Sprawozdanie

„Oznaczanie RNA w materiale roślinnym”

Data:

16.10.2015

Sekcja 1:

Cichoń Dawid
Kocikowska Anna
Piątkowska Katarzyna
Stanek Maja
Wodzisławska Karolina

Sekcja 2:

Piesyk Monika
Polizio Elżbieta
Rakowska Agnieszka
Serafimowicz Weronika
Wawrzeczko Joanna

Cel ćwiczenia:

Ilościowe oznaczenie RNA w materiale roślinnym.

Przbieg ćwiczenia:

1. Usunięcie większości chlorofilu, lipidów, wolnych puryn i nukleotydów:

• Przygotowano
  a) sekcja 1: 338 mg
  b) sekcja 2: 311 mg
  drobno posiekanych liści rzeżuchy.

• Do kolby stożkowej wprowadzono 100 ml 80% alkoholu etylowego.

• Etanol doprowadzono do wrzenia w łażni wodnej nastawionej
  na temperaturę 104⁰C.

• Do alkoholu ostrożnie wprowadzono rzeżuchę
  i ogrzewano jeszcze przez 4 minuty.

1. Usunięcie chlorofilu, lipidów i karotenoidów:

• Zawartość kolb schłodzono i odrzucono roztwór alkoholowy (którego objętość nie została zmierzona).

• Materiał roślinny dokładnie roztarto w moździerzu z dodatkiem 95% etanolu.

• Zawartość moździerza odsączono pod słabą próżnią przemywając osad 10 ml 95% skażonego etanolu oraz dwukrotnie 10 ml eteru naftowgo.

1. Usunięcie rozpuszczalnych nukleotydów:

• Osady dwukrotnie przemyto 10 ml schłodzonego 0,2M kwasu nadchlorowego.

• Do próbek dodano 95% alkoholu etylowego w celu usunięcia kwasu.

1. Hydroliza RNA do 2’- i 3’-mononukleotydów:

• Po skończonym sączeniu sączki z osadem przeniesiono do probówek wirówkowych.

• Do poróbówek dodano 5 ml 0,5M wodorotlenku potasu i wstawiono do łaźni wodnej o temperaturze 90⁰C na godzinę.

1. Wytrącenie DNA, białek oraz ścian komórkowych:

• Po skończonej inkubacji w łaźni wodnej próbówki wstawiono do łaźni lodowej na 10 minut regularnie mieszając.

• Do próbek dodano 5 ml schłodzonego 1M kwasu nadchlorowego i pozostawiono w lodzie jeszcze przez 15 minut.

1. Uzyskanie roztworów oczyszczonych 2’- i 3’-mononukleotydów:

• Próbki wirowano przez 7 minut przy 10 000 obrotach/min w temperaturze pokojowej.

• Powstały supernatant zdekantowano do cylindrów i zmierzono objętości:

1. Sekcja 1: 9,0 ml

2. Sekcja 2: 9,2 ml

1. Pomiary i ilościowe oznaczenie RNA:

• W każdej sekcji do probówek pobrano po 1 ml otrzymanego roztworu RNA i dodano po 3 ml wody destylowanej. Całość wymieszano.

• Próbki poddano pomiarowi absorbancji w spektrofotometrze przy falach o długości 260 i 300 nm. Próbę ślepą stanowiła woda destylowana.

Wyniki pomiarów:

	Absorbancja dla 260nm	Absorbancja dla 300nm
	Pomiar 1	Pomiar 2
Sekcja 1	0,507	0,531
Sekcja 2	0,250	0,257

Wzrór na wyliczenie ilości RNA:

mg RNA  =  0, 031 * (A₂₆₀−A₃₀₀) * (rozciencznie * ml RNA)

	Ilość RNA [mg]	Zawartość RNA w naważce [%]
Sekcja 1	0,504	0,149
Sekcja 2	0,244	0,078

Wnioski:

Procentowa zawartość RNA w obu sekcjach jest zaniżona w stosunku
do spodziewnych wyników zaproponowanych w instrukcji. Wynik sekcji 1 (0,149%) mieści się w przedziale 0,1%-0,2% dla roślin dorosłych, jednak w doświadczeniu użyto pędów rozwijających się roślin, dla których to stężenie powinno być wyższe. Wynik sekcji 2 znajduje się poniżej tego przedziału.

Zaniżenie wyników może być spowodowane wysoką zawartością wody w młodych roślinach, a także użyciem w ćwiczeniu uproszczonej procedury Schmidta i Thannhausera, w której 8h inkubacji w temperaturze 37⁰C zostało zastąpione jednogodzinną w temp. 90⁰C. Tak znaczne skrócenie zasadowej hydrolizy pozostałości tkankowej mogło skutkować niepełnym wyodrębnieniem RNA w postaci 3’- i 2’-mononukleotydów. Wpływ mogło mieć również przepłukiwanie kuwet do spektofotometru wodą destylowaną zamiast badaną próbą, co mogło rozcieńczyć stężenie badanych związków.

Rozbieżność wyników sekcji 1 i 2 prawdopodobnie wynika z mniejszego stopnia rozdrobnienia materiału roślinnego sekcji 2. Część RNA nie została przeniesiona do roztworu (supernatantu) podczas wirowania.

Oryginalna metoda Schmidta-Thanhausena jest stosowana do tkanek zwierzęcych. Przygotowanie tkanek polega na rozdrobnieniu materiału do badań, następnie 3-krotnej ekstrakcji silnie oziębionego homogenatu kwasem tricholorooctowym, co pozwala usunąć związki fosforowe rozpuszczalne w kwasach. Następnie usuwane są fosfolipidy, przez przepłukiwanie etanolem i gorącą mieszaniną etanol/chloroform.

Kolejnym krokiem jest hydroliza zasadowa pozostałości przy użyciu 1M roztworu NaOH przez ok. 8h w temperaturze 38^oC.

Do roztworu dodawany jest roztwór HCl w celu zobojętnienia użytego wcześniej NaOH. Następnie dodawany jest kwas tricholorooctowy, aby wytrącić DNA z roztworu. Po odwirowaniu w temperaturze 0^oC RNA w postaci nukleotydów jest zawieszony w supernatancie wraz z fosforem nieorganicznym pochodzenia nienukleotydowego. Przy zastosowaniu tej metody można również wyodrębnić DNA w następnych krokach.

W skróconej metodzie stosowanej na zajęciach zmieniono przygotowanie tkanki do hydrolizy zasadowej, gdyż użyto tkankę roślinną zamiast zwierzęcej. Konieczne było usunięcie barwników zawartych w tym materiale. Sama hydroliza zasadowa została skrócona do 1h, za to podniesiono temperaturę
do 90^oC. Usunięcie zasady osiągnięto przez użycie etanolu. Do wytrącenia DNA
i białek wykorzystano kwas nadchlorowy, zamiast tricholorooctowego.