Ćwiczenie 1

Temat: Podstawowe techniki badań mikrobiologicznych

Zasady bezpiecznej pracy w pracowni mikrobiologicznej

• w laboratorium mikrobiologicznym należy przebywać w fartuchu ochronnym; płaszcze zostawić w szatni uczelni;

• do wszystkich prac z mikroorganizmami należy używać jednorazowych rękawiczek

ochronnych;

• na sali ćwiczeń nie wolno jeść, pić, palić, a także żuć gumy, długie włosy należy

związać;

• należy ściśle przestrzegać procedur, pracować jedynie w wyznaczonych miejscach

i słuchać zaleceń prowadzącego;

• w czasie wykonywania ćwiczeń przestrzegać zasad pracy jałowej, ostrożnie obchodzić się z materiałem badanym, wszelkie czynności związane z posiewami wykonywać przy zapalonym palniku, założone hodowle dokładnie opisywać;

• przed rozpoczęciem pracy i po jej zakończeniu miejsce pracy przemyć dokładnie

środkiem dezynfekującym (70% alkoholem etylowym);

• probówki i kolbki z hodowlami oraz szalki Petriego powinny być zawsze zamknięte;

otwieramy je tylko na czas pobrania materiału i natychmiast zamykamy;

• z pracowni nie wolno wynosić na zewnątrz hodowli mikroorganizmów, preparatów,

odczynników, szkła laboratoryjnego;

• odpady powinny być pozostawiane w miejscach oznaczonych lub wskazanych przez prowadzącego;

• drobny sprzęt metalowy (np. ezy, pincety) należy zarówno przed, jak i po użyciu, opalić w palniku w celu zniszczenia drobnoustrojów;

• odpady (np. płynne hodowle bakteryjne) jak i drobny sprzęt plastykowy (np. ezy jednorazowego użytku) neutralizuje się płynem zabijającym bakterie, grzyby i wirusy (Domestos, Vircon) przez 30 minut;

• po zakończeniu pracy należy umyć ręce;

• wszelkie próbki mikrobiologiczne muszą być odpowiednio opisane i oznakowane;

• po zakończeniu zajęć należy uporządkować stoły i sprawdzić czy zostały zgaszone palniki spirytusowe;

Praca w warunkach sterylnych.

W mikrobiologii ogromny wpływ na uzyskiwane wyniki pracy ma higiena osobista oraz jałowowość (sterylność) pomieszczeń, sprzętu i pożywek mikrobiologicznych.

Środowisko „jałowe” (sterylne) to takie, które nie zawiera żadnych żywych drobnoustrojów, niezależnie od stadium rozwojowego, a więc zarówno form wegetatywnych jak też form przetrwalnikowych (endospory bakterii, zarodniki grzybów).

W jałowieniu, wykorzystywanym w laboratoraich badawczych, w medycynie, zakładach przetwórstwa rolno-spożywczego i w życiu codziennym, zastosowanie mają następujące procesy:

1. DEZYNFEKCJA - proces zabicia wszystkich form wegetatywnych mikroorganizmów chorobotwórczych za pomocą metod fizycznych, chemicznych i mechanicznych; dezynfekcja nie zapewnia całkowitej jałowości, gdyż pozostają aktywne formy przetrwalnikowe bakterii;

2. ANTYSEPTYKA - dezynfekcja żywych tkanek; może być stosowana profilaktycznie (w celu zapobiegania infekcjom) lub terapeutycznie (do leczenia infekcji); środki powszechnie używane w aseptyce to: mydła, 70% etanol (v/v), jodyna (w roztworze wodnym lub alkoholowym), itp.

3. STERYLIZACJA - proces mający na celu zabicie wszystkich mikroorganizmów niezależnie od stadium rozwojowego, a więc zarówno form wegetatywnych, jak też form przetrwalnikowych (endospory bakterii, zarodniki grzybów),

Sterylizację (wyjaławianie) przeprowadza się następującymi metodami:

• Metody fizyczne (podwyższona temperatura, promieniowanie, sączenie)

• Metody chemiczne (z użyciem czynników chemicznych)

Metody fizyczne

• Sterylizacja cieplna sucha

• Wyżarzanie i opalanie

Ezy (drucik z oczkiem wykonanym z platyny lub ze stopu platynopodobnego) i igły wyżarza się do czerwoności w płomieniu palnika spirytusowego (lub gazowego). Czynności te wykonuje się przed i po każdym użyciu. Wyloty probówek, kolb i wszelkich naczyń, które są zamykane korkami, opala się po otworzeniu w płomieniu palnika, co zapobiega zanieczyszczeniu pożywki oraz hodowli. Szklane bagietki i głaszczki opala się w płomieniu po uprzednim zanurzeniu w 70% alkoholu etylowym.

Igła, eza, głaszczka.

• Gorące i suche powietrze

Szkło labolatoryjne (probówki, kolby) wyjaławia się w suszarkach w gorącym i suchym powietrzu o temperaturze 160°-180°C przez 60-120min.

Przedmioty w ten sposob jałowione muszą zostać przed sterylizacją zabezpieczone przed powtórnym zakażeniem (pakuje się je w papier, folię aluminiowa, probówki i kolby zamyka sie korkami, pipety umieszcza się

w metalowych puszkach lub tubusach).

• Sterylizacja cieplna mokra (parą wodną)

• Gorąca para wodna pod zwiększonym cisnieniem

Większość pożywek mikrobiologicznych, płyn fizjologiczny, bufory, wodę destylowaną wyjaławia się w autoklawie (autoklawowanie) w temperaturze 120°C przez 20-30 miniut. Jałowienie zachodzi w w nasyconej parze wodnej pod ciśnieniem 1 atmosfery. Działanie autoklawu polega na sterylizacji wysoką temperaturą uzyskaną po sprężeniu nasyconej pary wodnej. Para ta

w zetknięciu z bardziej chłodnymi przedmiotami wyłajawianymi skrapla się w postaci wody, uwalniając dużą ilość utajonego ciepła kondensacji, które podnosi temperaturę sterylizacji.

Temperatura i ciśnienie stosowane w autoklawach pozwalają na zabicie wszystkich dronoustrojów, łącznie z najbardziej ciepłoopornymi i ich przetrwalnikami.

Czas autoklawowania zależy od objętości materiału i rodzaju przedmiotów poddawanych sterylizacji.

Na skuteczność sterylizacji ma wpływ czas - im wyższa temperatura sterylizacji tym krótszy czas wyjaławiania.

Nie sterylizuje sie stężonych roztworów cukrów i substancji łatwo hydrolizujących.

• Pasteryzacja to działanie na drobnoustroje temperaturą do 100°C w strumieniu pary wodnej. W procesie tym giną jedynie formy wegetatywne, natomiast nie ulegają zniszczeniu formy przetrwalnikowe bakterii, które wytrzymują wielogodzinne gotowanie. Pasteryzacja ma na celu zabicie bakterii chorobotwórczych w produktach spożywczych (głównie płynnych, np. mleku i jego przetworach , piwie, sokach owocowych) oraz przedłużenie trwałości tych produktów w wyniku zniszczenia większości drobnoustrojów saprofitycznych nieprzetrwalnikujących.

Technologia UHT (Ultra High Temperature).

• Tyndalizacja to proces trzykrotnej sterylizacji przeprowadzanej w odstępach co 24 godziny w aparacie Kocha. Aparat Kocha jest to zamykany pokrywą kocioł z podwójnym dnem, którego spód stanowi zbiornik z wodą podgrzewaną do temperatury wrzenia. Gorąca para wodna ulatnia się przez dziurkowane dno zbiornika.

W pierwszej fazie (pasteryzacja w 100°C przez 30 minut) giną formy wegetatywne. Okres przerwy po pierwszej pasteryzacji pozwala na wykiełkowanie form przetrwalnikowych, które nie uległy zabiciu. Druga pasteryzacja zabija formy wegetatywne, które rozwinęły się z form przetrwalnikowych, a trzecia upewnia nas o zabiciu wszystkich drobnoustrojów.

Schemat aparatu Kocha

• Sterylizacja przez sączenie (filtrowanie)

Filtrowanie - metodę tą stosuje się do wyjaławiania płynów ulegających zniszczeniu (zmianom fizyczno - chemicznym) nawet przy nieznacznym podgrzaniu; filtrowaniu poddaje się roztwory cukrów, witamin, aminokwasów, pożywki zawierające mocznik, surowicę krwi, płyny wysiękowe;

Do wyjaławiania stosuje się filtry membranowe (0,2um). Pory filtrów są mniejsze od wymiarów bakterii (za wyjątkiem Mycoplasma sp), odfiltrowane drobnoustroje osadzają się na filtrze, a uzyskany filtrat jest jałowy.

Przez małe otwory w filtrze płyn przemieszcza się z trudem, w związku z tym należy stosować podciśnienie (uzyskiwane za pomocą pompki wodnej) lub nadciśnienie (w filtrach strzykawkowych).

Filtr strzykawkowy

• Sterylizacja poprzez promieniowanie

Promieniowanie elektromagnetyczne obejmuje zakres od ultrakrótkich promieni kosmicznych, poprzez promienie X, UV, widzialną część światła słonecznego do podczerwieni i długich fal radiowych. W mikrobiologii wykorzystuje się najczęściej hamujące lub zabójcze działanie na mikroorganizmy nadfioletowej części widma słonecznego o długosci fali 230-270nm (promienieniowanie ultrafioletowe) i promieniowanie jonizujące (promienie X i gamma). U podstaw działania promieniowania leży zjawisko jego pochłaniania przez substancje chemiczne komórki. W zalżności od dawki oraz czasu działania promieniowania na drobnoustroje obserwuje się efekt mutagenny (komórka ulega mutacji) lub letalny (bójczy - śmierć komórki).

Źródłem promieniowania są lampy kwarcowe, wypełnione oparami

rtęci, emitujące w 95% promieniowanie o długosci fali 259 nm. Promieniowanie UV

jest wykorzystywane do niszczenia mikroorganizmów występujących w powietrzu

i na odkrytych powierzchniach zamkniętych (blaty stołów laboratoryjnych i powietrze

w laboratoriach, boksy bakteriologiczne i komórkowe, salach operacyjnych, linie technologiczne, itp.). Ponieważ charakteryzuje się słabą przenikliwością - nie przenika przez zwykłe szkło, stąd promieniowanie UV nie jest wykorzystywane do wyjaławiania szkła i podłoży mikrobiologicznych.

Źródłem promieniowania jonizującego wykorzystywanym na skalę przemysłową są izotopy (kobalt 60) i akceleratory elektronów (akceleratory liniowe). Sterylizacji radiacyjnej poddaje się przede wszytskim sprzęt jednorazowego użytku (np. strzykawki, igły, skalpele, itp.), surowce i produkty farmaceutyczne, kosmetyki itp.

Metody chemiczne

Dezynfekcja jest selektywną eliminacją drobnoustrojów, zapobiegającą przenoszeniu niektórych nieporządanych mikroorganizmów przez działanie na ich strukturę lub metabolizm, niezależnie od funkcjonalnej postaci komórki. Różnica pomiędzy dezynfekcją a sterylizacją polega na rodzaju środków oraz spektrum drobnoustrojów, które są eliminowane podczas ich stosowania. Do dezynfekcji stosuje się środki chemiczne i postępowanie to prowadzi do eliminacji wegetatywnych form drobnoustrojów.

Z dezynfekcją wiążą się następujące pojęcia:

• Sanityzacja - jest to mycie przy użyciu detergentów pomieszczeń (i ich wyposażenia) narażonych na silne zanieczyszczenie drobnoustrojami (sale chorych, korytarze szpitalne, łazienki, itp.);

• Aseptyka - zespół czynności umożliwiających jałowe przygotowanie leków lub produktów medycznych;

• Antyseptyka - jest to postępowanie prowadzące do usuwania drobnoustrojów ze skóry, błon śluzowych, uszkodzonych tkanek;

Dezynfekujące środki chemiczne różnią się one aktywnością biologiczną i mechanizmami działania. Aktywność biologiczna środków dezynfekujących zależy od rodzaju związku chemicznego i jego stężenia, gatunku mikroorganizmów, stanu fizjologicznego i liczebności populacji, czynników środowiskowych (temperatury, kwasowości podłoża) i obecności substancji organicznych w otoczeniu.

W zależności od rodzaju czynników chemicznych, a także od ich stężenia, efektem może być zahamowanie wzrostu i rozwoju mikroorganizmów (działanie cytostatyczne) lub w następstwie oddziaływania na struktury lub szlaki metaboliczne zabicie ich (działanie bakterio- lub grzybobójcze).

Środki dezynfekcyjne powinny wykazywać następujące cechy:

• skuteczność;

• działanie na drobnoustroje w małym stężeniu, w krótkim czasie w temperaturze otoczenia;

• nietoksyczność dla ludzi w trakcie ich stosowania jak i po dezynfekcji;

• możliwośc spłukania wodą;

• wykazywać szerokie spektrum działania;

Do związków chemicznych najczęściej stosowanych w dezynfekcji należą:

• Kwasy i zasady - efekt ich działania wiąże sie z aktywnością jonów wodorowych lub worotlenowych; rzadko stosowane - niszczą nie tylko drobnoustroje, ale też przedmioty i materiały poddawane dezynfekcji; kwasy nieorganiczne są bardziej skuteczne niż kwasy nieorganiczne;10% roztwory zasad, 20% zawiesina wodorotlenku wapnia (mleko wapienne); rozcieńczony kwas nadoctowy;

• Środki utleniające - głównie związki chloru; w praktyce używa się chloraminy organiczne (S, B, T) i podchloryny (sodu lub wapnia); chloramina T zawiera 12,5% czynnego chlorui dziala najsilniej w środowisku kwaśnym; do dezynfekcji rąk stosuje się chloraminy w stężniu 1%, a do odkażania pomieszczeń w stężeniu 5%; podchloryny działają najlepiej w pH obojętnym lub kwaśnym i w niskich temperaturach i stosuje się je do dezynfekcji pomieszczeń;

Utleniaczem jest również ozon stosowany do dezynfekcji wody (w stężeniu 0,3 mg/litr do dezynfekcji wody wodociągowej);

Do środków utleniających zaliczamy również: nadmanganian potasowy i 3% roztwór H₂O₂ (wodę utlenioną).

1. Alkohole - aktywność bójcza alkoholi wzrasta wraz z liczbą atamów węgla w ich cząsteczce (C1-C5), a najczęsciej stosowanym jest etanol (70%); propanol (80%) działa silnie alergicznie dlatego nie stosuje się go do dezynfekcji osobistej; zastosowanie w dezynfekcji znajduje również alkohol benzylowy; alkohole są wykorzystywane do dezynfekcji bez koniecznosci płukania wodą;

2. Aldehydy - najsilniejsze działanie antybakteryjne wykazuje aldehyd mrówkowy i aldehyd glutarowy; preparatem handlowym aldehydu mrówkowego jest formalina (mieszanina 37% aldehydu mrówkowego z 10-15% aldehydem metylowym) a do odkażania stosuje się roztwór wodny lub alkoholowy formaliny w stężeniu od 3 do 20%;

Aldehyd glutarowy działa ma szerokie spektrum działania (bakterie Gram+ i Gram- w tym prątki gruźlicy, wirusy i grzyby chrobotwórcze; produktem handlowym aldehydu glutarowego jest aldesan (septofarm) stosowany

w stężeniu 2%;

• Związki fenolu i ich pochodne - fenol i jego pochodne działają silnie bakteriobójczo (słabo antywirusowo) w środowisku kwaśnym; preparaty hadlowe tych związków to: lizol (roztwór krezolu i kwasów tłuszczowych, stosowane stężenie 2-8%), septyl (mieszanina amylofenolu i fenylofenolu, stosowane stężenie 1-2%) i desson (roztwór chloro-ksylenol-terpineolu i soli potasowej kwasu rycynowego, stosowane stężenie 2-5%);

• Związki powierzchniowo czynne - do tej grupy zalicza się czwartorzędowe związki amoniowe, ulegające dysocjacji w wodzie do naładowanego ujemnie jonu chlorkowego i kompleksowego jonu naładowanego dodatnio; związki te obniżają napięcie powierzchniowe i mechanizm ich działania opiera się na zmianie przepuszczalności ściany i błony komórkowejdrobnoustrojów ; najczęściej stosuje się 2-10% roztwory czwartorzędowych zasad benzylo-alkilo-amoniowych i pirymidynowych, np. sterinol (10% roztwór bromku dimetylo-laurylo-benzylo-amoniowego) i zanosept (25% roztwór bromku laurylo-propylo-amonowego);

Substancje te charakteryzuje szerokie spektrum działania (bakterie Gram+ i Gram-, grzyby pleśniowe, drożdze, wirusy) i długotrwaly efekt sterylizacyjny;

• Jodofory - koloidalne roztwory jodu w związkach powierzchniowo czynnych lub polimerach spełniających rolę nośników; uwalniany jod działa bakteriobójczo; stosuje się 2-10% roztwory jodoseptylu lub incodyny; do dezynfekcji ran stosuje się 10% roztwór jodu - jodynę);

• Sole metali ciężkich - silne działanie bakteriobójcze wykazują sole rtęci i srebra; najbardziej rozpowszechnione są organiczne związki rtęci (fenylopochodne - merkurochrom i mertiolat);

Stosowanie aldehydów, związków fenolowych (fenol, lizol), jodoforów czy soli metali ciężkich nie jest powszechne, a w niektórych krajach obecnie zakazane ze względu na toksyczność.

Dodatkowe pojęcia:

- krzywa śmierci cieplnej drobnoustrojów;

- czas smierci cieplnej F;

- względna ciepłooporność drobnoustrojów;

- decymalna redukcja liczby drobnoustrojów D;

- krzywa przeżycia drobnoustrojów podczas wyjaławiania;

- kontrola sterylizacji;

- kontrola skażenia powierzchni drobnoustrojami;

Podstawowe techniki badań mikrobiologicznych.

W mikrobiologii z powodu bardzo małych rozmiarów mikroorganizmów bada się najczęściej ich populacje, a nie poszczególne osobniki. Koniecznym elementem techniki mikrobiologicznej jest więc izolowanie i hodowanie mikroorganizmów w czystej kulturze tzn. kulturze stanowiącej potomstwo jednego, pierwotnie wyodrębnionego drobnoustroju.

Wszystkie zabiegi związane z otrzymywaniem czystych kultur muszą być przeprowadzane w warunkach zupełnej jałowości (sterylności). Jałowe jest takie środowisko, które nie zawiera żadnych organizmów żywych ani przetrwalników.

Izolacja czystych kultur wymaga oprócz opanowania techniki sterylizacji również znajomości sporządzania i wykorzystywania odpowiednich pożywek.

Podłoża mikrobiologiczne

Podłoże mikrobiologiczne to sztucznie stworzone środowisko wzrostu do hodowli drobnoustrojów. Jest to zazwyczaj mieszanina odpowiednio dobranych składników odżywczych, służaca do hodowania drobnoustrojów w warunkach laboratoryjnych. Podłoża stosowane są do izolacji, różnicowania, identyfikacji i namnażania drobnoustrojów, określania ich właściwości fizjologicznych, biochemicznych i hodowlanych, jak również do otrzymywania określonych produktów metabolizmu bakterii.

Pożywki do hodowli bakterii powinny charakteryzować się nastepującymi cechami:

• muszą zawierać przyswajalne źródła pierwiastków biogennych (C, O, H, N, P, S), energii, soli mineralnych (Na, Ca, K, Mg), mikroelementów (Mn, Zn, Mo, Cu, Co, Ni), substancji wzrostowych (aminokwasy, witaminy);

• powinny wykazywać optymalny dla wzrostu danego rodzaju drobnoustrojów odczyn pH oraz potencjał redoks;

• powinny wykazywać odpowiednią wartość ciśnienia osmotycznego;

• muszą być przejrzyste (wyjątek: podłoża zawierające związki nierozpuszczalne, np. CaCO₃, tłuszcze);

• muszą być jałowe;

Dodatkowo podłoża bakteriologiczne mogą zawierać:

• substancje róznicujące

• składniki wybiórcze

• czynniki zestalające

Podział podłoży mikrobiologicznych

• ze względu na skład chemiczny

• naturalne - podłoże o nie w pełni zdefiniowanym składzie chemicznym zawierające wyciągi z tkanek roślinnych lub zwierzęcych, hydrolizaty białkowe, itp.; M.in. bulion odżywczy, brzeczka, mleko odtłuszczone lub pełne;

• syntetyczne - złożone ze związków chemicznych o ściśle określonym

i znanym składzie chemicznym (jakościowym i ilościowym);

• półsyntetyczne - są częściowo poznane pod względem składu substancji odżywczych, np. podłoże M9 wg Adamsa wzbogacone dodatkiem glukozy

i autolizatu drożdży (do hodowli drobnoustrojów Proteus i Escherichia);

• ze względu na zawartość składników odżywczych

• pełne - zawierają wszystkie niezbędne substancje odżywcze, umożliwiające dobry wzrost drobnoustrojów (np. bulion odżywczy);

• minimalne - zawierają tylko składniki pokarmowe, które są niezbędne do podtrzymania wzrostu drobnoustrojów (np. podłoże M9 wg Adamsa);

• wzbogacone - sporządza się dla drobnoustrojów słabo rosnących in vitro wymagających w tych warunkach dodatkowych substancji odżywczych; jako czynniki wzbogacające stosowane są: krew, surowica, płyny wysiękowe, wyciąg wątrobowy, mleko;

• ze względu na konsystencję

• płynne - służą głównie do namnażania drobnoustrojów

• półpłynne - zawierają 0,1-0,7% agar i służą do hodowli mikroorganizmów o mniejszym zapotrzebowaniu na tlen; na podłożach tych bada się również ruch bakterii;

• stałe - zawierają 1,5-2% agar i służą obok namnażania baketrii do ich różnicowania;

• ze względu na przeznaczenie i zastosowanie

• namnażające - służą do otrzymywania dużej biomasy drobnoustrojów badanego szczepu; najczęściej są to podłoża płynne;

• wybiórcze - podłoża zawierające dodatek związków chemicznych hamujących wzrost konkretnej grupy drobnoustrojów;

• namnażająco-wybiórcze - pozwalają na namnożenie się tylko jednemu rodzajowi lub gatunkowi drobnoustrojów lub jednej grupie mikroorganizmów, znajdujących się w posiewanym materiale; podłoża te zawierają składniki hamujące wzrost jednych i ułatwiające namnażanie drugich drobnoustrojów;

• izolacyjne - podłoża stałe (płytki), zawierające odpowiedni wskaźnik (identyfikator) pozwalający odróżnić od siebie kolonie bakterii;

• różnicujące - są to podłoża identyfikujące i diagnostyczne; pozwalają na rozróżnienie dwóch typów bakterii;

Przygotowując podłoża należy:

- używać szkła odpowiednio umytego i wypłukanego;

- przestrzegać ściśle przepisów przygotowywania pożywek (odważać dokładnie składniki,

uważać na kolejność ich dodawania i na uwodnienie soli);

- używać tylko wody destylowanej;

- ustalić odpowiednie pH podłoża;

- do jałowienia rozlać je do kolb o odpowiednich objętościach (nigdy nie więcej niż

¾ objetości naczynia) gdyż mogą kipieć;

- kolby zakorkować korkami lub nałożyć kapturki z folii aluminiowej;

- zautoklawować;

Hodowla (kultura) drobnoustrojów to zespół osobników żyjących w tym samym środowisku. W laboratorium hodowlę drobnoustrojów stanowią osobniki wyrosłe na jednym podłożu. Wyróżniamy 2 rodzaje hodowli: czyste i mieszane.

Hodowla czysta to zbiór osobników tego samego gatunku stanowiący potomstwo pierwotnie wyodrębnionej interesującej nas bakterii rosnących na podłożu.

Hodowla mieszana to hodowla w skład której wchodzą osobniki różnych gatunków. Z hodowlami mieszanymi mamy do czynienia we wstępnych etapach klinicznej diagnostyki laboratoryjnej i w środowisku naturalnym.

Izolacja czystych kultur

W badaniach mikrobiologicznych posługujemy się czystymi kulturami bakterii.

Izolację czystej kultury badanego organizmu przeprowadza się na podłożach stałych. Pojedyncza komórka musi zostać odseparowana od reszty populacji.

Wyróżniamy metody pośrednie i bezpośrednie otrzymywania czystych kultur.

Do metod bezpośrednich zaliczamy: mikromanipulator i metodę Lindnera.

Metody pośrednie:

• metoda posiewu redukcyjnego

• metoda posiewu powierzchniowego (płytki „mazane”)

• metoda posiewu wgłębnego (płytki „lane”

Pojęcia dodatkowe:

- podłoże transportowe

• klon

• szczep

Część praktyczna część I

Przygotowanie szkła do jałowienia

• Umyć szkło w gorącej wodzie z dodatkiem 1% detergentu

• Płukać kilkakrotnie w bieżącej cieplej wodzie, a następnie w wodzie destylowanej

• Umyte szkło wysuszyć

• Pipety zapakować do tubusów

• Zakorkować probówki korkami z waty i zapakować w papier

• Zakorkować kolbki i nalożyć aluminowe kapturki

Jalowienie szkła

• odpowiednio zapakowane szklo ułożyć luźno w suszarce aby powietrze mogło

swobodnie krążyć;

• czas sterylizacji liczyć od momentu osiągnięcia właściwej temperatury:

przy 160°C - 2 godz., przy 180°C - 1 godz. (nie przekraczać temp. 180°C,

gdyż grozi to spaleniem papieru!).

Zapoznanie się z techniką pracy sterylnej

• dezynfekcja stołów za pomocą alkoholu etylowego

• praca w bezpośrednim sąsiedztwie płomienia palnika

• wyżarzanie ez i opalanie głaszczek

Część praktyczna część II.

1. Przygotowanie pożywki płynnej dla E. coli

Skład: 5 g NaCl

10 g pepton

5 g wyciąg drożdżowy

1000 ml woda destylowana

pH 7.4

Odważonone składniki wsypać do wody i rozpuścić. Sprawdzić pH przy pomocy papierka wskaźnikowego. Część pożywki rozlać do 2 kolbek po 50 ml. Kolbki zatkać korkami z waty i folią aluminiową. Kolbki jalowić w autoklawie przy nadciśnieniu 1 atm. przez 30 minut. Resztę pożywki zużyć do zrobienia agaru odżywczego.

Przestrzegając zasad pracy sterylnej rozlać jałowo do 3 probówek po 3 ml sterylnego bulionu. Jedną probówkę pozostawić w temperaturze pokojowej, jedną inkubować przez noc w 37ºC. W jednej przygotowanej probówce zaszczepić hodowlę E.coli. Po tygodniu sprawdzić jałowość pożywki w dwóch probówkach (również kolbki, z której pobierany był bulion i probówki kontrolnej).

Rozlewanie bulionu odżywczego do probówek:

- przygotować w statywie szereg jałowych probówek z korkami o pojemności

15 ml;

- odkorkować kolbkę z podłożem i opalić jej wylot w płomieniu palnika;

- rozlewać bulion po 3 ml

- opalić wylot probówki i zamknąć ją;

- opalić wylot kolby i zamknąć korkiem;

2. Przygotowanie agaru odżywczego (pożywka stała) i skosu agarowego.

Do kolby o pojemności 250 ml naważyc 1.5 g sproszkowanego agaru i wlać 100 ml pożywki. Kolbę zamknąć folią aluminiową. Zautoklawować. Po ostygnięciu (ok. 50-60°C) rozlać agar odżywczy na płytki.

Rozlewanie pożywki stałej na płytki Petriego:

- odkorkować kolbkę z pożywką i opalić jej wylot w płomieniu palnika;

- uchylić lekko wieczko szalki Petriego i wlać do niej pożywkę tak, aby utworzyła

na dnie kilkumilimetrową warstwę (okolo 10-12ml podłoża);

- zamknąć płytkę;

- ponownie opalić w płomieniu wylot kolby z podłożem i zamknąć ją korkiem;

- płytkę pozostawić na stole do czasu zestalenia podłoża;

- po zabezpieczeniu schować płytkę z podlożem do lodówki;

3. Skosy agarowe.

Rozlać sterylnie pożywkę do probówek (10 ml do każdej) i umieścić w statywie pod

kątem 45°.

4. Techniki posiewów na przykładzie bakterii E.coli

1. Posiew ezą na podłożu płynnym

- posiać ezą inokulum pobrane z hodowli płynnej do jednej probówki z 3ml bulionu

2. Posiew ezą na płytkę z agarem odżywczym

- na skos z agarem odżywczym - wężykiem

- na płytkę z agarem odżywczym - posiew redukcyjny wg schematu

2 1 - początek linii posiewu

2,3 - miejsca, w których przerywa

się posiew i opala ezę w celu

usunienięcia nadmiaru

materiału

1 3

Po inkubacji sprawdzić czy udało się uzyskać pojedyncze kolonie bakteryjne.

---