.

Żelatyna

jest to substancja białkowa, która występuje w wyniku hydrolizy kolagenu, może być zużywana przez drobnoustroje zawierające enzymy proteolityczne, następuje wówczas upłynnienie pożywki (nie należy przechowywać płytek z takimi hodowlami do góry dnem)

żelatyna upłynnia się w temperaturze 25-27^C a zestala w 18-20^C, przy czym ogrzewana kilkukrotnie do 100^C traci właściwości żelujące.

Jako czynnik zestalający pożywkę dodaje się w ilości 12-15%.

Inne czynniki zstalające są stosowane rzadko, mależa tu m.in. żel krzemionkowy (do pożywek mineralnych dla autotrofów), jaja i surowice krwi (w badaniach specjalnych).

RODZAJE POŻYWEK

Kryteria podziału pożywek:

• Skład chemiczny i pochodzenie składników

• Zawartość składników

• Cel hodowli (zastosowanie i funkcja podłoża)

• Konsystencja

Podłoża w zależności od składu:

• naturalne (wprost z surowca roślinnego lub zwierzęcego w sposób zapewniający jego jałowość, np. mleko, serwatka, bulion, brzeczka, owoce i warzywa)

• syntetyczne (wykonane z dokładnie określonych związków chemicznych o znanym składzie jakościowym i ilościowym, należą tu podłoża mineralne dla autotrofów)

• półsyntetyczne - podłoża syntetyczne z dodatkiem wyciągów z tkanek roślinnych lub zwierzęcych, np. mleko z lakmusem, agar ziemniaczany z tiaminą.

Podłoża ze względu na zawartość składników:

• Podłoże podstawowe (zwykłe) - stosowane do hodowli mikroorganizmów o niskich wymaganiach odżywczych lub stanowią bazę do przygotowania innych pożywek, np., bulion zwykły, brzeczka.

• Podłoże wzbogacone - podłoże podstawowe wzbogacone dodatkowymi składnikami odżywczymi, np., bulion odżywczy, bulion tryptofanowy, agar z krwią itp. Podłoża wzbogacone umożliwiają wzrost większości drobnoustrojów.

Podłoża zależnie od funkcji jaką ma pełnić pożywka

• Namnażające lub namnażająco-wybiórcze - stosowane wówczas, gdy liczba drobnoustrojów w badanej próbie jest niewielka lub poszukiwany drobnoustrój występuje z inną mikroflora towarzyszącą. Są to zwykle podłoża płynne, np. zbuforowana woda peptonowa dla pałeczek Salmonella, pożywka Kesslera-Swenartona dla pałeczek typu Coli.

• Selektywne - zawierają składniki wybiórcze (oprócz składników odżywczych), hamujące wzrost drobnoustrojów przeszkadzających bez wpływu na pożądane

• Różnicujące - zawierają składniki wpływające na rodzaj wzrostu lub wywołujące taką zmianę, która pozwala na zróżnicowanie pomiędzy poszczególnymi grupami (typami) bakterii, często pełnią role podłóż wybiórczych i wzbogaconych. Są to podłoża stałe, np. agar z krwią, agar, SS, Endo.

• Testowe - służą do oznaczania witamin, aminokwasów i antybiotyków przy pomocy mikroorganizmów. Zwykle mają bardzo złożony i specyficzny skład, a testowany czynnik nie występuje w podłożu co jest podstawą oznaczenia.

• Identyfikacyjne (diagnostyczne) - na nie przesiewa się kolonie drobnoustrojów z poprzednich podłoży, umożliwiają identyfikację wyizolowanych szczepów w zależności od potrzeb gatunku, rodzaju, czy określonej grupy, na podstawie określonych reakcji biochemicznych zachodzących pod wpływem danego mikroorganizmu. Na przykład I szereg identyfikacyjny dla drobnoustrojów z rodzaju Salmonella jest następujący:

1. woda peptonowa z tryptofanem

2. podłoże z mocznikiem

3. podłoże Kliglera

4. podłoże z 10% laktozą.

Podłoża ze względu na konsystencję

• Płynne - powinny być klarowne, a więc składniki muszą być całkowicie rozpuszczone, np. brzeczka, bulion płynny

• Półpłynne - z dodatkiem 0,1-0,8% agaru

• Stałe - zestalone za pomocą agaru lub żelatyny na płytce Petriego w postaci jednolitej, gładkiej warstwy bądź też w postaci słupka lub skosu w probówce.

Przykłady pożywek stosowanych w mikrobiologii

Pożywki ogólnego zastosowania:

• Bulion zwykły i odżywczy

• Bulion z agarem

• Brzeczka słodowa

• Agar zwykły i odżywczy

• Żelatyna

Pożywki wybiórcze stosowane do hodowli bakterii:

• Podłoża dla beztlenowców (podłoże Wrzoska, podłoże Wilsona-Blaira)

• Podłoża dla pałeczek z grupy Coli (podłoże z żółcią i zielenią brylantową Kesslera-Swenartona, podłoże Endo)

• Podłoże do wykrywania enterokoków (podłoże z azydkiem sodu)

• Podłoże do wykrywania gronkowców (podłoże Chapmanna z mannitolem)

Pożywki wybiórcze stosowane do hodowli grzybów pleśniowych i drożdży:

• Brzeczka agarowa

• Pożywka Czapka-Doxa

• Podłoże Wikena i Richardsa do izolacji drożdży

ZASADY PRZYGOTOWYWANIA POŻYWEK

Znając skład jakościowy i ilościowy pożywki, dodaje się do wody destylowanej poszczególne składniki zgodnie z podaną recepturą, następnie ogrzewa się na gazie do momentu uzyskania klarownego płynu i koryguje się pH (jeżeli jest różne od oczekiwanego).

W zależności od rodzaju pożywki i wymaganych temperatur sterylizacji wyjaławia się rozpuszczoną pożywkę w aparacie Kocha lub autoklawie w określonym czasie.

Dodatek witamin (jeśli są potrzebne) oraz przesączenie pożywki wykonuje się po jej ostudzeniu. Ostudzoną (nie za bardzo!) pożywkę o odpowiednim składzie rozlewa się do naczyń hodowlanych w zależności od potrzeb, do jakich ma służyć przygotowane podłoże. Jeżeli potrzebujemy podłoża stałego, możemy je rozlać na płytki Petriego lub do probówek, gdzie zestala się je w formie skosu lub słupka (rozlewane podłoże nie może mieć temperatury niższej od 45^C gdyż nie będzie się równo zestalało). Pożywki płynne rozlewa się do probówek lub kolbek.

Obserwacja wzrostu drobnoustrojów na pożywkach należy do ważnych informacji diagnostycznych przy identyfikacji drobnoustrojów. W zależności od rodzaju podłoża w diagnostyce uwzględnia się różne cechy.

Cechy diagnostyczne wzrostu mikroorganizmów na różnych podłożach:

Bulion płynny	Płytka Petriego
Występowanie błonki Charakter błonki Zmętnienie lub osad Charakter zmętnienia Stopień zmętnienia Charakter osadu zapach	wymiary kolonii kształt kolonii brzeg kolonii powierzchnia kolonii konsystencja barwa kolonii lub podłoża wyniosłość - profil
Skośny agar	Słupek żelatynowy
Intensywność wzrostu Charakter brzegu linii wzrostu Konsystencja Barwa	Powierzchniowy Wzdłuż linii kłucia W dolnej części słupka Upłynnienie żelatyny

Wzrost drobnoustrojów na podłożach płynnych

Charakter wzrostu na podłożu płynnym pozwala na określenie zapotrzebowania bakterii na tlen:

• Bezwzględne tlenowce rosną na powierzchni pożywki w postaci pierścienia, błonki lub kożucha utworzonych z komórek. W zależności od gatunku bakterii kożuch może być biały, zabarwiony, suchy, sfałdowany, jednolity lub rozpadający się, kłaczkowaty, wznoszący się po ściankach

• Względne beztlenowce charakteryzuje wzrost dyfuzyjny objawiający się jednolitym zmętnieniem całej objętości pożywki

• Bezwzględne beztlenowce rosną w postaci osadu na dnie probówki. Po wstrząśnięciu osad unosi się w sposób pylisty, osiadający, kłaczkowaty lub ziarnisty

• Mikroaerofile rozwijają się w postaci pierścienia w pewnym oddalenia od powierzchni pożywki

Wzrost i charakterystyka mikroorganizmów na podłożach stałych

Ma zastosowanie w diagnostyce przy otrzymywaniu czystych kultur oraz w analizach ilościowych. Kolonia to skupisko bakterii widoczne gołym okiem, wyrosłe najczęściej z jednej komórki. W standardowych warunkach środowiska kolonie charakteryzują się stałymi cechami, uwzględnianymi w diagnostyce.

Obserwacje koloni przeprowadza się przy pomocy lupy lub binokularu biorąc pod uwagę:

• Wielkość i kształt kolonii np. okrągły, nieregularny, rozgałęziony, nitkowaty. Niektóre bakterie nie mogą tworzyć pojedynczych kolonii, zarastają całe podłoże dając wzrost mgławicowy, rozlany (Proteus), inne tworzą kolonie rozpełzające się po powierzchni podłoża (Bacillus)

• Brzeg kolonii: gładki, falisty regularny lub nieregularny, płatowaty regularny lub nieregularny, ząbkowaty regularny lub nieregularny, nitkowaty.

• Powierzchnię kolonii: gładka i pomarszczona, lśniąca lub matowa.

• Barwa kolonii i jej przejrzystość: przezroczysta, mętna, opalizująca, nieprzezroczysta oraz zdolność do wytwarzania pigmenty zabarwiającego otoczenie koloni: zabarwione, niezabarwione. Na przykład Sarcina lutea i Pseudomonas herbicida tworzą kolonie żółte, Staphylococcus ureus pomarańczowo-złote, Serratia marcescens krwisto czerwone, Azotobakter­ ciemno brązowe, Pseudomonas fluorescens seledynowo fluoryzujące. Ponadto wytwarzane przez pseudomonady barwniki dyfundują do podłoża zmieniając kolor na zielonkawy, niebieskawy, fioletowy, niekiedy fluoryzujący

• Konsystencja: struktura zwarta, drobnoziarnista, gruboziarnista, luźna

• Profil kolonii ponad powierzchnię pożywki: płaski, wyniosły, soczewkowaty niski, soczewkowaty wysoki, pępkowaty

Z praktycznego punktu widzenia rozróżnia się następujące typy kolonii powierzchniowych:

• „S” (smooth - gładki) o gładkim brzegu, powierzchni wypukłej bez wzniesień i wgłębień. Jest to cecha charakterystyczna dla kolonii młodych i prowadzonych na agaży odżywczym, a także zjadliwych form bakterii chorobotwórczych

• „R” (rough - szorstki) o brzegu nierównym , płatowatym lub nitkowatym i szorstkiej powierzchni. Bakterie układają się w długie nici lub łańcuszki. Kolnie takie tworzą niezjadliwe formy bakterii, chociaż te same bakterie wytwarzające kolonie gładkie są chorobotwórcze

• „G” (gonidia - gonidialny) kolonie bardzo drobne o średnicy 1mm

• „M” (mukoid - śluzowaty) kolonie gładkie o powierzchni śluzowatej, błyszczącej, wytwarzane przez bakterie ze śluzową otoczka

• „L” (L-formy) powstają spontanicznie lub w niesprzyjających warunkach środowiskowych. Kolonia taka składa się z komórek bardzo drobnych - przesączalnych, poprzez formy ziarniste i pałeczkowate do form olbrzymich o średnicy dochodzącej do 10mcm

Nieco odmienne kolonie wytwarzają promieniowce Actinomycetales, które będąc bakteriami morfologicznie przypominają grzyby strzępkowe. Na podłożach stałych tworzą grzybnię zbudowaną ze strzępek, tzw. pseudomycelium, które może ulegać fermentacji.

Grzyby - Fungi

Ich plecha ma budowę nitkowatą, złożoną z mniej lub bardziej rozgałęzionych jedno- (komórczak) lub wielokomórkowych, jedno- lub wielojądrowych strzępek, wytwarzają grzybnię dwóch rodzajów:

• grzybnię wzrastającą w podłoże i służącą do pobierania pokarmu

• puszystą, zwartą lub luźną grzybnię powietrzną, zbudowaną ze strzępek z różnymi formami owocowania na ogół wegetatywnego. Początkowo jest ona bezbarwna lub białą. W miarę wzrostu i w zależności od wytwarzanego barwnika (koloru zarodników konidialnych) kolonia przybiera różną barwę.

Drożdże

• rosną na powierzchni podłoży stałych tworząc pojedyncze kolonie, które można sklasyfikować tak jak u bakterii (S - gładkie, R -pomarszczone, M-śluzowate) bądź tworzą jednolity nalot.

• Powierzchnia kolonii może być gładka z wyniesieniem na środku, pomarszczona, lśniąca lub matowa.

• Wewnątrz podłoża tworzą charakterystyczne kolonie o kształcie soczewkowatym, w podłożach płynnych drożdże rosnąc tworzą na powierzchni błonkę lub na dnie osad.

Wzrost i charakterystyka hodowli na skosie agarowym

Przy posiewie na skosie bakterie najczęściej nie tworzą wyodrębnionych kolonii, jednak sposób wzrostu jest ważną cechą diagnostyczną.

Wzrost bakterii na skosie opisujemy uwzględniając następujące cechy:

• charakter wzrostu: jednolity (w postaci zwartego nalotu Komorek), perlity (tworzą się oddzielne, niezlewające się ze sobą kolonie), o brzegach gładkich, ząbkowatych, kolczastych, ziarnistych; krzewiasty, nieregularny, itp.

• powierzchnia rysy: lśniąca, matowa, czasem cienka, sucha błonka

• struktura: gładka, ziarnista, pofałdowana

• barwa i przezroczystość

Wzrost drobnoustrojów na słupku w hodowli kłutej opisujemy uwzględniając następujące cechy:

• Ruchliwość

• Upłynnianie żelatyny (w przypadku bakterii proteolitycznych)

• Charakter upłynnienia wzdłuż nakłucia (kraterowate, workowate, lejkowate, walcowate, kielichowate)

Zależność bakterii od zapotrzebowania na tlen:

Określenie stosunku bakterii do wolnego tlenu polega na badaniu wzrostu na słupku agarowym zaszczepionym igłą do dna probówki.

• bezwzględne tlenowce rosną tylko na powierzchni pożywki

• bezwzględne beztlenowce - tylko w dolnych partiach pożywki

• względne beztlenowce na całej wysokości słupka

• mikroaerofile - tuż pod powierzchnią pożywki

POSIEW

Posiew jest podstawową metodą diagnostyki bakteriologicznej i mikologicznej zarówno w mikrobiologii klinicznej jak i badawczej.

Posiew mikrobiologiczny - przeniesienie drobnoustrojów z hodowli lub badanego materiału do jałowej pożywki.

Zaszczepioną pożywkę umieszcza się w cieplarce (termostacie) w określonych warunkach temperatury i natlenienia, zapewniających rozwój wprowadzonym drobnoustrojom.

W zależności od kierunku prowadzonych badań, celem posiewu może być:

• Odświeżenie hodowli drobnoustrojów. Do tego typu posiewów należą przesiewy szczepów muzealnych w celu utrzymania ich żywotności i aktywności

• izolacja czystych kultur drobnoustrojów z badanego materiału

• diagnostyka wyizolowanych szczepów (w celu określenia ich przynależności do gatunku, rodzaju lub określonej grupy drobnoustrojów)

• stwierdzenie stanu mikrobiologicznego produktu (jałowości, jakości mikroflory)

• znaczenie liczby drobnoustrojów w badanym materiale

• przygotowanie inokulatów do prowadzenia hodowli w warunkach doświadczalnych czy też do celów przemysłowych.

Wszystkie czynności związana z posiewem należy prowadzić zachowując warunki jałowości. Najlepiej posiew wykonywać w pomieszczeniu przeznaczonym tylko to tego celu.

Posiewu drobnoustrojów dokonuje się ezą, igłą lub pipetą.

Niekiedy posiew przeprowadza się z użyciem jałowych tamponów waty lub gazy albo szklanych pręcików, wygiętych pod specjalnym kątem, tzw. głaszczek.

Za pomocą ezy wykonuje się posiewy na podłoża płynne i stale. Ezę z pobranym materiałem zanurza się w pożywce płynnej, wymywając komórki z jej powierzchni.

W pożywkach zestalonych natomiast posiewu dokonuje się punktowo, dotykając ezą powierzchni pożywki albo pocierając powierzchnię zestalonego podłoża w sposób falisty lub rysowy. Dokonując posiewu igłą, wkłuwamy ją w słupek zestalonego podłoża.

Do posiewu drobnoustrojów znajdujących się w środowisku płynnym służy pipeta. Za pomocą pipety zwykłej albo pasteurowskiej materiał można przenieść na pożywkę płynną lub zestaloną.

Posiew metodą uproszczoną

• Wysiewanie tylko na podłoże stałe

• Zaletą jest jej prostota

• Posiew wykonuje się rysując ezą wgłębienia w podłożu

• Używa się jej przy hodowlach z materiału zawierającego niewiele bakterii (np. z moczu)

Posiew redukcyjny

Najpopularniejsza metoda posiewu

Proces posiewania można podzielić na cztery etapy :

1. po pobraniu materiału wcześniej wysterylizowaną ezą należy rozprowadzić go po podłożu do około 40% szerokości szalki Petriego

2. sterylizujemy użytą ezę, obracamy płytkę o 90° i kolejną z rzędu pętlą bakteriologiczną powtarzamy czynność

3. obracamy płytkę Petriego i powtarzamy czynności

4. kolejną ezą poruszmy w taki sposób, aby zmieścić się w górnej części etapu trzeciego i wolnej przestrzeni pośrodku

Sposób wykonywania posiewów mikroorganizmów:

• etap I - przygotowanie rozcieńczeń próbki

1. próbka badana

2. probówka ze sterylną wodą buforowaną

• etap II - posiew z każdego rozcieńczenia na podłoża płynne lub stałe

• obserwacja wyrosłych hodowli.

Posiew z powierzchni:

• Polega na wykonaniu wymazu z użyciem jałowych tamponów

• Zebraną za pomocą tamponu mikroflorę przenosimy na odpowiednią pożywkę (najczęściej zestaloną)

• Można też wypłukać tampon w rozcieńczalniku i wykonać posiew bezpośrednio z zawiesiny lub z rozcieńczeń

• Przy dokonywaniu posiewów często jest niezbędne sporządzanie zawiesin drobnoustrojów lub badanego materiału

• Do tego celu służą odpowiednie rozcieńczalniki

• Najczęściej stosuje się roztwór fizjologiczny (0,85% roztwór NaCl lub płyn Singera)

• Są to roztwory izotoniczne dla komórek drobnoustrojów.

Posiew ilościowy:

• Do znaczenia ilości drobnoustrojów w produkcie spożywczym lub badany materiale odważa się lub odmierza określoną ilość produktu i odpowiednio rozdrobniony wprowadza się do roztworu rozcieńczalnika

• Następnie przygotowuje się dalsze rozcieńczenia dziesiętne w zależności od spodziewanego zakażenia, przenosząc po 1 cm³ do probówki z 9 cm³ jałowego rozcieńczalnika.

MIKROBIOLOGICZNE METODY BADANIA ŻYWNOŚCI

W ocenie mikrobiologicznej żywności uwzględnia się zarówno jakość, jak i jej ilość. Znajomość mikroflory występującej w żywności pozwala nie tylko na ocenę surowców i gotowych produktów, ale także umożliwia ustalenie, czy prowadzone procesy technologiczne i zabiegi utrwalania żywności przebiegają prawidłowo.

W analizie mikrobiologicznej żywności stosuje się różne metody. Ich wybór zależy głównie od typu badanej żywności.

Kierunek mikrobiologicznej analizy żywności może dotyczyć:

• oznaczenia ogólnej liczby drobnoustrojów

• oznaczenia drobnoustrojów wskaźnikowych

• oznaczenia obecności, liczby i grupy drobnoustrojów wywołujących psucie

• wykrywania lub oznaczania liczby drobnoustrojów wywołujących zatrucia pokarmowe.

OZNACZANIE OGÓLNEJ LICZBY DROBNOUSTROJÓW

1. Metody bezpośrednie (mikroskopowe)

Polegają one na liczeniu drobnoustrojów bezpośrednio pod mikroskopem. W cienkiej warstwie płynu, w znanej objętości i na znanej powierzchni szkiełka liczy się komórki żywe, martwe i uszkodzone.

Metody mikroskopowe obejmują liczenie drobnoustrojów:

• za pomocą komór

• metodą Breeda

• metodą filtrów membranowych

Za pomocą komór

Komory do bezpośredniego liczenia drobnoustrojów pod mikroskopem są to zazwyczaj grubościenne szkiełka przedmiotowe z wgłębieniem o znanej głębokości i powierzchni podzielonej na kwadraty lub prostokąty. Używa się komór: Thoma, Howarda, Bürera, Fuchsa-Rosenthala.

W komorach możliwe jest liczenie tylko większych komórek, takich jak drożdże, zarodniki pleśni i duże komórki bakteryjne.

Komora Thoma (homocytomer) jest to grube szkiełko przedmiotowe z wgłębieniem głębokości 0,1 mm, podzielonym na 16 dużych kwadratów, z których każdy składa się z 16 małych kwadracików o boku 0,5 mm. Na siatkę komory nanosi się kroplę zawiesiny drobnoustrojów i przykrywa się szkiełkiem nakrywkowym. Pod mikroskopem, stosując obiektyw powiększający 40x lub 60x, liczy się komórki w 40 lub 80 małych kwadratach (w każdym kwadracie: liczba komórek znajdujących się wewnątrz pola plus połowa komórek znajdujących się na liniach) i oblicza się średnią przypadającą na jeden kwadrat

Metoda Breeda

Na znanej powierzchni szkiełka przedmiotowego rozprowadza się znaną objętość zawiesiny, preparat po utrwaleniu barwi się i liczy drobnoustroje pod mikroskopem z użyciem obiektywu immersyjnego. Metoda ta pozwala na oznaczenie liczby bakterii w badanym produkcie. Do prawidłowego przeprowadzenia badania przygotowuje się trzy preparaty z tej samej zawiesiny. W każdym preparacie oblicza się średnią z 20 pól widzenia, a następnie średnia z trzech preparatów.

Metoda filtrów membranowych

Stosuje się ją do liczenia bakterii w środowiskach ubogich w drobnoustroje. Polega na przesączeniu przez odpowiednio zabarwiony filtr określonej objętości próby, a następnie wybarwieniu bakterii znajdujących się na filtrze i liczeniu ich pod mikroskopem. Po przesączeniu próby filtr wyjmuje się z oprawy, suszy i umieszcza na szkiełku przedmiotowym. Komórki liczy się z użyciem obiektywu immersyjnego w określonej liczbie pól widzenia.

Liczbę bakterii w 1 cm³ badanej próbki oblicza się ze wzoru:

liczba bakterii / liczba pól mikroskopu x współczynnik x rozcieńczenie

Oblicza się pole filtru i pole widzenia mikroskopu, a następnie współczynnik równy stosunkowi pola filtru do pola widzenia mikroskopu.

2. Metody pośrednie

Polegają one na liczeniu kolonii metodą płytkową. Ogólną zasadą metod płytkowych jest posiew określonej objętości badanej próbki na podłoże stałe, a po okresie inkubacji - stwierdzenie liczby wyrosłych kolonii. Metodami tymi można z większym lub mniejszym prawdopodobieństwem określić rzeczywistą liczbę drobnoustrojów. Wyniki jednak są zawsze niższe, ponieważ na płytkach liczy się tylko kolonie drobnoustrojów, które są zdolne do wzrostu na danym podłożu i w danej temperaturze. Ponadto niektóre bakterie, występujące w skupiskach i łańcuszkach złożonych niekiedy z kilkudziesięciu komórek, dają również jedną kolonię.

Metody pośrednie oparte są na:

• posiewie i liczeniu kolonii metodą zalewową

• posiewie powierzchniowym

• oznaczeniu najbardziej prawdopodobnej liczby drobnoustrojów (NLP)

Próbkę żywności przeznaczonej do oznaczeń ilościowych należy odpowiednio przygotować, tzn. rozcieńczyć, a w przypadku produktów stałych - najpierw rozdrobnić.

Posiew ilościowy metodą płytkową

Jest to metoda wprowadzona przez Roberta Kocha. Oprócz liczenia drobnoustrojów znalazła zastosowanie do izolowania czystych kultur i obserwacji morfologicznych kolonii mikroorganizmów.

Posiewu można dokonać w dwojaki sposób:

• przez wprowadzenie badanej próbki do płytki i zalanie jej upłynniony podłożem stałym (metoda zalewowa)

• przez wprowadzenie próbki na powierzchnię zastygłego podłoża i rozprowadzenie za pomocą głaszczki (metoda posiewu powierzchniowego)

Oznaczanie liczby drobnoustrojów metodą posiewu powierzchniowego

Przy ilościowym oznaczaniu określonych grup drobnoustrojów na podłożach wybiórczych stosuje się posiew powierzchniowy na podłoża uprzednio rozlane i zestalone w płytkach.

Najczęściej posiewa się 0,1 lub 0,5 cm³ z odpowiednich rozcieńczeń próbki i natychmiast rozprowadza równomiernie po całej powierzchni, za pomocą specjalnie wygiętej jałowej bagietki (głaszczki).

Określenie najbardziej prawdopodobnej liczby drobnoustrojów

Metoda ta służy do oznaczania drobnoustrojów występujących w niewielkiej liczbie w produktach spożywczych. Polega na hodowli określonych grup bakterii na pożywkach selektywnych (płynnych lub stałych). W metodzie tej używa się trzech lub pięciu probówek (lub płytek) zawierających odpowiednio po 10 cm³ lub 15 cm³ podłoża, ustawionych w trzech rzędach. Zależnie od kierunku analizy i rodzaju produktu, do pierwszego rzędu probówek posiewa się po 10 cm³ próbki z rozcieńczenia wyjściowego (1:10), a następnie po 1 cm³ z dwóch kolejnych rozcieńczeń dziesiętnych. Jeżeli posiewamy po 10 cm³ próby, w pierwszym rzędzie pożywka powinna być podwójnie stężona. Po okresie inkubacji, z odpowiednich tabel opartych na rachunku prawdopodobieństwa odczytuje się najbardziej prawdopodobną liczbę bakterii.

Metody wskaźnikowe

Metody wskaźnikowe pozwalają na stwierdzenie obecności drobnoustrojów na podstawie ich aktywności biochemicznej.

Metodami tymi określa się obecności drobnoustrojów, które nawet w niewielkich ilościach wskazują na stan sanitarny produktu, jednocześnie są trudne do wykrycia metodami płytkowymi.

Do metod wskaźnikowych zalicza się:

• oznaczanie miana

• próbę reduktazową

Oznaczanie miana

Miano - najmniejsza ilość produktu, w której stwierdzono obecność danego drobnoustroju. W celu oznaczenia miana, do rzędu probówek z podłożem płynnym posiewa się po 1 cm³ odpowiednich rozcieńczeń badanego produktu. Ostatnie rozcieńczenie, w którym stwierdzono jeszcze dodatnia reakcję (wzrost, zmętnienie, odbarwienie podłoża, obecność gazu) przyjmuje się jako miano. Powszechnie stosuje się oznaczanie miana coli oraz miana enterokoków, a także bakterii beztlenowych.

Miano coli

Jest ono najczęściej stosowanym oznaczeniem w ocenie sanitarno-higienicznej żywności. Obecność bakterii coli w produkcie wskazuje na możliwość zanieczyszczenia kałowego, a tym samym na możliwość zakażenia bakteriami chorobotwórczymi z grupy drobnoustrojów jelitowych, które należą do tej samej rodziny, co pałeczka okrężnicy.

Oznaczenie miana coli metodą probówkowo-fermentacyjną daje wyniki orientacyjne.

Dlatego też w razie wyników dodatnich lub wątpliwych stosuje się badania potwierdzające. Próby dodatnie i wątpliwe posiewamy na podłoża wybiórcze, które umożliwią dalszą identyfikację pałeczek okrężnicy.

Miano enterokoków

Enterokoki, głównie gatunki Enterococcus faecalis i Enterococcus faecium, występują podobnie jak Escherichia coli, w przewodzie pokarmowym ludzi i zwierząt. Ich obecność w żywności świadczy o zakażeniu kałowym. W odróżnieniu od pałeczek z grupy coli, enterokoki odznaczają się większą odpornością na działanie czynników środowiskowych i charakteryzują się znacznie dłuższym okresem przeżywania.

Miano bakterii beztlenowych

Oznaczanie komórek beztlenowców jest trudne z uwagi na konieczność przestrzegania warunków ściśle beztlenowych. Jak dotąd nie ma uniwersalnej metody ilościowego oznaczania bakterii beztlenowych. Jako podłoża stosuje się pożywki stałe i płynne. Bardzo często jest to podłoże Wrzoska. Wynik dodatki wymaga potwierdzenia badaniem mikroskopowym lub posiewem na podłoże selektywne.

Próba reduktazowa

Jest ona stosowana do oceny czystości mleka surowego i pasteryzowanego.

Jest oparta na oznaczeniu momentu wyczerpania tlenu rozpuszczonego w mleku przez bakterie. Czas, w jakim tlen zostanie zużyty, zależy od ilości rodzaju i aktywności rozwijających się drobnoustrojów. Po zużyciu tlenu funkcję akceptora wodoru pełni dodany do mleka barwnik (błękit metylenowy, rezasuryna). Błękit metylenowy, w wyniku zmiany potencjału oksydoredukcyjnego środowiska, przechodzi z formy barwnej w postać bezbarwną. Do bakterii zużywających tlen należą przede wszystkim bakterie mlekowe oraz pałeczki z grupy coli.

WYKRYWANIE DROBNOUSTROJÓW WYWOŁUJĄCYCH PSUCIE SIĘ ŻYWNOŚCI

Pleśnie i drożdże rosną bardzo dobrze na brzeczce słodowej oraz na podłożach zawierających ekstrakt drożdżowy, o pH 5,0-6,0.

Dla grzybów rosnących przy pH bliskim obojętnemu wprowadza się do podłoża NaCl w ilości 6-7% lub antybiotyki czy inne związki w celu zahamowania rozwoju szybciej rosnących bakterii, uniemożliwiających swobodny rozwój grzybów.

Do oznaczenia laseczek przetrwalnikujących bakterii tlenowych z rodzaju Bacillus stosuje się podłoża standardowe.

Laseczki beztlenowe z rodzaju Clostridium wymagają warunków beztlenowych (oznacza się ich miano).

Laseczki redukujące siarczyny wykrywa się na podłożu Wilson-Blaira (tworzą charakterystyczne czarne kolonie).

Bakterie fermentacji mlekowej (zarówno pałeczki jak i ziarniaki) mają duże wymagania odżywcze. Do ich wykrywania stosuje się najczęściej podłoże De Mana-MRS. Często przeprowadza się badania w kierunku drobnoustrojów o określonych uzdolnieniach enzymatycznych: proteolitycznych, amylolitycznych, lipolitycznych i innych.

Do wykrywania drobnoustrojów proteolitycznych wykorzystuje się żelatynę i kazeinę. Bakterie rozkładające kazeinę powodują powstanie przezroczystej obwódki wokół kolonii, a rozkładające żelatynę - upłynnienie podłoża.

WYKRYWANIE DROBNOUSTROJÓW WYWYOŁUJĄCYCH ZATRUCIA POKARMOWE

Metody wykrywania tych drobnoustrojów są zazwyczaj długie i wieloetapowe.

Izolacja bakterii z rodzaju Salmonella jest złożoną analizą wymagającą podłoży selektywnych, namnażających (zazwyczaj stosuje się równolegle dwa podłoża wybiórcze - z selenianem sodowym i czterotionianem sodu). Następnie po inkubacji hodowle rozsiewa się powierzchniowo na płytki z co najmniej dwoma podłożami wybiórczymi (SS, MacConkey'a), a następnie wykonuje się testy biochemiczne i serologiczne podejrzanych kolonii, potwierdzając ich przynależność do rodzaju Salmonella.

Wykrywanie gronkowców chorobotwórczych (Staphylococcus aureus) wykonuje się w dwóch kierunkach. Pierwszy to oznaczanie ich obecności lub liczby, drugi to badanie obecności enterotoksyny w żywności. Najbardziej przydatnym podłożem wybiórczym jest podłoże Baird-Parkera. Badany materiał posiewa się na podłożu Giollitti-Cantoni. W przypadku wzrostu i obecności czarnego osadu lub sczernienia podłoża, posiewa się na podłoże Baird-Parkera. Gronkowce rosną tworząc kolonie o czarnej barwie otoczone strefą przejaśnienia. Obecność gronkowców należy potwierdzić dalszymi testami.

BIOCHEMICZNE TESTY DIAGNOSTYCZNE W BADANIU WYMAGAŃ ODŻYWCZYCH DROBNOUSTROJÓW I PRODUKTÓW ICH METABOLIZMU

Wykorzystanie zawartych w podłożu składników zależy od właściwości biochemicznych drobnoustrojów, tzn. od wytwarzanych przez nie enzymów i może dać podstawę do opracowania specyficznych testów.

Inna grupa testów dotyczy wykrywania produktów metabolizmu. Przemiany biochemiczne dokonywane przez bakterie są na ogół charakterystyczne dla poszczególnych rodzajów czy gatunków i stanowią w określonych warunkach ich stałą cechę.

PRAKTYCZNE ZASTOSOWANIE TESTÓW


Wykorzystanie źródeł węgla

Heterotrofy wykorzystują węglowodany zarówno w warunkach tlenowych, jak i beztlenowych. Glukoza jest najłatwiej przyswajalnym źródłem energii.

Związki wielocukrowe są wykorzystywane tylko przez te drobnoustroje, które posiadają zdolność do ich rozkładu.

W zależności od uzdolnień enzymatycznych, mikroorganizmy mogą wykorzystywać skrobię, celulozę, ligninę, pektyny i inne złożone związki tej grupy.

Aktywność amylolityczna drobnoustrojów syntetyzujących enzymy hydrolizujące skrobię bada się na podłożu zawierającym odpowiedni wielocukier.

Hodowle drobnoustrojów na płytce Petriego na podłożu zawierającym skrobię zalewa się płynem Lugola.

Po zalaniu roztworu, wokół kolonii drobnoustrojów będzie widoczna wyraźna strefa przejaśnienia. Podłoże z nierozłożoną skrobią pod wpływem jodu zabarwi się na niebiesko.

Wykorzystanie źródeł azotu

Drobnoustroje najczęściej wykorzystują proste związki azotowe - sole amonowe, wodorotlenki azotu, azotany.

Z połączeń organicznych najczęściej wykorzystują peptony - produkty częściowej hydrolizy białek. Zawierające peptydy i aminokwasy białka mogą być wykorzystywane jedynie przez drobnoustroje proteolityczne.

Właściwości proteolityczne są oznaczane na podstawie zdolności do rozrzedzania żelatyny w słupkach.

Wykonuje się głęboki posiew kłuty. Hodowle badanych drobnoustrojów prowadzi się w temperaturze 18-20°C. Dla wykazania, czy żelatyna uległa wykorzystaniu (rozrzedzeniu), probówki przed odczytem umieszcza się w zimnej wodzie lub chłodni.

Właściwości proteolityczne można również określić na podłożu Fraziera (pożywka żelatynowa zestalona agarem). Po inkubacji hodowlę zalewa się odczynnikiem Fraziera (roztwór sublimatu). Pod wpływem sublimatu żelatyna ulega denaturacji tworząc białe nieprzezroczyste plamy. Wykorzystanie żelatyny przez bakterie powoduje powstawanie stref przejaśnienia wokół kolonii.

Hydroliza mocznika

Liczne bakterie tzw. mocznikowe, dzięki syntezie ureazy, są zdolne do hydrolitycznego rozkładu mocznika z wytworzeniem amoniaku. Obecność ureazy stwierdza się na podłożu Christensena z mocznikiem. Podłoże to zawiera jako wskaźnik czerwień metylową. Zmiana zabarwienia pożywki po hodowli z żółtej na fioletową świadczy o alkalizacji podłoża w wyniku rozkładu mocznika, a tym samym - o wytworzeniu ureazy przez badane bakterie.

Rozkład tłuszczów

Zdolność wykorzystywania tłuszczów mają bakterie wytwarzające lipazy. Produkty rozkładu tłuszczów - glicerol i kwasy tłuszczowe - są wykorzystywane przez bakterie jako źródło węgla. Właściwości lipolityczne sprawdza się na podłożach zawierających np. Tween 80. Wokół kolonii rozkładających tłuszcze widoczne są strefy przejaśnień.

Wykrywanie produktów metabolizmu

Do wykrywania obecności swoistych produktów pośrednich powstałych podczas fermentacji glukozy lub produktów odbudowy białek i aminokwasów, służą specyficzne testy. Należy tu wymienić reakcje wykrywania acetylometylokarbinolu, amoniaku, siarkowodoru i …

Wykrywanie acetylometylokarbinolu

W reakcji Vogesa-Proskauera (VP test) powstały z glukozy acetylometylokarbinol (acetoina) jest utleniony przez odczynnik alfa-naftol do dwuacetylu, który w obecności jonów K⁺ daje czerwone zabarwienie z resztami guanidyny w pożywce i jest podstawą oznaczania …

Wykrywanie wytwarzanego amoniaku przez drobnoustroje proteolityczne lub mocznikowe następuje w reakcji z odczynnikiem Nesslera.

Czerwonobrunatne zabarwienie hodowli świadczy o degradacji aminokwasów przez testowany mikroorganizm.

Wytwarzanie indolu przez bakterie rozkładające tryptofan stwierdza się na podłożu tryptofanowym w reakcji z odczynnikiem Ehrlicha. Do probówki z hodowlą drobnoustrojów dodaje się ostrożnie odczynnik. Przy obecności indolu w miejscu zetknięcia odczynnika z hodowlą powstaje czerwono-różowa obrączka.

Wykrywanie indolu dotyczy rodziny Enterobakteriaceae, pozwalając odróżnić rodzaj Escherichia od pozostałych.

Wykrywanie kwasu i gazu w szeregu cukrowym

Badanie różnych gatunków bakterii w tzw. szeregu cukrowym pozwala ustalić ich zdolność do metabolizowania różnych cukrów i określić stopień rozkładu substratu na kwas i gaz.

Bakterie wysiewa się na podłożu fermentacyjnym zawierającym 1% badanego cukru i wskaźnik Andrade. Po inkubacji stwierdza się wytwarzanie kwasu i gazu. Wytworzony kwas organiczny zmienia barwę podłoża na różowy, a gaz zbiera się w rurce Durhama.

Wytwarzanie ß-galaktozydazy

Laktoza jest fermentowana przez drobnoustroje wytwarzające enzym ß-galaktozydazę. Obecność tego enzymu stwierdza się w reakcji z ONPG. Wynikiem dodatnim potwierdzającym obecność enzymu jest żółte zabarwienie wytwarzanego o-nitrofenolu.

OZNACZANIE KATALAZY

Powstający w procesie oddychania komórek nadtlenek wodoru jest substancją silnie trującą. Mikroorganizmy likwidują jej nadmiar przy pomocy enzymu katalazy. Drobnoustroje wytwarzające katalazę rozkładają H₂O₂ do H₂O i O₂. Wykrywanie katalazy znalazło praktyczne zastosowanie w diagnostyce bakterii.

Wyróżnia się drobnoustroje katalazododatnie i katalazoujemne. Obecność enzymu wykrywa się dodając do hodowli 3% roztwór wody utlenionej. O wyniku dodatnim świadczy wytwarzanie pęcherzyków gazu.

23

---