Towaroznawstwo Żywności Nr grupy: 1	POPRAWA Imię i nazwisko: KM	Nazwisko prowadzącego: Dr Barbara Mickowska
Data wykonania ćwiczenia: 5.03.2015r.	Tytuł ćwiczenia: Spektrofotometryczna analiza ilościowa - Spektrofotometryczne wyznaczanie jednego składnika.	Data oddania sprawozdania: 12.03.2015r.

1. Wstęp teoretyczny.

Spektrofotometria - jest techniką instrumentalną, w której do celów analitycznych wykorzystuje się przejścia energetyczne zachodzące w cząsteczkach, spowodowane absorpcją promieniowania elektromagnetycznego w zakresie nadfioletu (UV, 200-380 nm), widzialnym (VIS, 380-780 nm) lub bliskiej podczerwieni (0,78-30000 um).

Metodą spektrofotometrii UV-Vis można oznaczać substancje organiczne (np. wiele związków posiadających wiązanie π lub elektrony n, w tym węglowodory aromatyczne, aldehydy, ketony, kwasy i aminy) i nieorganiczne (np. pierwiastki ziem rzadkich, ozon, SO₂) wykazujące absorpcję w nadfiolecie, związki absorbujące promieniowanie w zakresie widzialnym, w tym barwne związki organiczne (barwniki) i barwne sole metali (np. KMnO₄, CuSO₄) oraz substancje, których formy absorbujące promieniowanie uzyskuje się na drodze reakcji chemicznych. Do celów tych najczęściej wykorzystuje się reakcje kompleksowania.

Prawo Lamberta – mówiące iż, natężenie światła monochromatycznego, przechodzącego przez jednorodny układ absorbujący, jest zależne od grubości warstwy absorbującej.

Prawo Beera – mówiące iż, absorbancja światła monochromatycznego przechodzącego przez jednorodny ośrodek absobujący jest proporcjonalna do stężenia substancji w roztworze.

Prawo addytywności absorpcji - mówiące iż, absorbancja układu wieloskładnikowego jest równa sumie absorbancji poszczególnych składników, jeśli spełniony jest warunek braku oddziaływań między składnikami roztworu.

Metoda krzywej wzorcowej. Krzywą wzorcową nazywa się przedstawioną graficznie zależność absorbancji od stężenia substancji wzorcowej. Polega ma sporządzeniu serii wzorców o składzie naśladującym próbkę badaną, o zakresie stężeń pokrywającym cały przedział analityczny. Umożliwia to określenie stężenia substancji w badanej próbce.

2.Cel ćwiczenia.

Celem ćwiczenia było oznaczanie stężenia białka metodą Lowry'ego.

3. Przebieg ćwiczenia.

Ćwiczenie wykonano zgodnie z instrukcją.

Do oznaczenia albuminy wykorzystano metodę krzywej kalibracji. Mając do dyspozycji roztwór albuminy o stężeniu wzorcowym 10 mg/ml. Sporządzono dwie serię wzorcowych roztworów białka o stężeniach, które przedstawia Tabela 1. Dane pomiarowe obu serii oraz badanej próbki (o nieznanym stężeniu) przedstawiono za pomocą Tabela 2, a następnie wykonano krzywą kalibracji dla I serii, którą przedstawia Wykres 1. Za pomocą otrzymanych parametrów z prostej regresji oraz wartości absorbancji badanej próbki (Tabela 3), obliczono stężenie białka w próbce. Znając rzeczywiste stężenie białka obliczono błąd względny otrzymanego wyniku. Nie wykorzystano pomiarów z II serii, powód przedstawiono we wnioskach.

Tabela 1. Stężenie białka z uwzględnieniem rozcieńczenia.

Zawartość białka [mg]	Objętość pobranego białka z próbki wyjściowej [ml]	Objętość wody do uzupełnienia próbki [ml]
0	0	1,500
0,3	0,045	1,455
0,6	0,090	1,410
0,9	0,135	1,365
1,2	0,180	1,320
1,5	0,225	1,275

Obliczenia: Przykładowe dla próbki z zawartością białka 0,3 mg – reszta analogicznie

0,3mg	-	X
10mg	-	1ml
X=0,03ml
0,03ml	-	1ml
Y	-	1,5
Y=0,045ml

1,500ml-0,045ml=1,455ml – objętość wody do uzupełnienia próbki 0,3mg białka znajduję się w 0,045ml próbki wyjściowej.

4. Dane pomiarowe.

Tabela 2. Absorbancja próbek względem próby odczynnikowej przy długości fali 500 nm

Numer próbki	Stężenie	Absorbancja
I seria
1	0	0,0006
2	0,3	0,1195
3	0,6	0,3148
4	0,9	0,4306
5	1,2	0,5478
6	1,5	0,6538
II seria
1	0	- 0,0284
2	0,3	0,1361
3	0,6	0,3049
4	0,9	0,4322
5	1,2	0,4560
6	1,5	0,5153

Tabela 3. Zmierzona absorbancja dla badanej próbki o nieznanym stężeniu.

Stężenie mg/ml	Absorbancja	Średni wynik absorbancji
X	X1= 0,3030	0,3358
	X2= 0,3404
	X3 = 0,3641

Wykres 1. Krzywa kalibracji dla I serii.

5. Opracowanie wyników.

Otrzymano z Wykres 1 wzór krzywej kalibracji a następnie podstawiono za "y" wynik średniej absorbancji badanej próbki, którą odczytano z Tabela 3.

0,3358 = 0,444x + 0,011

0,444x = 0,3248 /: 0,444

x = 0,7315 mg/ml

Z dokonanych pomiarów i obliczeń wynika iż, stężenie badanego białka w próbce wynosiło 0,7247 mg/ml. Gdzie rzeczywista zawartość białka, podana przez prowadzącego ćwiczeń wynosiła 0,7500 mg/ml.

Do wyznaczenia błędu względnego otrzymanego wyniku, obliczono stosunek błędu bezwzględnego do wartości rzeczywistej próbki.

B_bezwzgledny = x - x_z ,gdzie: x_z -wartość zmierzona, x- wartość rzeczywista

B_bezwzgledny = |0,75-0,73|= 0,02

B_wzgledny=$\ \frac{B_{\text{bezwzgl}e\text{dny}}}{x}$

B_wzgledny= $\frac{0,02}{0,75}\ \cdot 100\ \%\ $= 2,67 %

6. Wnioski

Błąd względny otrzymanego wyniku wyniósł 2,67%, więc jest poprawny gdyż nie przekroczył 15% (przyjęto, że wartość błędu względnego nie powinna przekraczać 15%). Oznacza to, że wykonane czynności podczas ćwiczeń zostały przeprowadzone zgodnie z instrukcją i dużą starannością a metoda oznaczenia jest dokładna.

Jednak niektóre źródła w Internecie twierdzą, że zasadniczą wadą tej metody jest duży błąd względny, który przeciętnie wynosi 5 – 10 %, a podczas oznaczania zawartości śladowych (do 10-15 %), dla metod ze wstępnym zagęszczaniem wielkość błędu może wynosić do 30 %.

Odrzucono wyniki z II serii ponieważ znacznie odbiegały od wyników z I serii oraz ich przebieg nie był prawidłowy. Mogło być to spowodowane brakiem staranności przy wykonywaniu ćwiczenia.

Jednak kolejne źródła w Internecie twierdzą, że nie wystarczy jednorazowe sporządzenie krzywej wzorcowej. Zmiany warunków pracy i temperatury, partii odczynników oraz charakterystyki detektora powodują przesunięcie się krzywej lub zmianę kąta jej nachylenia. W zależności od tego jak duże są te odchylenia, należy każdorazowo sporządzać krzywą pracy w danym dniu pomiaru, albo korzystać z jednej krzywej wyznaczonej na podstawie kilku serii pomiarów.