Towaroznawstwo Żywności Nr grupy: 1	Imię i nazwisko: KM	Nazwisko prowadzącego: Dr Barbara Mickowska
Data wykonania ćwiczenia: 26.03.2015r.	Tytuł ćwiczenia: Elektroforeza białek na żelu poliakrylamidowym w obecności siarczanu dodecylu sodu (SDS) oraz elektrotransfer białek na membranę PVDF.	Data oddania sprawozdania: 16.04.2015r.

1. Wstęp teoretyczny.

Elektroforeza w żelu poliakrylamidowym jest użyteczną i powszechnie stosowaną metodą rozdzielania i charakterystyki białek. Jest to stosunkowo prosta i szybka technika. Na jednym żelu można przeprowadzić jednocześnie analizę wielu próbek, a rozdzielone białka można skutecznie wykrywać w żelu np. metodami barwienia, immunoprecypitacji czy autoradiografii. Można więc stosować tę technikę na przykład przy analizie białek we frakcjach zbieranych w trakcie rozdzielania na kolumnie chromatograficznej.

W SDS-PAGE stwarza się warunki, w których wszystkie składniki próbki mają ten sam ładunek; ich ruchliwość jest więc jedynie funkcją mas cząsteczkowych (SDS-PAGE). Użycie anionowego detergentu soli sodowej kwasu dodecylosiarkowego (SDS – ang. Sodium Dodecyl Sulfate) pozwala na rozdzielenie elektroforetytczne białek zgodnie z ich masą cząsteczkową. Przed i w trakcie elektroforezy białka ulegają dysocjacji i denaturacji w obecności SDS, który łączy się z białkami specyficznie w stosunku masowym 4,1:1. Zapewnia to przejęcie przez białko ujemnego ładunku elektrycznego netto o stałej gęstości bez względu na jego długość. Dla całkowitego rozwinięcia polipeptydu i zapewnienia mu pierwszorzędowej struktury, niezbędne jest dodatkowo zniszczenie mostków dwusiarczkowych (β-merkaptoetanol lub ditiotretiol). Opłaszczenie białka przez SDS oraz redukcja mostków dwusiarczkowych pozwalają na separację białek w żelu poliakrylamidowym ze względu na ich wielkość, a zatem pośrednio masę cząsteczkową. Szybkość migracji w SDS-PAGE nie jest determinowana przez ładunek elektryczny białka zależny od pH i konformacji białka.

2.Cel ćwiczenia.

Zastosowanie elektroforezy w warunkach denaturujących i redukujących (w obecności SDS i 2-merkaptoetanolu) do wyznaczania masy cząsteczkowej białek. Technika elektrotransferu.

3. Przebieg ćwiczenia.

Przygotowano dwie próbki: próbka I (do barwienia) - ze wzorcowego roztworu białka, próbka II (do transferu) - z ekstraktu białego w pszenicy (do rozdzielenia). Roztwory rozpipetowano po trzy razy, różne ilości w dwóch powtórzeniach, a następnie dodano buforu w proporcji 1:3 (Tabela 1.). Dalsze czynności wykonano zgodnie z instrukcją.

Tabela 1. Zmieszane próbki w stosunku 1:3 z buforem próbkowym.

Wzorcowy roztwór białka [μl]	Bufor [μl]	Ekstrakt biały w pszenicy [μl]	Bufor [μl]
2	6	10	30
4	12	5	15
6	18	3	9

4. Dane pomiarowe.

Zdjęcie 1. Membrana, na którą zostały przeniesione wyniki elektroforezy białek markerowych.

Odległość wędrówki na podstawie Zdjęcie 1, wraz z elektroforetyczną ruchliwością względną białek markerowych z membrany przedstawia Tabela 2.

Tabela 2. Odległość wędrówki wraz z ruchliwością względną białek markerowych z membrany

Numer próbki białka pszenicy	Odległość wędrówki [mm]	*Elektroforetyczna ruchliwość względna ()	Masa [kDa]	logM
1	3	0,056	170	2,230
2	4,5	0,085	130	2,114
3	8	0,151	100	2,000
4	10,5	0,198	70	1,845
5	15	0,282	55	1,740
6	19	0,358	40	1,602
7	24,5	0,461	35	1,544
8	30	0,565	25	1,398
9	42,5	0,800	15	1,176
Badana	11,5	0,217
BARWNIK	53,1

*Obliczenia w punkcie 5.

Zdjęcie 2. Żel z wynikami elektroforezy białek markerowych.

Na podstawie otrzymanego żelu nie wykonano obliczeń z polecenia prowadzącego ćwiczeń. Przyczyną otrzymania nieprawidłowego żelu najprawdopodobniej było niepoprawne pipetowanie bądź niezastosowanie się do instrukcji z ćwiczenia.

Elektroforeza w obecności SDS frakcjonuje białka zależnie od ich masy (długości łańcucha polipeptydowego). Złożem, w którym następuje rozdział białek jest żel poliakrylamidowy, w czasie polimeryzacji oraz w trakcie elektroforezy ustawiony w pozycji pionowej. Standardowo SDS PAGE jest używana w wersji tzw. disc electrophoresis, umożliwiającej maksymalne wykorzystanie zdolności rozdzielczych tej metody.

5. Obliczenia

Elektroforetyczną ruchliwość względną dla białek markerowych z membrany obliczono ze wzoru: $u = \frac{x}{y}$ ,gdzie: x -droga, którą przebyło białko, y -droga, którą pokonał barwnik- 53, 1mm. Wyniki przedstawiono w Tabela 3. Następnie wykorzystując dane z Tabela 2 wykonano Wykres 1.

Tabela 3. Elektroforetyczna ruchliwość względna białek markerowych z membrany

Próbka	Obliczenia [mm]	Wynik [mm]
1	$$\mu_{1} = \frac{3}{53,1}$$	0,056
2	$$\mu_{2} = \frac{4,5}{53,1}$$	0,085
3	$$\mu_{3} = \frac{8}{53,1}$$	0,151
4	$$\mu_{4} = \frac{10,5}{53,1}$$	0,198
5	$$\mu_{5} = \frac{15}{53,1}$$	0,282
6	$$\mu_{6} = \frac{19}{53,1}$$	0,358
7	$$\mu_{7} = \frac{24,5}{53,1}$$	0,461
8	$$\mu_{8} = \frac{30}{53,1}$$	0,565
9	$$\mu_{9} = \frac{42,5}{53,1}$$	0,800
Badana	$$\mu_{X} = \frac{3,5?}{53,1}$$	0,066

Wykres 1. Krzywa kalibracyjna elektroforetycznej ruchliwości względnej dla białek markerowych z membrany

Na podstawie równania otrzymanego z Wykres 1 obliczono masę badanej próbki białka.

y= -0,695x + 1,537

0,217 = -0,695x + 1,537

0,695x = 1,32

x= 1,8993 - logM badanej próbki białka

10^1, 8993 = 79, 3049 - masa badanej próbki białka [kDa]

6. Wnioski

Dzięki możliwości rozdzielenia białek na podstawie ich wielkości oznaczyliśmy masę cząsteczkową nieznanego białka, porównując jego położenie w żelu w stosunku do innych białek (tzw. białek wzorcowych) po zakończonej migracji i wybarwieniu.

Źródła z internetu mówią, że technika elektroforezy w żelu poliakryloamidowym w obecności SDS pozwala oszacować masę cząsteczkową z dokładnością ±10% dla białek o m.cz. z zakresie 15 000 ÷ 100 000 Da. W zakresie tym dostępne są handlowo zestawy białek wzorcowych.

Stosowanych jest wiele metod wizualizacji żeli i membran. Białka najczęściej wybarwia się stosując naturalne barwniki, takie jak błękit kumassi czy czerń amidową. Barwnik dodawany jest zwykle do roztworu utrwalającego położenie białka w żelu (denaturacja i unieruchomienie molekuł), po czym nadmiar barwnika jest wymywany. Pozostaje tylko barwnik związany z białkami. Czułość takiej detekcji białek jest stosunkowo dobra. Można w ten sposób znaleźć 1 μg białka w prążku.