Techniki badawcze w cytofizjologii

Cytologia- nauka o budowie wewnętrznej i funkcji podstawowej jednostki budulcowej organizmów żywych jaka jest komórka

1. Robert Hook (Anglik) - komórki korka-nazwa komórka – 1665
2. Anton van Leeuwenhoek (Holender) – opisał żyjące bakterie – 1668
3.Mathias Schleiden (Niemiec) – wszystkie rośliny SA zbudowane z komórek - 1838
4. Theodor Schwann (Niemiec) – wszystkie zwierzęta są zbudowane z komórek - 1839
5. Rudolf Virchow (Niemiec) – wszystkie komórki pochodzą od już istniejących - 1849

Mikroskop świetlny wykorzystuje światło naturalne lub sztuczne, dostarczane do układu optycznego. Światło może padać na oglądany obiekt z góry (odbiciowy mikroskop optyczny) lub z dołu (w tym przypadku obiekt musi być półprzeźroczysty)

*Dyfrakcja – ugięcie fali
*Interferencja – nachodzenie fal świetlnych

Możliwe oglądanie preparatów utrwalonych lub żywych w świetle przez nie przechodzącym

Rodzaje mikroskopów świetlnych:
1. Kontrastowo-fazowy- przesunięcie fazy świetlnej dzięki specjalnej przesłonie w kondensorze i płytce fazowej w obiektywie

Technikę kontrastu fazowego wykorzystuje się w przypadku gdy poszczególne elementy preparatu nie różnią się właściwościami absorpcyjnymi, a tylko współczynnikiem załamania światła bądź grubością

Umożliwia skontrastowanie nie barwionych preparatów i jest wykorzystywany głównie do obserwacji żywych komórek

2. Polaryzacyjny – wyposażony w dwa układy polaryzujące :
-polaryzator
-analizator

Ciała anizotropowe – o uporządkowanej strukturze, załamują płaszczyznę światła spolaryzowanego

Służy do badań obiektów anizotropowych w świetle spolaryzowanym w cytofizjologii

3. Mikroskop interferencyjny Nomarskiego – wykorzystuje interferencję dwu lub kilku wiązek świetlnych, różniących się od siebie opóźnieniem w fazie

Ilościowe określenie stopnia opóźnienia w fazie wiązek świetlnych względem siebie pozwala na zmierzenie suchej masy przedmiotu oglądanego – jest wprost proporcjonalne do np. suchej masy komórki.

4. Mikroskop fluorescencyjny
- oświetlenie preparatu spelnia role źródła energii, nie bierze udzialu w procesie tworzenia obrazu
-źródła światła od UV do niebieskiego
-obraz widoczny dzięki własnemu promieniowaniu materiału badanego, zdolnego do fluorescencji

Fotoluminescencja – wtórny efekt świetlny wywołany przez światło
Fluorescencja – wtórne efekty świetlne trwające dopóki światło pobudza te efekty:
*fluorescencja pierwotna – składnik komórek np. chlorofil zdolne do autofluorescencji
* fluorescencja wtórna- wykorzystuje fluorochromy – zdolne do autofluorescencji, np. oranż akrydynowy umożliwia obserwacje znakowanych przeciwciał
Fosforescencja – wtórne efekty świetlne trwające po ustaniu promieniowania świetlnego pobudzającego

Barwniki fluorescencyjne – substancja selektywnie absorbująca i emitująca światło o określonej długości fali:
*zielone Cy2, fluoresceina (wzbudzona światłem niebieskim)
*czerwone rodamina (wzbudzona światłem zielono-żółtym) Texas red,
*podczerwone – Cy5, Cy7, Alexa dyes (wszystkie używane głównie do znakowania przeciwciał
*żółte Cy3, Alexa 568
*niebieskie DAPI (absorbuje UV, fluoryzuje na jasnoniebiesko, tworzy fluoroscencyjne kompleksy z sekwencjami bogatymi w pary AT w podwójnym łańcuchu DNA, stabilny barwnik dla DNA, zwłaszcza w utrwalonych komórkach
*Hoest 33342 – zasada działania analogiczna do DAPI, może być stosowana w żywych, nieutrwalonych komórkach
*oranż akrydynowy (AO) selektywny, niespecyficzny barwnika DNA i RNA. Zielona fluorescencja dla DNA, czerwona dla RNA

Zastosowania:
*wykrywanie i badanie lokalizacji białek a także innych cząsteczek w komórkach i tkankach, znakowanie organelli
*badanie zmian wewnątrzkomórkowego stężenia jonów
*diagnostyka chorób - choroby genetyczne – fluorescencyjne badanie chromosomów
*białka fuzyjne
*immunofluorescencja

5. Mikroskop konfokalny – odmiana mikroskopu fluorescencyjnego, w którym źródłem światła jest laser. Umożliwia dokonywanie tzw. przekrojów optycznych preparatu, analizuje bowiem światło pochodzące z jednej jego płaszczyzny, eliminując światło docierające z warstw położonych wyżej lub niżej.

Zalety:
*znaczne poprawienie ostrości obrazu
*możliwość rekonstrukcji 3D
*możliwość rejestracji wielobarwnej
*znaliza ko lokalizacji
*możliwość rekonstrukcji 4D

Wady:
*obserwacja w danej chwili tylko jednego punktu preparatu
*wpływ czynników otoczenia- pod wpływem temperatury, stężenia jonów, Ph, natężenia oświetlenia, wiązania kowalencyjnego z ligandami zmianie może ulec refektywność kwantowa fluorescencji oraz spektra absorpcyjne i emisje flurochromu
*blaknięcie(fotobleaching)- fluor ochrom wykazuje zmiejszająca się w czasie intensywność fluorescencji – zwiększona reaktywność stanu wzbudzonego
*fototoksyczność – wzbudzone barwniki fluorescencyjne reagują z tlenem cząsteczkowym, powstaje anionorodnik ponadtlenkowy, tlen singletowy, rodnik hydroksylowy i nadtlenek wodoru, co uniemożliwiając przeprowadzenie długich obserwacji na żywych komórkach

Mikroskopia elektronowa

Transmisyjny mikroskop elektronowy- strumień elektronów przechodzi przez preparat (stąd nazwa mikroskopu – transmisyjny). Rejestrowane są elektrony przechodzące przez próbkę (o grubości mniejszej od 0,1 mikrometra)

W mikroskopach skaningowych cala powierzchnia próbki jest bombardowana – skanowana strumieniem elektronów. Próbka emituje sygnały, np. promieniowanie rentgenowskie, które jest rejestrowane przez detektor, a następnie przetwarzane na obraz próbki lub widmo promieniowania rentgenowskiego

Przyrządy pomocnicze:
*mikrotomy – cięcie preparatów
*mikrotom mrożeniowy
*ultramikrotomy
*aparat Balcersa- rozłupywanie tkanek zmrożonych w ciekłym azocie
*aparat Anderssona- suszenie tkanek w próżni do obserwacji pod mikroskopem skaningowym i transmisyjnym
*Napylarka próżniowa – złotem lub platyną w próżni – skaningowy

INNE METODY
1. Badania genetyczne i cytogenetyczne – wygląd i liczba chromosomów
2. Metody immunocytochemiczne – wykrywanie i lokalizacja składników komórek i tkanek w oparciu o oddziaływanie antygen-przeciwciało. Znakowanie przeciwciał fluorochromami, enzymami, metalami
3. Metody autoradiograficzne:
*autoradiografia- lokalizowanie izotopów promieniotwórczych lub znakowanych nimi substancji w komórkach i tkankach
*substancje te wprowadzane SA do żywego organizmu lub żywych komórek, gdzie gromadzą się lub włączają w procesy metaboliczne.

Zastosowania:
*śledzenie dróg migracji komórek
*śledzenie populacji komórek intensywnie namnażających się, poprzez wbudowanie znakowanych nukleotydów do nowo syntezowanych łańcuchów DNA
*badanie sposobu namnażania się organelli komórkowych

4. Metoda kultury komórkowej (hodowla) - hodowla komórek jest to utrzymanie oddzielonych organizmu komórek w warunkach sztucznych (in vitro) przez okres dłuższy niż doba. Stwarza ona unikalna możliwość obserwacji zachowania się żywych komórek pozbawionych kontrolnego i regulacyjnego wpływu całego organizmu

Zastosowanie hodowli komórek:
*funkcjonowanie aparatu genetycznego komórki
*wpływ na komórki substancji regulacyjnych, toksycznych, rakotwórczych lub leków,
*aberracje chromosomowe
*genetycznie uwarunkowane zanurzenia metabolizmu i wyposażenia komórek
*produkowanie przez komórki substancji czynnych biologicznie
*odpowiedź komórek na stymulację antygenem