Badanie mięsa w kierunku włośnicy:

Indywidualne sprawdzanie zwierząt w ubojniach

Badanie mięsa w rzeźniach ma na celu: wyeliminowanie wystąpienia objawów

klinicznych włośnicy u ludzi, jednakże nie eliminuje całkowicie możliwości zarażenia tym

pasożytem. Obecnie stosowane metody wytrawiania próby zbiorczej, co najmniej 1 g próbek

(dla mięsa świńskiego) lub trichinoskopowego badania 0,5 g próbek, są uważane za

wystarczające do stwierdzenia zarażonego mięsa, które mogłoby wywołać tą groźną chorobę

u ludzi. Dla produktów spożywanych bez gotowania lub innych procedur inaktywujących

włośnie, bardziej restrykcyjne badania są zalecane.

Rutynowe badanie mięsa świń w ubojniach

Dla rutynowego badania tusz świńskich z użyciem wytrawiania prób zbiorczych, co

najmniej 1 g próby a dla rejonów endemicznych 5 g próby, są zalecane w celu

wyeliminowania możliwości zachorowań ludzi. Z tych samych powodów, co najmniej 0.5 g

próby, lub jeżeli jest to możliwe to więcej, powinno być użyte do badań trichinoskopowych.

Każda z opisanych metod wytrawiania prób zbiorczych musi być właściwie (należycie)

oceniona i wykonana zgodnie z obowiązującymi przepisami.

Wymogi, które muszą być spełnione w celu uwiarygodnienia metody. Wymogi te to:

1. Stosowanie sprawdzalnego system zbierania i identyfikacji prób. System gwarantować

musi, że 1 gramowe lub większe indywidualne próbki tworzące zbiorową próbę zapewnią

identyfikację poszczególnych indywidualnych osobników tworzących tą próbę.

2. Płyn trawiący musi być dobry jakościowo i przygotowany w sposób zapobiegający

spadkowi aktywności pepsyny. Należy pamiętać, że przygotowując płyn trawiący należy

zawsze dodać kwas solny do wody a dopiero potem pepsynę. Taka kolejność chroni enzym

przed jego degradacją spowodowaną użyciem stężonego kwasu. Inne czynniki, takie jak

pochodzenie i jakość enzymu, ilości używanego enzymu i kwasu, stosunek wagowy płynu

trawiącego do masy wytrawianej próby, powinny odpowiadać publikowanym zaleceniom.

3. Temperatura utrzymywana w procesie wytrawiania nie powinna przekroczyć 45±2°C.

Wyższe temperatury inaktywują enzym i przez to wpływają negatywnie na skuteczność

wytrawiania, a przez to niższą wykrywalność larw. Z kolei niższe temperatury wymagają

dłuższych czasów wytrawiania lub skutkują niecałkowitym wytrawieniem próby.

4. W następstwie wytrawiania, niewytrawiona tkanka mięśniowa powinna pozostać (jako

dowód na materiale tworzącym sito). Wytrawianie powinno być całkowite, aby mieć pewność

skuteczności (wiarygodności) metody. Środkami zapobiegającymi nie pełnego wytrawienia to

właściwe wymieszanie składników płynu trawiącego, prawidłowa homogenizacja prób,

przedłużenie czasu wytrawiania. Jeżeli i to nie skutkuje, należy zweryfikować jakość enzymu

(pepsyny).

5. Procesy sedymentacyjne i stosowane czasy powinny spełniać wymóg odzyskiwania jak

największej liczby larw. W stosowanych metodach, zakładających 30 minutowy okres

sedymentacji, jest to wystarczający parametr. Sam proces sedymentacji może być ulepszony

poprzez okresowe wytrząsanie lejka lub samego jego ujścia w czasie opadania larw.

Pozyskiwanie warstwy sedymentacyjnej z lejków musi odbywać się przy całkowitym

otwarciu części spustowej, zapobiegając w ten sposób recyrkulacji larw.

6. Wytrawione próby muszą być odpowiednio oczyszczone, zwiększając przez to

wykrywalność samych larw. Standardowym testem jest możliwość odczytu druku gazetowego

podłożonego pod dnem szalki testowej.

7. Przyrządy optyczne muszą być właściwe i zapewniać powiększenie 15-40 krotne. Ponadto,

wymagana jest stała konserwacja sprzętu optycznego.

8. Wytrawianie powinno być zakończone przed usunięciem lub dystrybucją tusz. Ten wymóg

jest konieczny i zapobiega dystrybucji zarażonych tusz na rynku konsumenta.

9. Dokumentacja winna być tak prowadzona by zapewnić identyfikację prób i tusz.

W przypadku uzyskania pozytywnych wyników badania w kierunku Trichinella należy:

1. Ustalone procedury powinny być wykonane w miejscu, w którym dokonano

pozytywnej identyfikacji tuszy. Próba wytrawiania powinna zostać powtórzona na większej

ilości tkanki mięśniowej.

2. Tusze, u których wykryto larwy włośni powinny zostać usunięte i utylizowane

zgodnie z obowiązującymi przepisami.

3. Plan działania powinien ponadto zakładać: możliwość ustalenia pochodzenia

zwierząt, u których stwierdzono włośnicę; możliwość przeprowadzenia badań

epidemiologicznych i serologicznych na większą skalę: kontrolę i zmianę zabiegów

hodowlanych mających na celu wyeliminowanie możliwości zarażenia w przyszłości oraz

monitorowanie miejsca przez dłuższy okres czasu w celu upewnienia się, że włośnica nie

występuje. W przypadku stwierdzenia włośnicy u koni, wskazane jest prześledzenie

pochodzenia konia oraz przeprowadzenia badań epidemiologicznych w miejscu

dotychczasowego bytowania zwierzęcia.

Uwaga: państwa eksportujące świnie i konie w celach konsumpcyjnych powinny mieć sprawny

system identyfikacji pochodzenia zwierząt oraz środki finansowe pozwalające na przeprowadzenie badań

epidemiologicznych w rejonach, w których stwierdzono występowanie włośnicy u zwierząt.

Zapewnienie jakości metody wytrawiania

Międzynarodowa Komisja Włośnicowa zaleca, aby wszystkie laboratoria przeprowadzające

badania mięsa świń, innego żywca i zwierzyny łownej spełniały odpowiednie standardy

jakościowe.

Standardy te są niezbędne i uwiarygodniają procedury. Audytowanie spełnia funkcje

kontrolne wobec procedur oraz zapewnia prowadzenie właściwej dokumentacji. Zaleca się,

aby weryfikację przeprowadzać regularnie (np. 4 razy w roku).

W załączniku przedstawiono najważniejsze normy jakościowe metody wytrawiania.

Przesyłane do weryfikacji próby powinny być odpowiednie dla określonej metody badania na

obecność włośni (np. minimum 0,5 g do badań trichinoskopowych oraz 1 g do zbiorczej

próby wytrawiania).

Testowanie (autoryzacja) metody wytrawiania

Międzynarodowa Komisja Włośnicowa zaleca, aby wszystkie stosowane metody badania

mięsa na obecność larw włośni, włączając wszelkie modyfikacje powszechnie stosowanych i

zaakceptowanych metod, powinny być sprawdzone wobec ustalonych standardów, a wynik

tych porównań powinien być dostępny i stanowić dowód skuteczności metody na rynku

krajowym i zagranicą.

Alternatywne metody badania

Pośrednie (serologiczne) metody badania mięsa w kierunku włośnicy nie są zalecane jako

metoda zastępcza wobec bezpośrednich metod (badania trichinoskopowe bądź metoda

wytrawiania prób zbiorczych) indywidualnych zwierząt w ubojniach.

Udoskonalenia metod bezpośrednich powinno być przeprowadzane w oparciu o

dotychczasowe metody wytrawiania, tak, aby zwiększyć czułość i specyficzność badania.

Mięso, które może zawierać larwy włośni i nie zostało przebadane w tym kierunku żadną z

zalecanych metod a w rzeczywistości jest wolne od włośni powinno zostać poddane

procedurom, które prowadzą do inaktywacji larw, przed wprowadzeniem do konsumpcji. To

dotyczy zarówno mięsa komercyjnego jak i własnego chowu.

ICT uznaje trzy sposoby przetwarzania mięsa zapewniające bezpieczeństwo konsumenta.

Te metody to gotowanie, mrożenie oraz napromieniowanie.

Edukacja konsumenta

We wszystkich rejonach, gdzie badania mięsa na obecność włośni nie są stosowane,

konsumenci powinni być poinformowani przez odpowiednie służby opieki zdrowotnej o

niebezpieczeństwie spożywania takiego mięsa i sposobach bezpiecznego przygotowania

potraw z takiego mięsa. Te sposoby to:

 gotowanie do temperatury wewnątrz mięsa, co najmniej 71°C (160°F),

 głębokie mrożenie (-15°C lub mniej) przez trzy tygodnie kawałki mięsa do 15 cm grubości

i cztery tygodnie dla kawałków o grubości do 69 cm.

W rejonach gdzie występują gatunki włośni oporne na niskie temperatury, konsumenci powinni być

informowani o nieskuteczności procesu mrożenia mięsa i grożącym niebezpieczeństwie.

Sposoby przygotowania potraw mięsnych, które nie są uważane za w pełni bezpieczne to:

 gotowanie przy pomocy kuchenki mikrofalowej,

 konserwowanie, suszenie i wędzenie

Wszystkie powyższe zalecenia dotyczą oprócz konsumentów i ludzi parających się

myślistwem. Szczególną uwagę należy zwrócić na obecność w danym rejonie gatunków

włośni opornych na inaktywujące działanie niskich temperatur.

ITC przestrzega przed konsumowaniem surowego mięsa pochodzącego od świń, koni i

zwierząt łownych.

Przenoszenie (drogi przenoszenia) włośni do zwierząt gospodarskich jest głównie związane z

skarmianiem zwierząt surowymi odpadami poubojowymi lub nawet całymi tuszami oraz

przez kontakt z zarażonymi gryzoniami i zwierzętami wolno żyjącymi. Nowoczesne metody

hodowli trzody chlewnej redukują znacznie lub wręcz eliminują ryzyko zarażenia się zwierząt

włośniami. To są minimalne wymagania, aby uważać, że ich stosowanie skutecznie eliminuje

ryzyko zarażenia się zwierząt. Praktyki te przedstawione są poniżej:

Trzoda chlewna, wymagania hodowlane

Architektoniczne i środowiskowe bariery*

 Budynki chlewni powinny być tak zbudowane, aby uniemożliwiały penetrację gryzoni z

zewnątrz.

 Wejścia do budynków hodowlanych, takie jak otwory wentylacyjne czy wodociągowe,

powinny być zabezpieczone siatkami o średnicy oczek nie większych niż 1 cm.

 Przestrzeń do 100 m od budynków hodowlanych powinna być wolna od gruzowisk i innych

kryjówek gryzoni.

 Dwumetrowa przestrzeń wokół budynków hodowlanych wyłożona żwirem lub roślinnością

nieprzekraczającą 10 cm wysokości.

Pasza i magazyny paszowe

 Pasza powinna być składowana w zamkniętych silosach tak, aby uniemożliwić wnikanie

gryzoni.

 Zakupiona pasza powinna pochodzić od wytwórców gwarantujących odpowiedni standard.

 Odpady pokarmowe, zawierające mięsne składniki powinny być gotowane zgodnie z

przepisami prawa, tak, aby inaktywować larwy włośni.

Kontrola gryzoni

 Program kontroli gryzoni poprzez stosowanie skutecznych preparatów chemicznych

powinien być wprowadzony i stosowany.

 Ślady obecności gryzoni (nory, tropy, odchody) nie powinny być znajdowane.

Higiena na fermie hodowlanej

 Tusze padłych zwierząt powinny być usunięte z fermy w ciągu 24 godzin zgodnie z

obowiązującymi przepisami sanitarnymi.

 W odległości nie mniejszej niż 2 km od fermy hodowlanej nie powinno być składowisk

odpadów zwierzęcych.

Nowe zwierzęta

 Nowe zwierzęta powinny pochodzić z farm wolnych od włośnicy, bądź

 Nowe zwierzęta powinny przejść kwarantannę i zostać przebadane serologicznie po trzech

tygodniach od ich wprowadzenia (na obecność przeciwciał w kierunku Trichinella).

Wytrawianie próby zbiorczej w kierunku obecności larw Trichinella spp.

Wprowadzenie

W procesie wytrawiania tkanki mięśniowej w sztucznym płynie trawiącym uwalniane są

żywe larwy z torebek mięśniowych. Każda metoda pozwalająca wykryć larwy

w badanym mięsie powinna być sprawdzona na próbach pozytywnych i negatywnych, a

potem kontrolowana okresowo.

Pobieranie prób do badań

Próby do badań powinny być pobierane z miejsc predylekcyjnych dla danego gatunku

zwierzęcia. U świń to filary przepony i mięśnie języka, a u koni to mięśnie języka i żuchwy.

Jeżeli miejsca predylekcyjne dla jakiegoś gatunku są nieznane zalecane jest pobieranie prób z

miejsc jak wyżej.

Do badań powinny być pobierane próby, których wielkość zapewni odpowiedni próg

wykrywalności; pojedyncze próby do 100 g od jednego osobnika lub zbiorcze od wielu

osobników, łącznie też do 100 g tkanki mięsnej. Czułość metody powinna zapewnić wykrycie

w jedno gramowych próbach do 3 larw na 1 gram tuszy; w trzygramowych próbach do 1,5

larwy na 1 gram tuszy; w pięciogramowych próbach do 1 larwy na gram tuszy. Dla zdrowia

ludzi, badanie jednogramowych prób z tusz świńskich (przepona lub język), jest skuteczną

metodą i redukującą występowanie tej zoonozy u ludzi w wielu krajach. Tam wszędzie, gdzie

mięso nie jest poddawane obróbce cieplnej a jest spożywane surowe to jest zalecane

zwiększenie wielkości próby do 5 gramów

Wykonanie badania

Próby tkanki mięsnej nie powinny zawierać tłuszczu i powięzi, ponieważ części te są nie

wytrawialne i nie zawierają larw włośni. Następnie powinny zostać poddane procesowi

rozdrabniania/maceracji, który wspomaga proces trawienia (metoda rozdrabniania pozostaje

sprawą indywidualnego wyboru).

Zalecane jest rozdrabnianie prób zbiorczych jak i indywidualnych w malakserze, aż do

uzyskania jednolitej masy. Jest to ważny etap gdyż rzutuje na skuteczność procesu

wytrawiania tkanki mięśniowej (zbyt intensywne rozdrabnianie prowadzi do uszkodzenia

larw).

Stosowanie maszynek do mielenia mięsa jest dopuszczalne, trzeba jednakże pamiętać, aby

używać sitek o średnicy do 3 mm.

Wytrawianie prób

Każda ze 100 g prób powinna być trawiona w objętości 2-3 litrów kwaśnego płynu

trawiącego. Stosunek 1:30 tkanki mięśniowej do objętości płynu trawiącego (100 gramów

11 tkanki mięsnej w 3 litrach płynu trawiącego) jest właściwym do osiągnięcia szybkiego i

całkowitego wytrawienia próby.

Wszystkie części malaksera lub maszynki do mielenia mięsa powinny zostać starannie

przepłukane podgrzaną (45 +/− 2°C) i zakwaszoną (0,5-1,0% HCl) wodą wodociągową i po

uzupełnieniu do 3 litrów stanowić objętość trawionej próby.

W końcu, pepsyna (o mocy 1:10 000) jest dodawana do tak przygotowanej

mieszaniny by stosunek wagowo/objętościowy stanowił 0,5 - 1,0 %. W przypadku

rozdrabniania przy użyciu malaksera, odpowiednia ilość pepsyny powinna zostać dodana na

etapie maceracji tkanki mięsnej a następnie całość przepłukana i przeniesiona do 3-4 litrowej

zlewki z zakwaszoną wodą (o objętości jak wyżej).

Do wytrawiania prób (zawieszonych w 2-3 litrach objętości) używamy 3-4 litrowych zlewek

zakrytych folią aluminiową, która zabezpiecza przed rozpryskaniem płynu podczas

intensywnego mieszania na mieszadle magnetycznym (magnesy o długości 8-10 cm) lub na

innym urządzeniu mieszającym, przez minimum 30 minut (czasami dłuższy czas jest

wymagany by trawienie było całkowite).

Temperatura podczas wytrawiania powinna wynosić 45 +/−2 °C i być kontrolowana przez cały czas tego etapu. Wytrawianie w łaźni wodnej, inkubatorze czy pomieszczeniach, w których istnieje możliwość kontroli tego parametru, jest dopuszczalne i wskazane. Wytrawianie jest zakończone, gdy w płynie trawiącym nie widać nawet najmniejszych kawałków tkanki mięśniowej.

Odzyskiwanie larw

Po wytrawianiu, płyn jest przelewany ze zlewki przez sito o średnicy oczek 180-335 μm do

rozdzielacza sedymentacyjnego o wymaganej objętości (lejek, 2-4 L) i pozostawiony na 30

minut. Zlewka i sito powinny zostać przepłukane podgrzaną wodą (min. 100 ml). Stałe

fragmenty tkanki mięśniowej nie powinny być widoczne na sicie. Jeżeli są, powinny zostać

wytrawione ponownie.

Po 30 minutach sedymentacji na lejku, należy gwałtownie spuścić około 40 ml płynu wraz z

osadem do 50 ml probówki (kalibrowanego cylindra), i pozostawić na kolejne 10 minut. Po

tym czasie ok. 40 ml (supernatant) należy odciągnąć i dolać ciepłej wody do obj. 40 ml.

Czynność powtarzać aż do otrzymania klarownej próby. Inne sposoby oczyszczania płynu są

wskazane, jednakże trzeba mieć na uwadze, aby samo spuszczanie było przy pełnym otwarciu

końcowego otworu i szybkie. Częściowe otwarcie prowadzi do cyrkulacji larw włośni w

lejku. Końcowe 10 ml klarownego przesączu należy poddać oglądowi pod mikroskopem

Liczenie larw

W celu policzenia larw, klarowny przesącz wylany na szalkę Petriego, powinien być

przeglądany pod mikroskopem (15-40x powiększenie). Płyn powinien być na tyle

przeźroczysty by podłożony druk gazetowy był łatwo odczytywalny. Przy braku tego

wymogu proces oczyszczania i sedymentacji powinien być powtórzony.

Gdy larwy są znajdowane w metodzie próby zbiorczej, procedury są powtarzane na

mniejszych liczbowo próbach zbiorczych aż do stwierdzenia zarażonej indywidualnej tuszy.

Wysoki standard badań na obecność włośni

1. Wprowadzenie

Programy zapewniające wysoki standard metod diagnostycznych czy procedur

wykrywających powinny być zawsze stosowane tam gdzie zdrowie ludzi jest zagrożone. ISO

Protokół 25 jest takim programem i został wykorzystany przy opracowaniu jakościowych

standardów dla pracowni/laboratoriów kontrolujących mięso na obecność larw włośni z

rodzaju Trichinella:

2. Instrukcja

Program jakościowy zapewniający wysoki standard stosowanej metody (ISO Protokół 25) lub

inny podobny, ale akceptowalny przez wszystkich ze względu na wysoki standard jest

wymagany w celu udokumentowania, że przeszkoleni pracownicy stosując daną metodę z

należytą starannością i zgodnie z określonymi zaleceniami, uzyskują właściwe, i powtarzalne

wyniki. Taki program/instrukcja powinien opisywać z detalami samą metodę, organizacyjną

strukturę pracowni/laboratorium, stopień przeszkolenia pracowników, rodzaje testów

kontrolnych, określony sposób ewidencji odstępstw od instrukcji, jasne kryteria sprawdzające

dla wykwalifikowanego personelu, prowadzenie bazy wyników, prowadzenie wykazu błędów

i zastosowanych akcji zaradczych, pełną dokumentację i system kontroli rewizyjnej.

Inne ważne parametry takiego programu to określenie sposobu pobierania prób do badań w

rzeźni, identyfikacja prób i badanych zwierząt, bezbłędny sposób identyfikacji wstecznej

osobnika, u którego w tuszy stwierdzono larwy włośni, sposób usuwania i likwidacji

zarażonej tuszy.

13

3. Właściwe wyposażenie laboratorium

Pracownia/laboratorium, w którym prowadzone są badania powinno być wyposażone w

niezbędny sprzęt zapewniający pełne bezpieczeństwo zatrudnionym tam pracownikom.

Powinno być wydzielone klimatyzowane pomieszczenie ze specjalistyczną aparaturą i

oprzyrządowaniem, właściwym oświetleniem, dopływem wody bieżącej i armaturą do mycia

używanych naczyń i sprzętu. Pracownicy powinni posiadać niezbędny sprzęt BHP

(rękawiczki, okulary, fartuchy ochronne itp.)

4. Wiarygodność testów sprawdzających

Wyniki uzyskiwane w testach .beta. (druga próba równo cenna pierwszej) świadczą o

dokładności metody. Czułość i specyficzność każdej metody powinna być znana i

oszacowana na podstawie stosownych badań (w tym statystycznych) na materiale

pozyskanym w wyniku kontrolnych i eksperymentalnych inwazji. Tylko tak sprawdzone i

opracowane metody powinny być stosowane, a każda nowa metoda powinna zostać jeszcze

raz opracowana. Czułość i powtarzalność metody muszą być jasno określone i precyzyjnie

zdefiniowane.

5. Wzorcowy protokół

Właściwe szkolenie i jasno opisana metoda postępowania (instrukcja) są niezbędne i

zapewniają właściwe i powtarzalne wyniki w każdym laboratorium stosującym daną metodę.

Protokół/instrukcja powinien być napisany jasno i przedstawiać z detalami każdy etap

procedury z pełnym zabezpieczeniem aparaturowo-odczynnikowym. Realizacja procedury

powinna być w pełnej zgodności z instrukcją i powinna zawierać punkty/miejsca krytyczne,

tj. takie sytuacje, które mogą wywierać wpływ na uzyskiwane wyniki. Wszelkie zmiany

wprowadzane do instrukcji, nawet te najlepsze, powinny być właściwie udokumentowane,

poddane testom sprawdzającym (z testami statycznymi włącznie).

6. Szkolenie i ocena obsługi

Szkolenie i jasno opisane zasady postępowania są niezbędne i zapewniają właściwe oraz

powtarzalne wyniki w każdym laboratorium stosującym daną metodę. Opis metody powinien

być dostępny w miejscu pracy. Szkolenie powinno być wszechstronne i prowadzone przez

wykwalifikowaną osobę a osoby szkolone powinny zostać poddane pisemnemu i

praktycznemu egzaminowi z użyciem nieznanej próby w miejscu szkolenia, jak i po powrocie

w miejscu pracy.

7. Program sprawdzający dla wykwalifikowanej obsługi

Wszystkie przeszkolone osoby, cztery razy do roku, powinny być poddawane testom

kontrolnym na odpowiednio przygotowanym materiale przez referencyjne laboratorium lub

materiale przesłanym od innych jednostek biorących udział w szkoleniach (wymiana prób).

Jedna instrukcja powinna być stosowana we wszystkich jednostkach. Osoby, które zaliczą

testy utrzymują nadal swoje certyfikaty. Nie zaliczenie testów wymaga zdawania egzaminu

ponownie, w przypadku oceny negatywnej takiej osobie odbierany jest certyfikat.