Technika mikroskopowania

Budowa mikroskopu:

- okular – powiększenie obrazu tworzonego przez obiektyw

- tubus – formowania powiększonego obrazu pośredniego

- śruba makrometryczna – wstępna regulacja odległości

- śruba mikrometryczna

- rewolwer – prosta zmiana obiektywu

- obiektywy – zbierają światło wychodzące z przedmiotu i tworzą jego powiększony obraz pośredni

- stolik łapki

- śruby do poruszania stolikiem

- kondensator

Typy mikroskopów

- świetlny

- ultramikroskop

-luminescencyjny

- fazowo – kontrastowy

- ultrafioletowy

- elektronowy

- elektronowy skaningowy

Mikroskop świetlny:

- zasadą działania jest wzmocnienie dwóch soczewek pracujących w zespole. Jedna to obiektyw a druga to okular. Otrzymywane powiększenie jest iloczynem powiększenia obiektywu i okularu. Zastosowanie z laboratorium mikrobiologicznym i cytologicznym.

Opis komórki:

- kształt – kuliste, cylindryczne, spiralne w postaci rozgałęzionych nici lub kształtu zmiennego ( polimorfizm)

- sposób barwienia

- wielkość: mykoplazmy 0,125 µm – 0,2 µm

Ziarenkowce 0,5 – 1,5 µm

Pałeczki i laseczki 1 - 10 µm

Krętki do 40 µm

- ułożenie komórek względem siebie

• Mogą występować pojedynczo, być ułożone parami, tworzyć krótsze lub dłuższe łańcuszki

• Występowanie w formie nieregularnych skupisk, tworzyć układy w kształcie liter X,Y,Z

Podział drobnoustrojów:

1. Kuliste ( ziarenkowce):

Dwoinki – Streptococcus pneumoniae

Czwórniaki – Tetracoccus spp

Pakietowce – Sarcina spp

Gronkowce – Staphylococcus aureus

Paciorkowce – Streptococcus pyogenes

1. Cylindryczne

Pałeczki – Escherichia coli

Laseczki – Clostridium difficile

Formy nieregularne – Corynebacterium spp

1. Spiralne

Przecinkowce – Vibrio cholerae

Śrubowce – Spirillum spp

Krętki – Treponema pallidum

Typy ułożenia przetrwalników:a

1. Terminalne ( biegunowe)

2. Subterminalne ( podbiegunowo)

3. Paracentralnie ( przyśrodkowo)

4. Centralnie ( środkowo)

Typy urzęsienia komórki bakteryjnej:

- monatricha – jednorzęsne ( Vibrio cholerae)

- ditricha – dwurzęsne ( Campylobacter jejuni)

- lofotricha – jednobiegunowe ( Helicobacter pylori)

- amfitricha – dwubiegunowe ( Spirillum spp)

- peritricha – wkołorzęsne ( Salmonella spp)

- nietypowe – ( Mobiluncus spp)

- atricha – bezrzęsne ( Staphylococcus spp.)

Cel barwienia:

- ułatwienie obserwacji komórek oraz odróżnienie ich od innych elementów preparatu.

Rodzaje preparatów:

1. Bezpoośredni – wykonany z materiału klinicznego pobranego od pacjenta

2. Pośredni – wykonany z 18 – 24 godzinnej hodowli drobnoustrojów

Metody barwienia

↙ ↘

Pozytywne negatywne ( wybarwiamy tło, czarny

(wybarwiamy komórki) barwnik)

↙ ↘

Proste ( jeden barwnik ) złożone ( minimum 2 barwniki)

Barwienie przeżyciowe – modyfikacje barwienia pozytywnego prostego, ale stosowanego do preparatów mokrych, żywych ( cel- odróżnienie komórek żywych od martwych i obliczenie stosunku procentowego)

Metody specjalne:

1. Do barwienia bakterii:

Ziechla – Neelsena – prątki, zarodniki grzybów, przetrwalniki bakterii

Neissera – maczugowce, wykrywamy obecność białek zapasowych

1. Do barwienia przetrwalników:

Möllera – ( przetrwalniki barwią się na czerwono, komórki na niebiesko)

Domera – ( przetrwalniki barwią się na czerwono, komórki niezabarwione)

1. Do barwienia otoczek:

Negatywno – pozytywna wg Burnego – Giusa

Negatywne

1. Do barwienia rzęsek:

Leifsona – (stosując barwniki z taminą)

Barwienie negatywne:

- polega na zabarwieniu tła, a pozostawieniu niezabarwionych komórek. Umożliwia obejrzenie kształtu komórek bakterii lub elementów komórki trudnych do wybarwienia np.: otoczek. Używamy barwników grubo – dyspersyjnych tj: tusz chiński, nigrozyna, rzadziej czerwień Kongo.

Barwienie bakterii metodą Grama:

Utrwalenie preparatu → Fiolet krystaliczny → Płyn Lugola → Odbarwienie roztworem alkoholu → Fiuksyna zasadowa

Bakterie Gram+: Staphylococcus spp, Streptococcus spp, Bacillus spp, Clostridium spp.

Bakterie Gram -: Pseudomonas spp, Neisseria spp, Moraxella spp.

Bakterie Gram chwiejne: Corynebacterium spp.

Atypowe: Chlamydia spp, Mycoplasma spp., Rickettsia spp.

Posługiwanie się mikroskopem:

- siłę oświetlenia regulujemy przy pomocy osłony, na stoliku przedmiotowym umieszczamy preparat z naniesioną na niego kropelką olejku immersyjnego, obniżyć tubus za pomocą śruby makrometrycznej patrząc przez okular, obniżać przy pomocy śruby makrometrycznej umieszczony preparat na stoliku, ustawić ostrość obrazu przy pomocy śruby mikrometrycznej.

Przygotowanie:

- utrwalanie powoduje: częściową denaturację struktur komórkowych co ułatwia wnikanie barwnika, zabicie komórek bakterii, przytwierdzenie do szkiełka co przeciwdziała zmyciu preparatu podczas barwienia.