INŻYNIERIA GENETYCZNA

1. Inżynieria genetyczna zajmuje się manipulowaniem genami.

2. Etapy udoskonalania osobników

1. oddzielenie osobników z dzikiej populacji

2. oddzielenie jednych osobników do dalszych krzyżówek od pozostałych (tzw. selekcja sztuczna) w celu ograniczenia heterozygot - dokonuje się to przez samozapylenie (u roślin) lub chów wsobny (u zwierząt), homozygotyczność prowadzi jednak często do obniżenia żywotności i płodności; niekiedy skrzyżowanie linii czystych może prowadzić do heterozji

3. ograniczenie hodowli do niewielkiego procentu populacji

3. Etapy włączania genów jednego organizmu do genomu innego organizmu

1. wyizolowanie pojedynczego genu w wyniku pofragmentowania DNA w odpowiednich miejscach przez enzymy restrykcyjne (restryktazy występujące u bakterii wycinają tzw. sekwencję palindronową i pozostawiają tzw. lepkie końce, czyli jednoniciowe, komplementarne odcinki o sekwencji charakterystycznej dla danej restryktazy, które umożliwiają łączenie fragmentów DNA pochodzących od różnych organizmów)

2. z wszystkich wyciętych fragmentów jeden żądany fragment otrzymuje się w wyniku poddania mieszaniny fragmentów DNA elektroforezie, podczas której cząsteczki DNA obdarzone ładunkiem ujemnym wędrują w polu elektrycznym na żelu z agarozy do katody (+) - szybkość wędrówki zależy od wielkości genu (im dłuższe, tym wolniej), rozdział DNA na szereg prążków znakowanych barwnikiem fluorescencyjnym lub izotopem promieniotwórczym to tzw. profil genetyczny osobnika

3. zastosowanie sondy molekularnej w celu znalezienia szukanego genu spośród profilu genetycznego osobnika

4. łączenie fragmentów DNA przez ligazy w procesie ligacji (wyróżniamy DNA dawcy, z którego wypreparowuje się fragment i DNA biorcy, czyli wektor, do którego włącza się wypreparowany fragment - oba DNA cięte są tymi samymi restryktazami)

5. włączenie zrekombinowanego (hybrydowego) DNA do komórki biorcy

6. transformacja komórki biorcy

4. Etapy klonowania DNA:

1. metoda in vivo

• włączenie fragmentu DNA do wektora plazmidowego, który cechuje się:

• posiadaniem miejsca przecinanego przez restryktazę

• zdolnością do namnażania się w organizmie wybranego gospodarza

• posiadaniem markeru, czyli genu, który nada komórce gospodarza jakąś nową cechę (dzięki której będzie można odróżnić komórki, do których plazmid został wbudowany, a do których nie) np. wektor posiadający gen odporności na antybiotyki - bakterie hoduje się na pożywce bogatej w antybiotyki, bakterie które wbudowały wektor w swój genom są odporne na antybiotyki i ulegają na pożywce namnożeniu.

Najbardziej wydajnymi wektorami są: sztuczne chromosomy bakteryjne i sztuczne chromosomy drożdżowe.

• wprowadzenie zmienionego wektora plazmidowego do komórki bakterii

• namnażanie komórki bakterii

• zastosowanie sondy molekularnej w celu znalezienia komórek bakterii z wektorami plazmidowymi kodującymi dany gen (np. odnalezienie komórek zawierających plazmidy kodujące insulinę) poprzez dodanie sondy do hodowli bakterii

2. metoda in vitro techniką PCR

• rozdzielenie nici danego fragmentu DNA w podwyższonej temperaturze (95°C)

• obniżenie temperatury i dołączenie sztucznych starterów (45-60°C)

• dołączenie odpornej na wysoką temperaturę polimerazy DNA, która replikuje każdą z nici (72°C)

5. Biblioteka genomowa to przechowywanie całego genomu danego gatunku pociętego na fragmenty, włączonego do wektora i wielokrotnie sklonowanego np. gatunki zagrożone wyginięciem.

Biblioteka genowa to przechowywanie różnych sekwencji DNA danego gatunku pociętych na fragmenty, włączonych do wektora i wielokrotnie sklonowanych.

6. Problemy w namnażaniu bakterii

• obecność intronów (w komórce bakteryjnej brak mechanizmów wycinających introny), stąd stosuje się cDNA

• różne mechanizmy obróbki potranslacyjnej niektórych białek, stąd stosuje się komórki drożdżowe lub komórki ssaków

• niekiedy dołączanie niechcianego fragmentu kodującego jakieś białko przez komórkę gospodarza do wprowadzonego genu, stąd musi zostać odcięty

7. Organizmy transgeniczne to organizmy (m.in. rośliny), które zawierają w swoim genomie geny innego organizmu. Uzyskiwane są w celu np. rozprowadzenia szczepionek w krajach ubogich (np. prowadzi się badania nad sałatą zawierającą szczepionkę przeciwko żółtaczce zakaźnej).

8. Organizmy modyfikowane genetycznie (GMO) to organizmy, które powstały w wyniku inżynierii genetycznej.

1. wady:

• obawa ekologów przed wyparciem przez GMO naturalnej roślinności

• obawa konsumentów przed żywnością zawierającą obce geny (nieuzasadniona, bo od czasu pojawienia się organizmów cudzożywnych spożywanie komórek innych organizmów było normą, a w genomie ludzkim nie pozostawiło to żadnych śladów)

2. zalety:

• umożliwiają oszczędności np. hodowla roślin opornych na owady

• umożliwiają ograniczenie stosowania środków chemicznych

• dostarczają np. witaminy A (złoty ryż wytwarza witaminę A, której niedobory istnieją w krajach Trzeciego Świata) lub aminokwasów egzogennych, mogą być jadalnymi szczepionkami

• zwiększone walory estetyczne

9. Etapy klonowania zwierząt metodą transplantacji jąder:

1. usunięcie jądra niezapłodnionej komórki jajowej

2. wprowadzenie do niezapłodnionej komórki jajowej jądra komórkowego komórki somatycznej

3. rozwój zarodka

Mimo licznych prób klonowania zwierząt tylko kilka zakończyło się sukcesem (klonowanie ma ok. 1% skuteczności). Pierwszym otrzymanym klonem była owca Dolly. Klonowanie zwierząt zwykle ma jakiś cel: krowy, owce i kozy klonuje się w celu pozyskiwania mleka, świnie w celu uzyskania w przyszłości organów do przeszczepu, konie w celach sportowych i hodowlanych, myszy i szczury w celach badań naukowych.

Wśród sklonowanych zwierząt wiele z nich miało wady genetyczne, inne rodziły się martwe, miały zaburzenia piętna genomowego, owca Dolly miała skrócone telomery, myszy normalne telomery, a cielaki dłuższe telomery.

10. Rodzaje klonowania człowieka:

1. klonowanie reprodukcyjne

2. klonowanie terapeutyczne

11. Etapy terapii genowej:

1. włączenie prawidłowych genów do wektora - retrowirusa

2. wprowadzenie zmienionego wektora do nieprawidłowej komórki

3. wektor za pomocą odwrotnej transkryptazy przepisuje informację genetyczną z RNA na jednoniciowy DNA, a następnie tworzy dwuniciowy DNA (odwrotna transkrypcja) - włączony do wektora prawidłowy gen zostaje włączony do genomu nieprawidłowej komórki

4. nieprawidłowa komórka zostaje naprawiona

12. Etapy tworzenia szczepionek DNA:

1. włączenie genów kodujących białka organizmu patogennego do wektora - retrowirusa

2. wprowadzenie zmienionego wektora do komórek pacjenta

3. wektor za pomocą odwrotnej transkryptazy przepisuje informację genetyczną z RNA na jednoniciowy DNA, a następnie tworzy dwuniciowy DNA (odwrotna transkrypcja) - włączony do wektora gen zostaje włączony do genomu komórki pacjenta

4. ekspresja białek organizmu patogennego powoduje reakcję immunologiczną

13. Etapy ukierunkowanej mutagenezy:

1. klonowanie genu

2. wprowadzenie zmian do sklonowanego genu

3. wprowadzenie zmienionego, sklonowanego genu do wyjściowego organizmu

4. obserwowanie jakie zmiany (pozytywne, negatywne) wywoła zmieniony gen

14. Wnioski z procesu ukierunkowanej mutagenezy:

• różna liczba genów w różnych chromosomach

• obecność pseudogenów

15. Etapy sekwencjonowania DNA:

1. cięcie DNA na małe fragmenty

2. odczytanie sekwencji nukleotydów w każdym z małych fragmentów DNA przez sekwentatory DNA

3. zestawienie odczytanych sekwencji małych fragmentów w odpowiedniej kolejności

16. Zastosowanie inżynierii genetycznej

• w sądownictwie (badanie ojcostwa, identyfikacja ofiary, identyfikacja przestępcy)

• w archeologii (badanie szczątków organizmów na podstawie ocalałego DNA)

• w taksonomii (badanie pokrewieństwa między organizmami na podstawie DNA)

• w farmaceutyce (produkcja leków)

• w medycynie (terapia genowa, klonowanie reprodukcyjne i terapeutyczne)

• w rolnictwie (zwiększenie plonów, poprawa jakości plonów, dodanie właściwości leczniczych)

• w hodowli (poprawa jakości hodowli, dodanie właściwości leczniczych)

pojawienie się osobników bardziej żywotnych i bujnych spowodowane tym, że większość genów takiego osobnika jest heterozygotyczna, co maskuje niekorzystne allele recesywne np. skrzyżowano dwie kukurydze o genotypach AabbCC i aaBBcc, gdzie allele recesywne są niekorzystne, w wyniku krzyżówki otrzymano kukurydzę o genotypie AaBbCc, gdzie allele recesywne są maskowane przez allele dominujące

ułożenie nukleotydów w sekwencji palindronowej w jednej nici DNA jest takie same jak w drugiej nici DNA, lecz odczytywane od końca

inaczej genetyczny odcisk palca DNA; każdy człowiek ma odmienny profil genetyczny, stąd stosowany jest w kryminalistyce do ustalania napastnika pod zostawionym przez niego DNA, identyfikacji ofiary lub ustalania ojcostwa

krótki odcinek mRNA znakowany barwnikiem fluorescencyjnym lub izotopem promieniotwórczym i komplementarny do szukanego genu; sonda łączy się z szukanym genem

niewielka cząsteczka DNA, do której włącza się fragment DNA jakiegoś osobnika, a następnie wprowadza do danej komórki np. kolisty plazmid bakterii (tzw. wektor plazmidowy) lub bakteriofag

inaczej łańcuchowa reakcja polimerazy DNA

cząsteczka DNA utworzona na matrycy mRNA za pomocą odwrotnej transkryptazy

celem uzyskanie dziecka dla bezpłodnych par

celem uzyskanie komórek wczesnego stadium zarodka, które zdolne są do rozwoju w dowolnym kierunku i mogą służyć do uzyskania narządów lub tkanek do przeszczepu (każdy człowiek musiałby mieć własnego zarodka hodowanego w laboratorium)

mają sekwencję podobną do genów (obecność ogona poli-A, brak intronów, brak promotora stąd nie ulegają transkrypcji i należą do tzw. śmieciowego DNA), ale niczego nie kodują; powstają w wyniku odwrotnej transkrypcji danego genu i włączenia go do genomu np. u człowieka wiele genów kodujących receptory zapachów uległo degeneracji i stały się pseudogenami

1

5

---