Budowa enzymu

Enzym białko zbudowane zwykle z dwóch części. Mogą to być białka proste(pepsyna) lub złożone, gdzie z częścią białkową łączą się grupa prostetyczna lub koenzym. Enzymy są biokatalizatorami, które przyspieszają osiągnięcie stanu równowagi reakcji. Uczestniczą w przemianie substratu w produkt, same się nie zużywają podczas reakcji. Większość znanych dziś enzymów to białka globularne, część z nich wymaga współpracy z kofaktorami:

1 grupa prostetyczna- drobnocząsteczkowe zw org, mocno związane przez enzym. 2 koenzymy- uczestniczy w określaniu typu katalizowanej reakcji.

3 jony metali.

Centrum aktywne to miejsce w strukturze enzymu do którego przyłącza się substrat tworzą kompleks ES. W jego skład wchodzą:

1 AA odp za związanie substratu, określające swoistość substratową.

2 AAuczestniczące w katalizie tzw. Centra katalityczne określające swoistość reakcji. a) obejmuje niewielką część całkowitej objętości enzymu. B) jest trójwymiarową strukturą, którą często tworzą bardzo odległe sekwencyjne AA. - istnieją centra aktywne jakby przygotowane na przyjście danego substratu(lizozym, chymotrypsyna) - centra aktywne innych enzymów tworzą się w trakcie wiązania substratu(karboksypeptydaza A). c) stanowi zagłębienie w strukturze enzymu, dzięki czemu otoczenie wiązanego substr charakter hydrofobowy i jest mniej lub bardziej izolowany od wody. D) substrat wiązany jest poprzez wiele oddziaływań niekowalencyjnych, jak hydrofobowe, jonowe , wodorowe, van der waalsa, a swoistość wiązania substratu uzależniona jest od precyzyjnego ułożenia i dopasowania wielu atomów centrum aktyw i substratu.

cechy charakteryzujące enzymy jako katalizatory

a) sprawność katalityczna- zdolność przyspieszania rzędu 10⁶-10¹² razy b) swoistość - może być względem substratu, względem reakcji, lub substratu i reakcji c) działanie w łagodnych warunkach- niskie ciśnienie, temperatura (pokojowa) i zakres wartości pH (2-8, większość aktywna w pH 7) d) aktywność może ulegać regulacji- istnieje szereg enzymów, które zmieniają aktywność (zmiany jakościowe lub ilościowe)

modele tworzenia kompleksu ES Model zamka i klucza .Miejsce aktyw enzi substr posiadają specyficzne, komplementarne względem siebie kształty. Enz łączy się z subst tworząc nietrwały kompleks ES. Model ten tłumaczy specyficzność enz względem subs, jednak nie wyjaśnia w jaki sposób stabilizowany jest stan przejściowy.

Model indukowanego dopasowania enz są strukturami giętkimi w związku z czym możliwe jest modyfikowanie kształtu enzymu w wyniku interakcji z substratem. Łańcuchy boczne AA tworzące miejsce aktywne enz mogą przemieszczać się w jego obrębie dopasowując się do kształtu specyficznego substratu w przeciwieństwie do modelu klucz i zamek.

oczyszczanie enzymów

Izolowanie i oczyszczanie należy prowadzić w taki sposób, aby zapobiegać utracie zdolności katalitycznych: w buforach o pH ok. 7, w niskie temp., stosując wodę podwójnie destylowaną, środki hamujące metale ciężkie, a w konieczności także związki tiolowe, zachowując wyjątkową czystość na miejscu pracy.

Dla każdego enzymu powinno się zastosować indywidualny schemat oczyszczania wykorzystując jego właściwości fizykochem. 1,przeprowadzanie do roztworu pierwszym krokiem przy oczyszczaniu białek jest przeprowadzenie ich do roztworu, chyba że izolujemy z innego płynnego źródła. Stosuje się w tym celu techniki doprowadzające do zniszczenia ścian, błon komórkowych, struktury stałych komórek takie jak: a)degradacja ścian przez lizozym, b) rozrywanie komórek pod wpływem ciśnienia osmotycznego, c) sonifikację (pękanie komórek pod wpływem wibracji wywołanych ultradźwiękami) d) homogenizację e) rozcieranie z piaskiem lub perełkami szklanymi f) inne metody mechaniczne.

Enz rozpuszczalne łatwo poddają się procesowi ekstrakcji wodą lub rozcieńczonymi roztw soli i buforami. Natomiast związane z błonami wymagają użycia roztw detergentów lub rozpuszczalników organicznych, które rozpuszczają lipidy. 2.WSTĘPNE OCZYSZCZANIE a) frakcjonowanie roztworami soli b) ekstrakcja rozpuszczalnikami organicznymi. Metody te opierają się na odciągnięciu wody z roztworów koloidalnych jakie tworzą białka (w tym enzymy). Ponieważ białka są cząsteczkami zawierającymi różne ilości grup kwasowych i zasadowych, ich rozpuszczalność zależy od stężenia rozp soli, polarności, pH, temp. Dlatego pewne białka wypadają z roztworów, podczas gdy inne w tych samych warunkach nadal tworzą roztwór koloidalny. Poprzez odp dobór st soli odwadniających można przeprowadzić ich stopniowe wytrącanie. Mieszające się z wodą rozpuszczalniki organiczne takie jak etanol czy aceton obniżają zdolność działania wody jako rozpuszczalnika, dzięki czemu bardzo dobrze strącają białka. Mieszane z wodą w różnych proporcjach pozwalają na wybiórcze strącanie białek. Proces ten należy przeprowadzić w temp. 0°C lub poniżej, ponieważ w wyższych temp. Nastąpi denaturacja. Otrzymane osady białkowe oddzielane są metodami filtracji lub wirowania. Następnie są rozpuszczane, a w przypadku wykorzystania procesów wysalania mogą być poddawane dializie. 3.OCZYSZCZANIE

1 chromatografia (wymiany jonowej, adsorpcyjna, podziałowa, sączenie molekularne, afinitywna),

2 elektroforeza, (bibułową, elektroforezę żelową, elektroforezę swobodn)

3 ultrawirowanie,

4 krystalizacja,

Aktywność katalityczna enzymów jednostki

Jednostka U każdego enzymu jest taka jego ilość która katalizuje przemianę 1µmola substratu w ciągu 1 min. W temp.30°C i w optymalnych warunkach. Ze względu na rząd różnic między aktywnością enzymów stosuje się przedrostki metryczne. Obecnie Międzynarodowa Unia Biochemiczna zaleca stosowanie nowej jednostki 1 tatal. Odpowiada ona aktyw enzymu, przy której jest on zdolny przekształcić 1 mol substratu w produkt w czasie 1s w temp 30°C i pozostałych warunkach optymalnych. 1 katal = 6*10⁷ U. 1U = 16,67nKat

Klasyfikacja EC

Numer EC tworzy kolejno liczby oddzielone kropkami oznaczające: 1 klasę ustaloną wg. typu reakcji. 2 podklasę wg. typu substratu. 3 podklasę wg. centrum aktywnego. 4 numer wynikający z kolejności historycznej przypisania do danej grupy.

Pepsyna EC 3.4.23.1 tj. 3-hydrolaza, 4-proteaza,

23-proteaza aspartylowa,

21- proteaza serynowa,

22- proteaza cyst(tiolowa),

immobilizacja enzymów

Polega na nieuruchamianiu go na stałym podłożu, przez co uzyskuje on właściwości fizyczne nośnika. Ze względu na typ immobilizacji można wyróżnić: a) unieruchomienie we wnętrzu nośnika (pułapkowanie) b) osadzanie na powierzchni nośnika, które może zachodzić na zasadzie oddziaływań niekowalencyjnych lub z utworzeniem wiązań kowalencyjnych. Korzyści : zatrzymanie biokatalizatora na nośniku, wyższe stężenie biokatalizatora, możliwość kontroli mikrośrodowiska, wyższa stabilność struktury białka, wyższa odporność na warunki środowiska, możliwość wielokrotnego użycia biokatalizatora, łatwość oddzielenia go od mieszaniny reakcyjnej po zakończeniu procesu, ograniczenie inhibicji enz. Ograniczenie wynikające immobilizacji: utrata aktyw enz, możliwe utrudnienie w dopływie substratu i odpływie produktu, ograniczony czas życia układu w wyniku obniżenia aktyw biokatalizatora i zmiany złoża podczas użytkowania.

cele enz modyfikacji skł żyw: poprawa wartości odżywczych żywności, wytwarzanie bioaktywnych peptydów i oligosacharydów z małocennych surowców, wytwarzanie specyficznych enz, modyfikacja wł reologicznych i restrukturyzacja żyw, poprawa smaku i zapachu żyw i barwy, modyfikacja wł funkcjonalnych surowców pomocniczych i dod do żywności, enzymatyczna degradacja subst antyżywieniowych, przedłużanie trwałości żyw

enz hydroliza białek żyw

Jedną z najważniejszych modyfikacji żywności jest przekształcanie białek, a najważniejsze znaczenie ma hydroliza białek. Bezpośrednio wykorzystywana jest do profilowania właściwości białek np. rozpuszczalności, hydrofobowości, zdolności pianotwórczych, produkcji hydrolizatów białkowych. Pośrednio wykorzystywana jest jako wstępny proces przygotowujący białka do dalszej modyfikacji np. sieciowania. W zależności od stopnia hydrolizy wyróżniamy: a) hydrolizę łagodną w której stopień hydrolizy osiąga zwykle kilka do kilkunastu procent. b) hydroliza pełna jaką można uzyskać przy działaniu danego enzymu w optymalnych warunkach. Hydroliza łagodna stosowana jest w celu : a) poprawy własności funkcjonalnych białek- zwiększenie rozpuszczalności, obniżenie lepkości, zmianę wł żelujących, wzrost aktyw powierzchniowej, b) obniżenie alergenności c) poprawa smaku i zapachu. Hydroliza łagodna zachodzi głównie pod wpływem endoproteaz działających na powierzchni cząsteczek białka, często odcinające jedynie boczne łańcuchy. Hydroliza pełna stosowana jest do wytwarzania preparatów aa i preparatów białkowych. zachodzi zarówno pod wpływem endoproteaz i egzopeptydaz przy czym druga gr ma duże znaczenie dla usunięcia gorzkości wynikającej z obecności peptydów hydrofobowych. Metody hydrolizy : a) chemiczna (kwasowa, alkaliczna),b) enzymatyczna

enzymatyczne sieciowanie białek, transglutaminaza

Głownym enz wykorzystywanym do sieciowania białek w tech żyw jest TGaza. Sieciowanie jest to tworzenie się wiązań kowalencyjnych między cząsteczkami. Proces sieciowania zachodzi zwykle w dość długim czasie, dlatego konieczne jest zapewnienie warunków uniemożliwiających wzrost bakterii, tj. niskiej temp. Lub na tyle wysokie by zahamować wzrost bakterii psychrofilnych. Należy przy tym uwzględnić wł enz oraz temp. Denaturacji białek surowca zwłaszcza miozyny. Rodzaje transglutaminazy : t. zależna stabilna w 40°C występuje w tkankach i płynach ustrojowych zwierząt, roślin i mikroorganizmów, to czynnik XIII krzepliwości krwi, najlepszym źródłem jest wątroba świnki morskiej Pi 4,5. T. niezależna od jonów wapnia pochodzenia mikrob, opt aktyw 50 °C, pH 6, stabilne przy pH 5-7, zawiera cyst. W centrum aktywnym, Pi 8,9. TG jest acylotransferazą, katalizuje reakcje połączenia reszty aminowej glutaminy w białku z grupą E-aminową lizyny w białku lub peptydzie. Wiązania mogą łączyć dwa różne białka lub peptydy, albo mogą powstać w obrębie jednej cząsteczki. W zależności o ilości powstałych wiązań, w efekcie następują większe lub mniejsze zmiany właściwości reologicznych surowca. Produktem ubocznym reakcji jest amoniak, który wykorzystuje się jako wskaźnik procesu sieciowania białek. TGaza na skutek sieciowania układu powoduje wzrost twardości, gumowatości, zżuwalności, poprawia elastyczność, nie zmienia elastyczności. Gdy siatka wytworzona dzięki TG jest luźna wodochłonność układu wzrasta. Silne sieciowanie prowadzące do synerezy powoduje wysychanie układu. TG może być stosowana do teksturowania odkostnionego mięsa ryb, do zamienników tłuszczowych, jako dodatek do deserów, kremów, jako polepszacz do pieczywa.

reakcja plasteinowa wykorzystywanie: wytwarzanie peptydów aktyw biol, usuwanie niepożądanych aa z żywności dietetycznej, wbudowywanie aminokwasów egzogenicznych w białka, usuwanie gorzkiego smaku z koncentratów białkowych oraz niepożądanych związków zapachowych z surowców białkowych, teksturowanie mięsa odkostnionego mechanicznie. Białko →hydroliza→oligopeptydy→zagęszczanie oligopeptydów poprzez usunięcie wody→zmiana pH→dodanie enzymu proteolitycznego→nierozpuszczalny żel PLASTEINA. Początkowo sądzono że plasteliny powstają gł na skutek resyntezy- powst wiązania peptydowe. Obecnie stwierdzono jednak , że następuje wiązanie aa hydrofobowych w słabe ale liczne połączenia zwane agregatami, które wyłapują hydrofobowe komórki aa. Prawdopodobnie zachodzi transpeptydacja, która formuje nowe wiązania kosztem starych, powoduje przestawienie wiązań, a nie tworzenie nowych. Jeśli w hydrolizacie białkowym jest dużo aa hydrofobowych, to bardzo łatwo powstaje plasteina. Jeśli w hydrolizacie jest dużo aa niehydrofobowych Ser, Ala, Glu, Asp, to nie powstaje plasteina.

enzymy lipolityczne należą lipazy i fosfolipazy A i D. lipazy są szeroko rozpowszechnione w przyrodzie, występują w nasionach i organach wegetatywnych wielu roślin, w niektórych mikroorganizmach oraz organizmach ludzi i zwierząt. Hydrolizują one wiązania estrowe wyst pomiędzy glicerolem i kw tł w obrębie różnej grupy lipidów. Lipazy katalizują hydrolizę nierozpuszczalnych w wodzie triacylogliceroli reakcja ta zachodzi na granicy faz, a produktami są kwasy tłuszczowe, diacyloglicerole, monoacyloglicerole, glicerol. Lipazy charakteryzują się większą aktywnością w stosunku do substratów nierozpuszczalnych w wodzie niż do rozpuszczalnych estrów, co jest cechą odróżniającą lipazy od esteraz. Triacyloglicerole- diacyloglicerole + kw.tł. diacyloglicerole- monoacyloglicerole + kw. tł. Monoacyloglicerole- glicerol + kw. tł. Hydroliza TAG jest reakcją odwracalną, kierunek reakcji jest zależny od środowiska, przy czym nadmiar wody wywołuje hydrolizę, natomiast niska zawartość wody wywołuje estryfikacje glicerolu- reakcja odwrotna. Szybkość hydrolizy TAG wzrasta z liczbą reszt kwasowych tł. Długość łańcucha oraz stopień nienasycenia kw. tł. Reakcja katalizowana przez lipazy można prowadzić w rozpuszczalnikach organicznych oraz roztworach buforowych, możliwa jest wtedy kontrola zaw wody (współczynnik aktywności wody)

Działanie lipaz w zależności od środowiska

Typy reakcji

- hydroliza -środowisko wodne , z nadmiarem wody

-estryfikacja - środowisko z małym udziałem wody lub środowisko bezwodne

-transesrtyfikacji - wymiana kw.tł w TAG

- acydoliza - gr. Acylowe pochodzą od wolnych kw

- interestyfikacja - wymiana grup acylowych pomiędzy estrami

- alkoholiza - reakcja pomiędzy alkoholem i estrem w wyniku której powstaje nowy alkohol i ester

Lipazy roślinne ph ok 5 temp. 35-37

Lipazy mikrobiologiczne ph 7-9 temp. 30-40

Lipazy zwierzęce ph 7-8 temp 35-37

Najczęściej stosowane temp w przemyśle i laboratorium (mikrobiologiczne lipazy) 60-80 C

sTAG - cele , zastosowanie, metody

Strukturyzowane triacyloglicerole to TAG zawierające określona kompozycje i położenie kw.tł. Zestryfikowanych z glicerolem. Mogą one być otrzymywane met enz i chem. Zastos lipaz charakt sie stereoselektywnością pozycyjną oraz selektywnością w stosunku do kw.tl. Umożliwia uzyskanie czystych sTAG. Metodami chemi otrzymuje sie tylko mieszaninę TAG. Zastos sTAG: - kliniczne i przemysł kosmetyczny - prod. Niskokal składników cukierków, batonów itp.

Synteza sTAG jednodstopniowa polega na interestryfikacji jest zbliżona do metody chemicznej. Problemem jest trudność w oddzieleniu sTAG od pozostałych tracylogliceroli. Wydajność acydolizy TAG z kw.tł. Jest większa , gdyż powstaje mniej produktów ubocznych.

W metodzie dwustopniowej czyste triacyloglicerole lub tłuszcze naturalne poddawane są najpierw alkoholizie z użyciem sn-1,3-regioselektywnej lipazy w celu uzyskania czystych 2-monoacylo-sn-gliceroli (2-MAG) , które następnie należy prosta, szybka metoda wydzielić z mieszaniny np. Za pomocą krystalizacji. Otrzymane czyste 2-MAG są następnie estryfikowane kw.tł. Celem uzyskania sTAG o pożądanych właściwościach. Zastosowanie alkoholizy zamiast hydrolizy zapobiega migracji grup acylowych z pozycji Sn-1 lub Sn-3. Istotny jest tez dobór nośnika do immobilizacji lipaz, gdyz niektóre materiały mogą wpływać na migrację grup acylowych

Enzymatyczna modyfikacja węglowodanów, cele i zastosowanie

Obejmuje hydrolizę i syntezę sacharydów, duże znaczenia amylaz w technologii zbóż , produkcja pieczywa i piwa. Enzymy pochodzące z drożdży aktywne w zakresie pH6-7 wykorzystywane w przetwórstwie mleka i słodkiej serwatki

Hydroliza laktozy i powstanie oligosacharydów - Laktoza - (beta-D-galaktozydaza )-mieszanina galakto oligosacharydów

Hydroliza skrobi

Obejmuje - upłynnianie - alfa amylaza termo stabilna , powstają dekstryny, głównie maltodekstryny

-scukrzanie - na skutek glukoamylazy często łącznie z izoamylaza, pullulanaza i alfa amylaza

-inwersja

wykorzystywane sa enzymy - alfa, beta amylazy , glukoamylazy, pullulanaza . Po degradacji węglowodanów strukturalnych stosowane są enzymy macerujace - celulazy, hemicelulazy i pektynozy

Amylazy

Endoamylaza - alfaamylaza rozcina przypadkowo wew wiazania alfa 1,4 glikozydowe amylozy i amylopektyny, rozkłada skrobie do alfa dekstryn o malych czasteczkach i niewielka ilość maltozy w skutek czego spada lepkość produktów skrobiowych

Egzoamylazy - rozcinają od końca lańcucha - beta amylaza - maltohydrolaza alfa 1,4 - glukanu , która rozkłada co drugie wiązanie alfa 1,4 glikozydowe , powstaja dekstyny o duzych czasteczkach oraz znaczna ilosc maltozy , nie hydrolizuja wiązań alfa 1,6 glikozydowe

Amyloglukozydazy i glukoamylazy - rozkładaja wiązania alfa 1,4 i alfa 1,6 glikozydowe, glukoamylaza - glukohydrolaza alfa 1,4 glukanu rozkładaja długołancuchowe polisacharydy do glukozy od nieredukającego końca cząsteczki

Enzymy rozkładające wyłacznie wiązania alfa 1,6 glikozydowe

- izoamylaza - glikogen-6 -gluanohydrolaza - uzsuwa rozgałezienia w glikogenie i dekstrynach, nie działa na pullulan

• Pullulanaza typu I - rozklada najefektywniej wiązania w pullulanie mniej w amylopektynie , nie działa na glikogen

Srod działania - alfa amylaza 4,7 - 5 w temp 51-66 , beta - bardziej kwaśne srodowisko niż alfa temp. 48-51 . Wszystkie alfa amylazy zbożowe są aktywne do 70 st c , powyzej tej tem ulegaja dezaktywacji

B-galaktozydaza

Enzym katalizujący reakcję hydrolizy wiązań D-glikozydowych w beta-D-galaktozydach. Najbardziej znanym galaktozydem jest laktoza wyst w mleku. Katalizowana enzym reakcję hydrolizy wiązania bata 1,4 glikozydowego w laktozie prowadzi do powstania czasteczek D-glukozy i D-galaktozy. Niektóre beta-D-galaktozydazy wykazuja równiez zdolność syntezy wiazań glikozydowych, ktora prowadzi do powstania łańcucha oligosachrydowego. Działanie ezymu obejmuje 3 etapy, a ostani z nich decyduje czy zachodzi reakcja hydrolizy czy transglikozydacji

enzym+laktoza powstaje enzym-laktoza I

eznzym- laktoza powstaje galaktozylo-enzym glukoza II

galaktozyl-enzym+akceptor powstaje galaktozyloakceptor + enzym III

Galaktooligosacharydy

Węgowodan złożony z czast. D-glukozy i D-galaktozy połaczony wiązaniami glikozydowymi. Nie ulega hydrolizie pod wpływem działania ludzkich enzymów trawiennych. Substrat reakcji fermentacji przez bakterie zasiedlające jelito grube. Zaleta GOS zdolność stymulowania rozwoju i aktywności szczepów Bafidobacterium i Lactobacilius okrężnicy, hamuje rozwój bakterii chorobotwórczych. Odbudowa mikroflory po kuracji antybiotykowej, obnizenie cholesterolu we krwi, nadcisnienie , zmiejsza ryzyko nowotworów jelita grubego .Dodatek do jogurtów, słodyczy i napojów, duża zdolność wiązania wody , odporny na wysokie temp.

---