TWÓJ BIOTECHNOLOG https://www.facebook.com/twoj.biotechnolog

3216+3

,,Wszelkie odnośniki dotyczą podręcznika T.A. Browna „Gene cloning and DNA analysis” 6th edition, Wiley Blackwell, 2010

Na zielono odpowiedzi poprawne, na niebiesko niepewne.

1.Pirosekwencjonowanie

W mieszaninie reakcyjnej znajduje się matryca, polimeraza, sulfurylaza i nukleotydaza (oraz oczywiście bufor o odpowiedniej sile jonowej zawierający Mg²⁺). Dodaje się do niej kolejno deoksynukleotydy. Jeśli reakcja zajdzie (nukleotyd pasujący do matrycy zostanie włączony w syntezowaną nić DNA), to uwolniony pirofosforan rozkładany jest przez sulfurylazę – powstaje sygnał chemiluminescencyjny, który można odczytać na detektorze. Jeśli dodany nukleotyd nie pasuje, to jest on rozkładany przez nukleotydazę – nie powstaje pirofosforan – brak sygnału chemiluminescencyjnego.

Odpowiedzi:

- jednorazowo sekwencjonuje się odcinki DNA krótsze niż przy zastosowaniu metody Sangera

- ciąg identycznych zasad w matrycy daje sygnał o sile wprost proporcjonalnej do jego długości (np. po dodaniu dCTP sekwencja GGGGT da 4 razy silniejszy sygnał chemiluminescencyjny niż GTCAT)

Dygresja: daje duże możliwości automatyzacji – stosuje się równoległe pirosekwencjonowanie na dużą skalę, które przebiega następująco:

• sekwencjonowane DNA tnie się na kawałki 300-500pz,

• kawałki liguje się z adaptorami, z których jeden jest znakowany na końcu 5’ biotyną, po czym otrzymane cząsteczki denaturuje się

• przygotowane w ten sposób DNA łączy się z metalicznymi ziarnami pokrytymi streptawidyną – do 1 ziarna przyłącza się średnio 1 cząsteczka jednoniciowego DNA (schemat s. 172)

• Krople wody zawierające ziarna zawiesza się w oleju tworząc emulsję

• W uzyskanej emulsji przeprowadza się PCR ze starterami specyficznymi dla adaptorów przyłączonych do docelowych cząsteczek DNA

• Po PCR, kropelki wody z produktami przenosi się do mikrostudzienek na plastikowym pasku i w każdej z nich przeprowadza się pirosekwencjonowanie.

Uwagi:

- Jak każde sekwencjonowanie, pirosekwencjonowanie wymaga jednoniciowej matrycy

- Nie stosuje się tu dideoksynukleotydów!

2.Real time PCR

- pozwala na oznaczenie stężenia DNA w próbce – tak brzmiała jedna z proponowanych odpowiedzi, nie wiem czy była poprawna. Nie zaznaczyłem jej, ponieważ nie oznaczamy nim stężenia całego DNA (do tego służy pomiar A260), lecz stężenie konkretnego powielanego DNA (w wariancie, gdzie powiela się cDNA jest to istotne, bo za pomocą real-time PCR bada się poziom ekspresji danego genu – eksperyment standaryzuje się np. na ilośc RNA wziętego do reakcji).

[ Ja uważam, że jest poprawna . Cytat z Gene cloning “This relationship enables PCR to be used to quantify the number of DNA molecules present in an extract”, s.158]

- Jest tożsame z metodą wagową (qPCR) – Nieprawda, są to 2 różne techniki.

- Stosuje się związek wiążący się niekowalencyjnie do dwuniciowego DNA – prawda (barwnik fluorescencyjny – występuje ryzyko zawyżenia wyniku)

- Stosuje się sondę reporterową hybrydyzującą z produktem PCR (sonda wiąże się tylko z jednoniciowym DNA) – schemat s. 160.

- Real time PCR może służyć do oznaczenia stężenia RNA, jeśli na początku eksperymentu użyje się odwrotnej transkryptazy

3. Znamy sekwencję genu XYZ z Drosophila melanogaster. Służy on do skonstruowania sondy w celu zlokalizowania genu w bibliotece genomowego DNA człowieka (jakoś tak to szło). Jaka będzie temperatura hybrydyzacji sondy z docelowym DNA?

- niższa

- wyższa

- taka sama

- 98st.

- żadna z podanych

http://en.wikipedia.org/wiki/Hybridization_probe :
„Detection of sequences with moderate or high similarity depends on how stringent the hybridization conditions were applied — high stringency, such as high hybridization temperature and low salt in hybridization buffers, permits only hybridization between nucleic acid sequences that are highly similar, whereas low stringency, such as lower temperature and high salt, allows hybridization when the sequences are less similar.”

Można przypuszczać, że sekwencje tego samego genu będą się w miarę mocno różnić u człowieka i u muszki owocowej.

4.Co potrzeba do złączenia wektora linearnego o tępych końcach z produktem reakcji PCR prowadzonej za pomocą polimerazy Taq?

- dATP
- dTTP
-polimeraza Taq
-polimeraza Vent
- transferaza terminalna

Polimeraza Taq często dorzuca od siebie, niezależnie od matrycy, resztę A na końcu 3’ produktu PCR. W podręczniku na s. 156 opisana jest technika polegająca na dołączaniu reszt T do końca 3’ wektora o tępych końcach. Spowoduje to utworzenie lepkiego końca komplementarnego do produktu reakcji PCR.

Aby reakcja zaszła, potrzebne jest dTTP i polimeraza Taq. Nie jestem pewien, czy transferaza terminalna nie może być zastosowana zamiast wspomnianej polimerazy.

5. Który enzym restrykcyjny daje produkty najmniej wydajnie ulegające ligacji?

Ten, który generuje tępe końce ☺

6.Enzymy restrykcyjne, jeden tnie w miejscu podanym strzałką, dokładnie między jedną zasadą i drugą (wszystko podane ale nie pamiętam jakie to byty enzymy i zasady), drugi enzym tnie w miejscu podanym strzałką.

To pytanie kiedyś już było:

„11) Enzym restrykcyjny ClaI rozpoznaje sekwencje AT|CGAT i trawi wiązanie fosfodiestrowe pomiędzy resztami T i C. Enzym restrykcyjny TaqI rozpoznaje sekwencje T|CGA:

1. fragmenty powstałe po trawieniu enzymami są w części komplementarne

2. fragmenty powstałe po trawieniu enzymami są w całości komplementarne

3. ClaI i TaqI są izoschizomerami

4. dowolne fragmenty powstałe po trawieniu ClaI i TaqI mogą być ligowane i następnie trawione ClaI

5. dowolne fragmenty powstałe po trawieniu ClaI i TaqI mogą być ligowane i następnie trawione TaqI ”

ClaI i TaqI są izokaudomerami – rozpoznają inną sekwencję, ale generują takie same końce.

Izoschizomery rozpoznają tę samą sekwencję DNA, tnąc ją w taki sam lub inny sposób. Neoschizomery rozpoznają tę samą sekwencję DNA, tną ją w inny sposób.

7.Rysunek z wektorem YAC, zupełnie identycznym jak na s. 111 (Fig. 7.8)

- na podłożu minimalnym z TRP można wyselekcjonować sztuczny chromosom – uważam, że nie. YAC znane są z tego, że są mało stabilne, zatem żeby przetrwały klony drożdży zawierające poprawny rekombinowany YAC, konieczne jest podłoże minimalne bez tryptofanu (gen markerowy TRP1) oraz bez urydyny/uracylu (gen markerowy URA3).

- po wklonowaniu insertu inaktywacja SUP4 – prawda. Uwaga: po inaktywacji genu kolonie drożdży nie są czerwone, tylko białe (selekcja biało-czerwona).

- stosowane drożdże to mutanty podwójnie auksotroficzne

- od razu po trawieniu enzymami restrykcyjnymi można przystąpic do ligacji YAC z insertem – nieprawda, trzeba odrzucić tą krótszą sekwencję znajdującą się między miejscami BamHI (stabilizuje ona YAC w probówce przez utrzymanie go w formie kolistej).

8.Indukowane wyciszenie genow wirusem:

- degraduje mRNA (transkrypt)

- wykorzystuje naturalne systemy obronne rośliny

- wirus gemini do określania funkcji genów roślinnych

9.Fagi λ

- po wyjściu z komórek — liza

- może wejść 53 kD

- większość wywodzących się od nich wektorów ma enzymy do wbudowania i wycięcia z genomu bakteryjnego

- ??

10. EMSA, jakie odczynniki potrzebne gdzie jest to w ksiazce?

- ATP z 32P w pozycji y

- dATP z 32P a

- dGTP

- [32 P a ATP]

Tego nie ma w podręczniku to był slajd dodatkowy Ozzi mówił:) Jeśli dobrze pamiętam to mamy tam najpierw dsDNA, z miejscami restrykcyjnymi BamHI, SalI, BamHI, najpierw wycinamy fragmient tego ds DNA z pomocą BamHI, potem znakujemy radioaktywnie ale przed tym musimy usunąc fosforylowane końce 5’, za pomocą fosfatazy alkaicznej, potem radioakywne fosforany dodajemy za pomocą kinazy polinukleatydowej która jako substarty urzywa właśnie ATP znakowanego izotopem P-32 w pozycji gamma -> to jest mapowanie S1 konca 5’....a EMSa to retardacja w zelu i znakujemy koneic po prostu nici DNA