INŻYNIERIA GENETYCZNA

(MIKROBIOLOGIA)

…………………………………………………………….

(Imię i Nazwisko)

!!!!!!!Na zajęciach obowiązuje fartuch i ksero zeszytu do wypełnienia!!!!!!!

Zasady zaliczenia ćwiczeń:

• ocena z zaliczenia

• aktywność na zajęciach i przygotowanie do zajęć

• zaliczenie zeszytu z wynikami doświadczeń i wnioskami

Tematyka ćwiczeń:

Cw1. Ukompetentnianie komórek linii JM109. (dzień wcześniej zaszczepienie kolonii do pożywki LB). Ligacja z wektorem pGEM-T. Przygotowanie płytek LB/amp/IPTG/x-GAL.

Ćw2. Transformacja i posiew na szalki.

Ćw3. Izolacja plazmidowego DNA (dzień wcześniej zaszczepić transformowane kolonie)

Ćw4. Elektroforetyczny rozdział [plazmidowego DNA.

Zaliczenie.

Literatura:

Malepszy S .(red.) 2009. Biotechnologia nasion. Wydawnictwo Naukowe PWN.

Ausubel F. M. 2002. Short protocols in Molecular Biology. WILEY

Walker J. M., Rapley R. 2009. Molecular Biology and Biotechnology. Royal Society of Chemistry

Węgleński P. Genetyka molekularna.

INŻYNIERIA GENETYCZNA (rekombinacja DNA in vitro) – zespółtechnik pozwalających na namierzone, kontrolowane, przewidziane przezeksperymentatora modyfikacje genetyczne genomów, a także na analizę genówi genomów. W wyniku takich działań powstają m.in. trwałe zmianywłaściwości dziedzicznych biorcy.

Zadanie 1. Dzień przed zajęciami zaszczepić płynną pożywkę LB pojedyńczą kolonią JM 109.

Ćw1.

TEMAT: Ukompetentnianie komórek linii JM109. Ligacja z wektorem pGEM-T. Przygotowanie płytek LB/amp/IPTG/x-GAL.

Co należy umieć:

• Metody ukompetentniania komórek.

• Ligacja

• Wektory bakteryjne

Zadanie 1.

Przygotowanie komórek kompetentnych:

1. Zaszczepić 10 ml płynnej pożywki LB 0,5 ml nocnej hodowli E. coli JM109

2. Inkubować 3 h w temperaturze 37°C w wytrząsarce aż do uzyskania odpowiedniego OD

OD 600nm= 0,2-0,35 (0,4 już za stara);

3. Odstawić hodowlę do lodu na 20-30 minut, mieszając co jakiś czas

4. Odwirować kolonie w probówkach wirówkowych 4000 rpm 10 minut 4⁰C.

5. Usunąć dokładnie pipetą supernatant i dodać do pełna CaCl₂ (zimnego!), zawiesić osad i umieścić probówki w łaźni lodowej 20-30 minut.

6.. Wirować 4000 rpm 10 minut 4⁰C.

7. Ponownie zawiesić osad w CaCl₂ (dodać do pełna) odstawić na 10 minut do lodu.

7. Probki odwirować (2 minut 6000 rpm w temperaturze 4oC);

8. Usunąć pipetą supernatant i zawiesić każdą próbkę w 100 μl CaCl₂/gliceryna (nie wyjmując probówek z lodu!!!);

9. Inkubować w łaźni lodowej przez 15 – 20 minut zamrozić w -70⁰C.

Ligacja polega na tworzeniu kowalencyjnych wiązańfosfodwuestrowych pomiędzy grupami 3’OH i 5’P dwóch sąsiadujących nukleotydów w łańcuchu DNA. Najczęściej stosowanym enzymem do przeprowadzenia tej reakcji jest ligaza faga T4. Istotnym parametrem reakcji ligacji jest stosunek molowy DNA donorowego do wektorowego. Najczęściej stosuje sięproporcjęmolową2:1. Często w konkretnym doświadczeniu istnieje koniecznośćoptymalizacji tej proporcji eksperymentalnie. W przypadku małej ilości DNA donorowego można użyćnadmiar wektora. Stężenie wektora w próbce powinno wynosić0,02-0,05 µg/µl. Przy stężeniu 0,01-0,02 µg/µl plazmid zamyka sięw kółka, stężenie 0,3-0,5 µg/µl sprzyja zaśtworzeniu konkatamerów.

Reakcjęligacji prowadzimy na ogół w niskiej temperaturze, 14-16°C. Taka temperatura sprzyja powstawaniu wiązańwodorowych pomiędzy lepkimi końcami fragmentów DNA, co zwiększa wydajnośćreakcji. W przypadku łączenia fragmentów DNA z tępymi końcami konieczne jest stworzenie takich warunków, aby zwiększyćprawdopodobieństwo ich zetknięcia się. Można to osiągnąćprzez dodanie glikolu polietylenowego (PEG) do buforu ligacyjnego. Ponieważreakcja ligacji tępych końców przebiega wolniej, można wydłużyćczas ligacji lub dodaćwięcej jednostek enzymu w celu uzyskania większej ilości produktów.

Aktywnośćenzymu określa sięstosując różne jednostki aktywności. Jednostka Weissa jest zdefiniowana jako ilośćenzymu wymagana do katalizowania wymiany 1 nmola32 P z pirofosforanu do ATP. Jednostka aktywności ligacji lepkich końców jest zdefiniowana jako ilośćenzymu wymagana do uzyskania 95% ligacji 1 µg fragmentów HindIII faga λ w czasie 20 min. w 16 °C. Taka jednostka odpowiada 0,01 jednostek Weissa, a 1 jednostka Weissa odpowiada 67 jednostkom ligacji lepkich końców.

Klonowanie

Podstawowym elementem techniki klonowania są wektory - nośniki służące dowprowadzania i powielania fragmentów DNA w komórkach wybranego organizmu.Najczęściej stosowanymi wektorami są plazmidy, czyli koliste cząsteczki DNA zawierająceelementy niezbędne do autonomicznej replikacji w komórce gospodarza. W najczęściejstosowanym systemie klonowania komórkami gospodarza są bakterie E. coli.

Klonowanie fragmentów DNA w E. coli na wektorze plazmidowym

Poniżej (Rys 3.) przedstawiono uproszczony schemat klonowania fragmentu DNA w

E. coli na wektorze plazmidowym i omówiono poszczególne etapy tego procesu.

1. DNA donorowy poddaje się trawieniu enzymem restrykcyjnym. Tym samym enzymem

restrykcyjnym lub enzymem zostawiającym identyczne lepkie końce przecina się wektor.

W przypadku klonowania fragmentu DNA uzyskanego w reakcji PCR miejscetrawienia enzymem restrykcyjnym wprowadza się poprzez dodanieodpowiedniej sekwencji do starterów.

Jeżeli celem klonowania jest przeniesienie fragmentu DNA z jednego wektorana drugi, po strawieniu zrekombinowanego wektora zwykle izoluje sięwstawkę DNA poprzez elektroforezę w żelu.

2. Przeprowadza się ligację wektora z fragmentami donorowego DNA. Aby zapobieccyrkularyzacji wektora przed ligacją można usunąć grupy fosforanowe obecne na końcach5’ liniowego plazmidu, niezbędne w procesie ligacji, przy użyciu fostatazy. Podefosforylacji jedynie wektor z dołączoną wstawką może ulec cyrkularyzacji. Reakcjadefosforylacji nigdy nie zachodzi ze stuprocentową wydajnością. Po ligacji powstajązatem trzy klasy kolistych cząsteczek: odtworzony pusty wektor, zamknięte w kółkofragmenty donorowego DNA i wektor ze wstawką (czyli plazmid zrekombinowany).

3. Kolejnym etapem klonowania jest transformacja, czyli wprowadzenie DNA do komórek

bakterii.

Bakterie muszą być odpowiednio przygotowane na przyjęcie DNA – musząbyć kompetentne. Komórki E. coli uzyskują kompetencję między innymi pootraktowaniu jonami wapnia w niskiej temperaturze (4oC), a następniepoddaniu szokowi cieplnemu (w temp.37oC-42oC). Wniknięcie DNA dokomórki bakteryjnej można również uzyskać przeprowadzając elektroporację,czyli zastosowanie silnego impulsu elektrycznego uszkadzającego błonękomórkową.

Po transformacji bakterie wysiewa się na odpowiednie podłoże selekcyjne.Selekcja opiera się na obecności w wektorze genu markerowego, który nadajetransformatom określony fenotyp, np. oporność na antybiotyk (patrz poniżej).Transformanty rosnące na podłożu selekcyjnym będą zawierały pusty wektoralbo wektor ze wstawką. Zasada klonowania opiera się na założeniu, że dojednej komórki bakteryjnej wnika tylko jedna cząsteczka plazmidu.Potomstwo takiego transformanta to klon, z którego, po jego namnożeniu,można wyizolować DNA plazmidowy.

Na przedstawionym schemacie w przypadku DNA genomowego każdyzrekombinowany plazmid zawiera inną wstawkę. Jeżeli uzyskamy dostatecznąliczbę klonów niosących zrekombinowane plazmidy, tak aby zawarte w nichwstawki reprezentowały cały genom, mówimy że klony te stanowią bankgenomowego DNA (lub bank genomowy lub bibliotekę genomową) danegoorganizmu.

4. Ostatnim etapem klonowania jest wyszukanie pojedynczego klonu zawierającego

zrekombinowany plazmid z interesującym nas fragmentem DNA.

Wektory bakteryjne

Pierwsze wektory do klonowania w oparciu o naturalnie występujące plazmidy

bakteryjne, takie jak np. ColE1, skonstruowano w latach siedemdziesiątych. W miarę rozwoju

genetyki wektory były udoskonalane poprzez wprowadzanie nowych elementów

ułatwiających klonowanie. Wektory plazmidowe zawierają następujące, podstawowe

elementy:

Ori – miejsce inicjacji replikacji. Miejsce inicjacji replikacji jest specyficzne dla danej

komórki gospodarza. Niektóre plazmidy bakteryjne niosą „silne” ori, dzięki czemu

występują bardzo licznie w pojedynczej komórce – są to tak zwane plazmidy

wysokokopijne.

Marker I – znajdujący się na wektorze gen pozwalający odróżnić bakterie

posiadające plazmid od takich, które go nie zawierają. Jako markery najczęściej

stosuje się geny oporności na antybiotyki (np. ampicylinę lub tetracyklinę). Podczas

transformacji tylko nieliczne bakterie przyjmują plazmid, ale tylko one będą w stanie

wyrosnąć na pożywce z dodatkiem antybiotyku. Oczywiście szczep użyty do

transformacji musi być wrażliwy na ten antybiotyk.

Marker II – ten marker pozwala odróżnić bakterie, które pobrały plazmid bez

wstawki, od takich, które otrzymały plazmid zrekombinowany, czyli zawierający

wstawkę (patrz poniżej).

Polilinker– jest to niewielki, sztucznie utworzony odcinek DNA, zawierający

sekwencje rozpoznawane przez wiele enzymów restrykcyjnych. Są to na ogół

pojedyncze miejsca cięcia w wektorze. Polilinker zazwyczaj wstawiony jest w obrębie

drugiego markera

Zadanie 2. Wyliczyć ilość użytego insertu:

W systemie pGEM-T najczęściej wykorzystywanym stosunkiem molarnym wektora do insertu jest 3:1 (insert:wektor). pGEM-T Vector - długości 3kb, o steżeniu 50ng/µl.

Ilośc użytego insertu należy wyliczyć ze wzoru

Przykład:

Miejsce na obliczenia:

Zadanie 3. Wykonać ligację insertu z wektorem pGEM-T.

Reakcje przygotowujemy na lodzie, należy szybko i krótko zwirować wektor, bufor i ligazę.

Po dodaniu wszystkich składowych reakcji należy delikatnie przepipetować mieszaninę i odstawić na około 1h w temperaturze pokojowej. Dla lepszego efektu należałoby odstawić mieszaninę do lodówki na noc.

Miejsce na notatkę:

Ćw2.

TEMAT: Transformacja i posiew na szalki.

Co należy umieć:

• Transformacja

• Test α-komplementacji

• Geny markerowe i reporterowe.

Wykorzystanie markera II do wykrywania transformantów niosących

zrekombinowany plazmid:

Cięcie enzymem restrykcyjnym musi być wykonane w obrębie markera II. Jeśli do

wektora zostanie włączona wstawka, spowoduje to zniszczenie genu markerowego. W

przypadku użycia jako markera II genu oporności na antybiotyk bakterie posiadające

zrekombinowany plazmid będą wrażliwe na antybiotyk, tak więc dla uzyskania

zrekombinowanych klonów wymagane jest zastosowanie techniki replik (selekcja

negatywna).

Przesiewania bakterii można uniknąć stosując inny rodzaj markera – ß-galaktozydazę.

Na wektorze znajduje się N-końcowy fragment genu lacZkodującego ten enzym (nazywany

fragmentem Z’ lub α) wraz z sekwencją promotorową, a w genomie szczepu biorcy znajduje

się część C-końcowa wraz z sekwencjami niezbędnymi dla jej ekspresji. Po wprowadzeniu

plazmidu do komórki biorcy produkty białkowe obydwu fragmentów genu lacZłączą się

tworząc funkcjonalny enzym. Jest to tak zwana α-komplementacja. Jeśli w obrębie

fragmentu Z’ wstawiony zostanie odcinek DNA, w komórce nie będzie powstawał aktywny

enzym. Obecność ß-galaktozydazy wykrywa się w komórkach E. coli poprzez dodanie do

podłoża X-gal, który po przecięciu ß-galaktozydazą przyjmuje niebieskie zabarwienie. Tak

więc, po wysianiu stransformowanych bakterii na podłoże z X-gal niebieskie zabarwienie

przyjmą kolonie powstałe z komórek zawierających pusty wektor, a kolonie niezabarwione

będą posiadały plazmidy ze wstawkami.

Ćw3.

TEMAT: Izolacja plazmidowego DNA z bakterii.

Co należy umieć:

• Metody izolacji plazmidowego DNA

• Formy przestrzenne plazmidów

Opracowano szereg metod oczyszczania plazmidowego DNA, z których każda obejmuje trzy etapy:

- hodowlę bakterii (i ewentualnie amplifikację plazmidu),

- lizę bakterii,

- oczyszczanie plazmidowego DNA.

Plazmidy izoluje się najczęściej z hodowli płynnych, w których podłoże uzupełnione jest odpowiednim antybiotykiem. Wysokokopijne wektory plazmidowe (np. serii pUC, pGEM), otrzymywane są z hodowli znajdującej się w późnej fazie logarytmicznej wzrostu, podczas gdy wektory nisko- i średniokopijne (np. pBR322) powinny być przed izolacją amplifikowane. Do częściowo wyrośniętej hodowli dodaje się w tym celu chloramfenikol, który selektywnie zapobiega replikacji chromosomu bakteryjnego.

We wszystkich metodach izolacji plazmidowego DNA wykorzystuje się dwie istotne różnice pomiędzy DNA genomowym a DNA plazmidowym bakterii:

-DNA genomowy jest wielokrotnie większy od DNA plazmidu,

-podczas procedury izolacji DNA plazmidowego DNA genomowy zostaje trwale zniszczony, podczas gdy DNA plazmidowy pozostaje w postaci form CCC (ang. covalently closed circle).

Odwirowane komórki bakteryjne poddawane są lizie. Bakterie ulegają lizie pod wpływem niejonowych lub jonowych detergentów (SDS, Sarkozyl, Triton X-100), rozpuszczalników organicznych, roztworów alkalicznych (liza alkaliczna) lub wysokiej temperatury (liza termiczna). Stosowany może być również lizozym - enzym trawiący ścianę komórkową bakterii (nie działa w pH<8.0). W metodzie lizy alkalicznej bufor o wysokim pH zawierający NaOH i SDS powoduje całkowitą lizę komórki jak również denaturację genomowego DNA, natomiast plazmidowy DNA w formie CCC zostaje zdenaturowany jedynie na niewielkich odcinkach. W przypadku otrzymywania plazmidowego DNA metodą termiczną, czynnikiem denaturującym jest wysoka temperatura, w której DNA genomowy i plazmidowy zachowują się podobnie jak w wysokim pH.

Następny etap oczyszczania DNA polega na oddzieleniu DNA od białek. Zwykle stosuje się do tego celu nasycony buforem roztwór fenolu lub jego mieszaninę z chloroformem i alkoholem izoamylowym. Białka można również usunąć przez trawienie ich proteinazami (zwykle proteinazą K). Usunięcie RNA przeprowadza się enzymatycznie, inkubując próbki z RNazą (wolną od DNaz), przez sączenie molekularne lub wirowanie w gradiencie gęstości.

W metodzie lizy alkalicznej, kiedy liniowe cząsteczki DNA ulegają denaturacji, natomiast superzwinięte formy CCC plazmidu są po denaturacji nadal splecione, neutralizacja pH roztworami o wysokim stężeniu soli (np. octan amonu) prowadzi do renaturacji jedynie DNA plazmidowego, podczas gdy DNA genomowy wraz z RNA i białkami wytrąca się w postaci osadu. Z odbiałczonych próbek DNA wytrącany jest alkoholem etylowym lub izopropanolem w obecności octanu potasowego, sodowego lub amonowego. Wszystkie metody otzrymywania plazmidowego DNA z wyjątkiem lizy alkalicznej, wymagają oddzielenia tego DNA od DNA genomowego w gradiencie chlorku cezu w obecności bromku etydyny. Oczyszczanie plazmidowego DNA przeprowadzić można również metodą wirowania lizatów komórkowych w gradiencie alkalicznej sacharozy, stosując wymieniacze jonowe (np. kolumienki Qiagen) lub filtrację na żelach.

Zadanie 1. Izolacja plazmidowego DNA – liza alkaliczna.

(modyfikacja metody Birnboim i Doly, 1979)

1. Poprzedniego dnia, bakterie z wybranych kolonii bakteryjnych zaszczepić do 5 ml pożywki płynnej LBamp (100 mg/L ampicyliny). Inkubować przez noc w 37˚C, z wytrząsaniem.

2. Rozlać hodowlę bakteryjną do probówek Eppendorfa i zwirować bakterie w mikrowirówce przez 2 minuty, 10 000 obr/min, supernatant usunąć.

3. Bakterie zawarte w osadzie zworteksować, a następnie zawiesić w 200 μl roztworu SOL-I, ponownie krótko zworteksować i przetrzymać pięć minut w pokojowej temperaturze.

4. Dodać 200 μl roztworu SOL-II, wymieszać przez inwersję 2-3 razy i umieść na lodzie na 5 minut.

5. Dodać 200 μl zimnego (z lodówki) roztworu SOL-III, wymieszać (wytrąci się biały osad) i umieść w pojemniku z lodem na 10 minut.

6. Zwirować przez 10 minut (14 000 obr/min, 4˚C) i przelać ostrożnie klarowny supernatant do nowej probówki zawierajj 10 μl RNazy (10mg/ml).

7. Inkubować 15 min. w 37˚C.

8. Dodać 750 μl lodowatego izopropanolu, wymieszać przez inwersję, wytrącać DNA przez minimum 10 minut w -80˚C lub 20-30 minut w -20˚C, ew. 45 minut w RT.

9. Zwirować zawartość probówki przez 15 minut (14 000 obr/min, 4˚C) i usunąć supernatant.

10. Osad DNA przemyć poprzez dodanie 1 ml 70% roztworu etanolu i 10-krotna inwersję. Zwirować zawartość probówki przez 15 minut (14 000 obr/min, 4˚C) i odpipetować etanol, delikatnie by nie naruszyć osadu.

11. Ponownie krótko zwirować (do 1 min. 14 000 obr/min, 4˚C) i odpipetować resztę etanolu. Uważać by nie usunąć osadzonego DNA plazmidowego.

12. Osuszyć DNA dokładnie na powietrzu (10-15 minut otwarte probówki, temp. pokojowa) lub próżniowo (do 5 minut, SpeedVac).

13. Rozpuść osad w 50-100 μl buforu TE lub H₂O.

14. Tak przygotowane DNA plazmidowe może być przetrzymywane krótkoterminowo w temperaturze 4˚C lub w lodzie, a długoterminowo w temperaturze -20˚C / -70˚C.

Zadanie 2. Ocena ilościowa i jakościowa uzyskanego plazmidowego DNA.

(metoda spektrofotometryczna, BioSpec Nano, Shimadzu)

1. Włączyć urządzenie i komputer, uruchomić oprogramowanie BioSpec Nano.

2. W menu wybrać odpowiednią opcję pomiaru Simple Nucleic Acid Qant/dsDNA [OK]

3. Wykonać kalibrację, nakładając 1µl buforu TE lub H₂O (próba ślepa – blank) na okienko, uważając na ewentualne bąbelki powietrza, które mogą zafałszować pomiar. Po wykonaniu pomiaru okienko zostanie przetarte automatycznie.

4. Wykonać pomiar dla prób badanych, nakładając na okienko 1 µl roztworu DNA.

5. Odczytać wyniki pomiaru i zapisać je.

Analiza i interpretacja wyniku:

* Analiza ilościowa: Ilość kwasu nukleinowego jest określana jako stężenie w 1 µl. Zakres stężeń, w którym oznaczenie jest wiarygodne to ok. 50-3700 ng/µl . Powyżej tej wartości DNA lub RNA jest zbyt stężone, by prawidłowo określić jego ilość i wyznaczyć krzywą absorbancji. Poniżej wartości 10ul znacząca absorbancja tła powoduje przeszacowanie wyniku. Próbkę o zbyt wysokiej wartości absorbancji rozcieńczamy tym samym buforem, którego używaliśmy podczas izolacji i którym kalibrowaliśmy urządzenie. Przy zbyt niskiej ilości kwasu nukleinowego próbkę zagęszczamy lub przyjmujemy że ma ona stężenie niższe niż wyliczone przez urządzenie.

* Analiza jakościowa: maksimum absorbancji białek, częstego zanieczyszczenia DNA przy izolacji manualnej, wynosi 280 nm, zaś zanieczyszczenia organiczne posiadają najwyższą absorbancję poniżej 240 nm. Przyjęto więc arbitralnie 230nm jako długość fali dobrze określającą stopień zanieczyszczeń rozpuszczalnikami.organicznymi.

* Miarą stopnia czystości kwasów nukleinowych jest stosunek A260/230 oraz A260/280. Przyjmuje się, że czyste DNA lub RNA ma A260/280>1,8 i A260/230>1,8. Idealnie czyste RNA rozpuszczone w wodzie DEPC może mieć A260/230 nawet ok. 2,20. Na dokładną wartość tego parametru nieznacznie wpływa użyty bufor, ale generalnie parametry dobrze wyizolowanego DNA lub RNA oscylują wokół 1,8 – 2,05.Najprościej rzecz ujmując oznacza to, że absorbancja przy maksimum dla kwasów nukleinowych (A260) jest 2x większa niż absorbancja tła i zanieczyszczeń.

* Krytyczne dla reakcji enzymatycznych są wartości A260/280 i A260/230<1,4. Niższe wartości mogą spowodować bardzo kiepskie wyniki amplifikacji np. metodą Real-Time PCR czy też słabe znakowanie sond do mikromacierzy. Przy A260/230<1 nawet zwykły RT-PCR może okazać się problemem. Dlatego w przypadku kiepskiej czystości należy powtórzyć ekstrakcję alkoholem.

Rodzaje zanieczyszczeń

* Zanieczyszczenie fenolem powodują wzrost absorbancji w zakresie 200-230 nm i rozszerzenie krzywej w zakresie 250-280 nm. Takie DNA/RNA nie nadaje się do zastosowań enzymatycznych.

* Zanieczyszczenie izotiocyjanianem lub chlorkiem guanidyny – wydatny pik przy długości fali 230nm i towarzyszące mu przesunięcie absorbancji DNA/RNA w prawo w kierunku 270nm. Taka próbka w żadnym wypadku nie nadaje się do zastosowań enzymatycznych. Najczęściej oba parametry A260/A280 i A260/A230 <1,4.

* Zanieczyszczenie białkami – powodują wzrost absorbancji w zakresie 200-230 nm i rozszerzenie krzywej w zakresie 250-280 nm.

* Zanieczyszczenie etanolem i/lub izopropanolem – nie obserwuje się znaczącej zmiany absorbancji, szczególnie w roztworach zbuforowanych. W wodzie parametr A260/230 może być nieznacznie obniżony. Przy niewielkiej domieszce etanolu reakcje enzymatyczne nie są mocno zakłocóne, warto jednak przywiązywać wagę do dokładnego wysuszenia pelletu przd rozpuszczeniem, ponieważ zanieczyszczenia etanolem i izopropanolem są niewykrywalne spektrofotometrycznie!

* Zanieczyszczenie DNA przez RNA (i vice versa) - oba kwasy nukleinowe są koekstrahowane i zazwyczaj występują razem po izolacji. Mają także bardzo zbliżoną pochłanialność i emisję światła, więc są nirozróżnialne spektrofotometrycznie. W przypadku konieczności pozbycia się DNA albo RNA musimy wykonać trawienie próbek odpowiednio, DNAzą albo RNazą.