Ćwiczenia 1 10.10.2011r.

1. Mikrobiologia drobnoustrojów.

2. Techniki mikroskopowania.

3. Badanie drobnoustrojów.

Charakterystyka drobnoustrojów pro- i eukariotycznych.

	Prokaryota	Eukaryota
Materiał genetyczny	Koliste DNA W nukleoidzie i plazmidach	Kompleksy DNA i białek zasadowych W jądrze komórkowym, mitochondrium
Mitochondria i RE	Brak	występują
Rybosomy	70S	80S
Ściana komórkowa	Sztywna z warstwą mureiny	Jedynie u grzybów (chityna, celuloza,glikany)
Rozmnażanie	Bezpłciowe przez prosty podział poprzeczny	W większości płciowe, możliwe bezpłciowe

Budowa komórki bakteryjnej

1. Ściana komórkowa – wszystkie bakterie (z małymi wyjątkami) zawierają w ŚK peptydoglikan (mureinę).

2. Błona cytoplazmatyczna – przez nią komórka komunikuje się ze środowiskiem. Pełni funkcje:

   • Transport elektronów

   • Synteza i transport prekursorów peptydoglikanu, kwasów tejchojowych i składników błony zewnętrznej

   • Wydzielanie zewnątrzkomórkowych i periplazmatycznych enzymów i toksyn

   • Regulacja segregacji chromosomalnego i plazmidowego DNA do komórek potomnych przy podziale komórki

   • Wytwarzanie układów tranportowych, zdolnych do 1000-krotnego zagęszczenia substancji odżywczych

   • Przenoszenie receptorów i innych białek układu chemotaktycznego

Zbudowana jest w 70% z białka i w 30% z fosfolipidów oraz niewielkiej ilości węglowodanów.

1. Cytoplazma .

2. Nukleoid = chromosom bakteryjny = materiał chromosomowy. Komórka bakteryjna jest haploidem, tzn. występuje tylko jeden chromosom. DNA nukleoidu ma postać podwójnej spirali, złożonej z dwóch komplementarnych łańcuchów polinukleotydowych.

Nukleoid jest przyczepiony do określonego miejsca błony cytoplazmatycznej – mezosomu – lub do ściany komórkowej.

1. Plazmidy – koliste cząsteczki DNA, które w cytoplazmie ulegają autonomicznej replikacji. Determinują cechy, które zwiększają możliwość przeżycia komórek bakteryjnych w określonych warunkach środowiskowych.

2. Rybosomy – centrum, w którym odbywa się synteza białek.

3. Mezosomy – utworzone przez wpuklenia błony cytoplazmatycznej do wnętrza komórki. Pełnią różne funkcje, np.

   • Mezosomy ścienne są miejscem przyczepiania nukleoidu do błony

4. Substancje zapasowe .

5. Rzęski – do poruszania się.

   • Długie, puste w środku, spiralne fi lamenty

   • Wytwarzanie rzęsek jest stałą cechą gatunkową

   • Mogą być tracone w wyniku mutacji lub też komórka może ich nie wytwarzać w nieodpowiednich warunkach hodowli

6. Fimbrie (pili):

   • Płciowe – „mostek koniugacyjny” – wymiana materiału genetycznego

   • Zwykłe – adhezja – przyczepianie się do powierzchni

7. Otoczki, śluz (nie wszystkie bakterie posiadają).

   • Wiele bakterii wydziela substancje o charakterze polimerów, które przylegają do zewnętrznej powierzchni ściany komórkowej. Jeśli substancje te otaczając komórkę lub pary komórek tworzą wyraźną, grubą warstwę, nazywane są otoczką.

   • Otoczki z reguły są dobrym antygenem, indukują wytwarzanie swoistych przeciwciał , które uczestniczą w niszczeniu bakterii.

   • Otoczki bakteryjne chronią komórkę przed wysychaniem, zwiększają chorobotwórczość bakterii, uczestniczą w adhezji, są nieprzepuszczalne dla niektórych antybiotyków.

Lipopolisacharyd -  endotoksyną stanowiącą amfifilowy integralny składnik zewnętrznej błony komórkowej osłony bakterii Gram-ujemnych icyjanobakterii, gdzie formuje on złożone struktury z białkami i fosfolipidami. Spełnia on liczne funkcje o podstawowym znaczeniu dla procesów życiowych tych mikroorganizmów, będąc jednocześnie jednym z czynników ich chorobotwórczości.

ŚCIANA BAKTERII
GRAM +
Gruba warstwa mureiny W ŚK występują kwasy tejchojowe – rybitolowy i glicerolowy (lipotejchojowy) Kwas lipotejchojoy związany jest z glikolipidami błony Mogą występować białka, związane kowalencyjnie lub niekowalencyjnie

PEPTYDOGLIKAN = MUREINA

Polimer o charakterze polisacharydowym,

Budowa:

• Cząsteczka peptydoglikanu jest duża, zbudowana z długich łańcuchów polisacharydowych, które są połączone w sieci za pomocą mostków peptydowych.

• Każdy łańcuch polisacharydowy zbudowany jest z dwucukrów N-acetyloglukozaminy i kwasu N-acetylomuraminowego.

• Każda cząsteczka kwasu N-acetylomuraminowego jest zazwyczaj połączona z tetra peptydem, który wiąże kwas N-acetylomuraminowy jednego łańcucha glikanu z tetra peptydem kwasu N-acetylomuraminowego leżącego obok łańcucha.

• Skład tetra peptydu może być różny, jednak istnieją pewne cechy wspólne:

  • Peptydy łączą się zawsze za pomocą tego samego aminokwasu, którym jest albo glicyna albo L-alanina

  • Drugim aminokwasem jest często kwas D-glutaminowy

  • Trzecim aminokwasem jest :

    • Lizyna – u bakterii Gram+

    • Kwas dwuaminopimelinowy – u bakterii Gram-

    • Ornityna – u kilku gatunków

  • Czwartym aminokwasem jest zawsze D-alanina

Protoplasty – komórki bakterii Gram (+) pozbawione mureiny .

• Bakterie Gram (+) można całkowicie pozbawić warstwy peptydoglikanowej przez działanie antybiotykami beta-laktamowymi, cykloseryną, wankomycyną, fosfomucyną, bacytracyną oraz przez działanie lizozymu.

Sferoplasty – komórki bakterii Gram(-) pozbawione mureiny.

Hodowle protoplastów i sferoplastów utrzymywane in vitro i in vivo noszą nazwę L postaci bakterii. L postacie bakterii hodowane na podłożach stałych tworzą małe kolonie, wrastające w podłoże, przybierające nieregularny kształt „sadzonego jajka”.

PRZETRWALNIKI

Przetrwalniki pozwalają bakterią przetrwać niekorzystne dla nich warunki życia, m.in. brak składników odżywczych w środowisku i brak wody. Bakterie w formie przetrwalników mogą przeżywać w „uśpieniu” nawet setki lat.

Proces tworzenia się w komórce bakteryjnej przetrwalników nosi nazwę sporulacji. Do zasadniczych zmian w trakcie tego procesu należą : zagęszczenie cytoplazmy wokół nukleoidu, tworzenie się błony cytoplazmatycznej i warstwy peptydoglikanowej, wielu osłon, które ściśle otaczają tworzący się przetrwalnik. W przetrwalniku prawie ustaje proces metaboliczny, co jest określane jako „pauza metaboliczna”.

Przetrwalnik jest oporny na różne czynniki, które są szkodliwe dla komórki wegetatywnej, takie jak : brak wody, brak substancji odżywczych, wysoka temperatura, promienie UV, promienie X, zmiany pH i wiele innych.

Przetrwalniki przeniesione do odpowiednich warunków mogą kiełkować; proces ten nosi nazwę germinacji. Końcowym efektem germinacji jest powstanie komórki wegetatywnej, identycznej z komórką macierzystą.

BADANIE MIKROBIOLOGICZNE

1. Metody bezpośrednie:

   1. Mikroskopowa

   2. Hodowla

   3. Wykrywanie antygenów metodami serologicznymi

   4. Wykorzystywanie DNA lub RNA (metody biologii molekularnej)

2. Metody pośrednie:

   1. Określenie poziomu przeciwciał w surowicy

   2. Próby biologiczne na zwierzętach

TYPY MIKROSKOPÓW – TECHNIKI MIKROSKOPOWANIA

Budowa mikroskopu optycznego

1. Śruba makro – złapanie obrazu

2. Śruba mikro – złapanie ostrości

3. Obiektyw – kilka soczewek zlepionych balsamem kanadyjskim

W mikrobiologi używa się powiększenia x100 (immersyjne), preparaty z grzybów x40.

Mikroskop świetlny optyczny – składa się z układu optycznego (część oświetleniowa i powiększająca) i mechanicznego.

• Całkowite powiększenie obrazu ( pow.okulary x pow.obiektywu) – do 2500 razy

• Oglądane są zazwyczaj preparaty barwione

• Ocena – kształtu, ułożenia, wielkości, sposobu barwienia

• Przy zastosowaniu specjalnych technik barwienia- obecność rzęsek, otoczek, przetrwalników, ciał. Woluty nowych

• Możemy poznać do rodzaju, ale gatunku się nie da!

Ultramikroskop

• Oglądanie drobnoustrojów w tzw. Ciemnym polu widzenia (obiekt jasny)

• Zastosowanie w obserwacji mikroorganizmów w płynach ustrojowych np. Treponema pallidum (preparaty świeże i niebarwione)

Mikroskop ultrafioletowy

• Źródło światła – lampy kwarcowo-rtęciowe

• Większa rozdzielczość

• Obrazy rejestrowane na kliszy fotograficznej lub ekranie telewizyjnym

Mikroskop kontrastowo-fazowy

• Preparaty niebarwione, żywych, w kropli wody, w nie zabarwionych tkankach,

• Ocena ruchliwości i ilości niektórych bakterii, odróżnienie struktur komórkowych bez zabarwienia,

Mikroskop fluorescencyjny (luminescencyjny):

• Wykorzystuje zjawisko fluorescencji obiektów oświetlonych światłem UV

• Część optyczna – kryształ górski – przepuszcza promienie UV

• Zastosowanie : np. wykrywanie prątków w materiale zakaźnym, badania serologiczne (immunofluorescencja – wykazanie antygenów na powierzchni cząstek z użyciem fluorochromu koniugowanego z przeciwciałem)

Mikroskop elektronowy

• Zamiast promieni świetlnych – wiązka elektronów, która przechodząc przez pole magnetyczne ulega odchyleniu

• Przygotowanie preparatów – wykonanie bardzo cienkich skrawków materiału biologicznego za pomocą tzw. Ultramikrotomu

• Powiększenie do kilku mln razy

Kształt komórek bakteryjnych:

1. Kulisty-ziarenkowce:

   1. Pojedyncze komórki

   2. Pary (dwoinki) np. Streptococcus pneumonaiae (dwoinka zapalenia płuc)

   3. Łańcuszki, paciorki np. Streptococcus pyogenes (wywołuje m.in. anginę)

   4. Skupiska

      • Czworaczki (tetrady)

      • Pakiety sześciennie (sześcianki) np. Micrococcus spp.

      • Nieregularne zgrupowania np. Staphylococcus spp.

2. Cylindryczny :

   1. Pałeczki np. Escherichia spp., Salmonella spp. (pojedyncze, pary, skupiska)

   2. Laseczki np. Bacillus anthracis (wąglik), Clostridium spp. (tężec)

3. Spiralny :

   1. Przecinkowce np. Vibrio cholerae (cholera)

   2. Śrubowce np. Spirillum spp.

   3. Krętki np. Trepohema pallidum, Borrelia spp. (borelioza)

Kształt komórek grzybiczych

1. Condida spp. – Gram (+) (fioletowe), kształt owalny w formie wyjściowej, a w formie inwazyjnej gałązka z naroślami (maczugami)

1. Aspergillus spp

2. Cryptococcus spp. (kryptokokowi zapalenie opon mózgowych): -

   • Dotyczy osób z obniżoną odpornością (osoby chore na AIDS)

   • Tworzą bardzo grubą otoczkę mucynową

URZĘSIENIE (nie wszystkie bakterie wytwarzają rzęski)

Typy urzęsienia:

• Monotrychalne – jedna rzęska na biegunie

• Lofotrychalne – pęczek rzęsek na biegunie

• Ditrychalne – po jednej rzęsce na dwóch biegunach

• Perytrychalne – rzęski w około komórki

Barwienie preparatów

Cele :

• Aby uwidocznić drobnoustroje

• Ocena morfologii, anatomii drobnoustrojów i ich układu przestrzennego, sposobu barwienia,

Przygotowanie preparatu do barwienia:

1. Przygotowanie szkiełka (odtłuszczenie)

2. Nakładanie bakterii (wykonanie rozmazu na szkiełku podstawowym)

   • 1 kropla soli fizjologicznej (0,85% NaCl) + 1 kolonia bakteryjna – podłoże stałe (podłoże płynne – oczko ezy)

3. Wysuszenie rozmazu

4. Utrwalenie (3-krotne w płomieniu palnika)

Cele utrwalenia :

• Zabicie drobnoustrojów

• Przyklejenie drobnoustrojów do szkiełka

• Denaturacja białek – przygotowanie do barwienia

Możliwe jest również barwienie żywych bakterii (przyżyciowo, bez utrwalenia), ale ze względu na powolne wnikanie barwników stosowane jest bardzo rzadko.

TYPY PREPARATÓW:

• Świeże (przyżyciowe) i utrwalone

• Barwione i niebarwione

• Bezpośrednie – z materiału pobranego bezpośrednio od pacjenta – oprócz drobnoustrojów czy grzybów zobaczymy inne komórki (np. nabłonkowe, leukocyty)

• Pośrednie – z hodowli – poza bakteriami czy grzybami nie powinno być nic

Podział metod barwienia:

1. Negatywne - barwienie tła :

   • Preparaty nieutrwalone

   • Barwniki grubo dyspersyjne : nigrozyna, tusz chiński, czerwień Kongo,

   • Obserwujemy bezbarwne kształty drobnoustrojów

2. Pozytywne- barwienie drobnoustrojów:

   1. proste – 1 barwnik

   2. złożone – kilka barwników

3. negatywno – pozytywne – barwimy bakterie i tło:

• wykazanie obecności otoczek i przetrwalników

TYPY BARWIENIA:

1. PROSTE:

   1. Metoda Löfflera (błękit metylenowy ) – jednolite, niebieskie komórki

   2. Barwienie safraniną – jednolite czerwone komórki

   3. Barwienie fioletem krystalicznym – jednolite fioletowe komórki

   4. Negatywne – tło ciemne, nie zabarwione komórki

2. ZŁOŻONE:

   1. Metoda Burri-Ginsa – uwidocznienie otoczek – ciemne tło, bezbarwne otoczki, czerwone komórki bakterii

   2. Metoda Dornera – barwienie przetrwalników – ciemne tło, bezbarwne komórki, czerwone przetrwalniki

   3. Metoda Grama podział bakterii na Gram (+) fioletowe i Gram(-) czerwone

      • Fiolet krystaliczny płyn Lugolaodbarwiacz fuksyna zasadowa

   4. Metoda Neissera – barwienie ziaren metachromatycznych (Ernst-Babesa) – żółto-zielone komórki, granatowe ziarna metachromatyczne

   5. Metoda Waysona – barwienie preparatów bezpośrednich – komórki bakterii ciemno granatowe, inne (np. nabłonkowe) są niebieskie

   6. Metoda Wirtza-Conklina – barwienie przetrwalników – komórki czerwone, przetrwalniki zielone

   7. Metoda Ziehl-Neelsena – barwienie bakterii kwasoopornych (prątki) – czerwone , tło i bakterie niekwasooprne są niebieskie

   8. Metoda Tan-Tien-Hok – cel i efekt barwienia jak wyżej

   9. Metoda Kinyoun – cel jak wyżej – bakterie kwasooporne czerwone, tło i bakterie niekwasooporne są zielone