Metody oznaczeń ilościowych w HPLC i GC.

Chromatografia kolumnowa:

-parametry retencji

-ocena sprawności kolumny chromatograficznej

Chromatografia kolumnowa może być gazowa lub cieczowa. Cząsteczki mieszaniny muszą różnić się między sobą powinowactwem do fazy stacjonarnej np. wielkością cząsteczek. Najpierw wycieka z kolumny związek charakteryzujący się brakiem powinowactwa do fazy stacjonarnej. Sercem chromatografii jest kolumna znajdująca się w piecu chromatograficznym.

Budowa:

• pojemnik z solwentem

• pompa

• dozownik

• kolumna

• detektor→ chromatograf-graficzny obraz rozdziału chromatograficznego→1 pik = 1 składnik; oś x = czas retencji

Współczynnik podziału ( stosunek podziału, stała podziału, współczynnik retencji)

$$k = \frac{n_{s\ }(1\ \text{mol}\ \text{substancji}\ w\ \text{fazie}\ \text{stacjonarnej})}{\begin{matrix} n_{r}\left( 1\ \text{mol}\ \text{substancji}\ w\ \text{fazie}\ \text{ruc}h\text{omej} \right)\text{\ \ \ \ \ \ \ \ } \\ \\ \end{matrix}}$$

$$k = \frac{V_{r} - V_{0}}{V_{0}}$$

$$k = \frac{t_{r} - t_{0}}{t_{\begin{matrix} 0 \\ \ \\ \end{matrix}}}$$

t₀- czas martwy

t_rA- mniejsze powinowactwo

t_rB- większe powinowactwo

k- decyduje o tym czy związek zatrzymywany jest wolniej czy szybciej w kolumnie

Parametry retencji

t_r (V_r)_- całkowity czas retencji(objętość retencji)

t₀(V₀)-zerowy czas retencji(zerowa objętość retencji)

t’_r(V’_r)- zredukowany czas retencji( zredukowana objętość retencji)

t′_r = t_r − t₀

W_b – szerokość piku u podstawy

W_1/2- szerokość piku w połowie wysokości

h- wysokość piku

h_1/2- połowa wysokości piku

V_r = t_r • F

F- objętościowa prędkość przepływu fazy ruchomej przez kolumnę mierzona w ml/min

Wpływ parametrów kolumny na jakość rozdziału chromatograficznego- sprawność kolumny

Parametry:

H- wysokość równoważna półce teoretycznej (WRPT)

N- liczba półek teoretycznych

N_ef- efektywna liczba półek

L- długość kolumny w cm

Liczba półek teoretycznych

$N = 5,54{(\frac{t_{r}}{W_{\frac{1}{2}}})}^{\begin{matrix} 2 \\ \ \\ \end{matrix}}$

Im większa wartość tym lepiej

$$N = 16({\frac{t_{r}}{W_{b}})}^{2}$$

$$N = 5,54{(\frac{{t'}_{r}}{W_{\frac{1}{2}}})}^{\begin{matrix} 2 \\ \ \\ \end{matrix}}$$

Wysokość równoważna półce teoretycznej

$H = \frac{L}{N}$ → im mniejsza wartość tym lepiej

Sprawność kolumny- liczba półek przypadająca na metr kolumny

Sprawność kolumny = N*100/L

Zdolność rozdzielcza kolumny- R_s

$$R_{s} = \frac{2(t_{r}^{B} - t_{r}^{A})}{\begin{matrix} W_{b}^{B} + W_{b}^{A} \\ \ \\ \end{matrix}}$$

$$R_{s} = \frac{1,77(t_{r}^{B} - t_{r}^{A})}{W_{1/2}^{B} + W_{1/2}^{A}}$$

Optymalne wartości>1,2

A-składnik eluowany jako pierwszy( krótszy czas retencji)

B- składnik eluowany jako drugi( dłuższy czas retencji)

Analiza ilościowa w chromatografii kolumnowej:

Chromatografia jest jedną z nielicznych metod, która umożliwia wykonanie analizy ilościowej i jakościowej złożonych mieszanin w jednym procesie.

O ilości substancji w mieszaninie można wnioskować na podstawie wielkości odpowiadającego jej piku, gdyż wysokość(h) lub częściej powierzchnia piku(s) są proporcjonalne do ilości oznaczanego składnika.

S=h*W_1/2

S=0,5*W_N

S=AUP- (area under peak)- powierzchnia piku

Pole pow. piku wzrasta wraz ze wzrostem nakładanej substancji.

Współczynnik korekcyjny względny (f)

• pozwala na skorygowanie błędu wynikającego z tego, iż różne masy różnych substancji nie zawsze dają jednakowe pole powierzchni piku (błąd wynika np. z różnic wskazań detektora)

• współczynnik korelacyjny- liczba przez którą należy pomnożyć powierzchnię piku związku „i” aby skorygowana w ten sposób wartość powierzchni była wprost proporcjonalna do masy związku „i”, jeśli nie ma to przyjmujemy, że 1 wynosi

• jeśli nie mamy możliwości wyznaczenia współczynnika f, wtedy przyjmujemy, że dla wszystkich związków f=1

• wartość współczynnika korelacyjnego można zaczerpnąć z literatury lub wyznaczyć empirycznie

Wyznaczanie współczynnika korekcyjnego:

• jako substancję porównawczą (wzorzec) przyjmuje się główny składnik badanej próby- jego f=1

• sporządza się mieszaninę wzorcową złożoną z równych mas wszystkich składników (i) analizowanej próbki

• f₁ wyznaczamy ze wzoru:

$$f_{i} = \frac{S_{w}}{S_{i}}$$

Współczynnik korekcyjny charakterystyczny dla substancji (stf)

• substancją porównawczą jest benzen dla którego stf=1

$$\text{stfi} = \frac{\%\ \text{mas}\ i*s\ \text{benzenu}}{\%\text{masy}\ \text{benzenu}*\text{si}}$$

Si* stfi- skorygowana wartość powierzchni piku odpowiadająca masie substancji „i”

Istota chromatograficzna analizy ilościowej polega na porównaniu wielkości piku oznaczanego składnika (i) z wielkością piku odpowiadającego znanej ilości tego składnika (i) w postaci substancji wzorcowej.

Metody:

1. normalizacji wewnętrznej

2. wzoraca zewnętrznego(krzywa kalibracyjna, kalibracja bezwzględna)

3. wzorca wewnętrznego(wzorcem jest analizowana substancja, wzorcem jest substancja nieobecna w analizowanej próbce)

często wyrażenie „wzorzec” wyraża się wyrażeniem „standard”= serodtandard

Normalizacja wewnętrzna:

• wymaga aby na chromatografie znajdowały się piki odpowiadające wszystkim składnikom obecnym w próbce

• znając pole powierzchni oznaczanego składnika można obliczyć jego procent zawartości w próbce

$$\% = \frac{s_{i}}{\sum_{}^{}s} \bullet 100$$

$$\%\text{masi} = \frac{\text{sifi}}{\sum_{}^{}\text{sf}} \bullet 100$$

• mierzy się powierzchnie wszystkich pików i sumuje; suma=100%

Kalibracja bezwzględna:

• można użyć wtedy gdy nie wszystkie składniki są zaznaczone w postaci pików na chromatogramie

• dla danego składnika sporządza się 3-5 roztworów wzorcowych o różnym stężeniu. Wzorzec musi odpowiadać składnikowi oznaczanemu. Najważniejsze jest równanie prostej

• kilkakrotnie wykonuje się analizę chromatograficzną tych roztworów i oblicza średnią powierzchnię pików(s)

Metoda wzorca wewnętrznego(wzorzec = substancja nieobecna w analizowanej próbce):

Gdy wzorcem jest substancja nieobecna w analizowanej próbce:

• stosuje się wzorzec zbliżony strukturalnie do związku obecnego w próbce. Warunkiem jest rozdzielenie się wzorca i analizowanego składnika(i) podczas rozdziału chromatograficznego

• przygotowuje się roztwór kalibracyjny zawierający mniej więcej równe ilości wzorca oznaczanego składnika(wi) oraz wzorca wewnętrznego(ww)→ roztwór posłuży do wyznaczenia współczynnika odpowiedzi (r_f)

• do dokładnie znanej ilości próby badanej dodaje się wzorca wewnętrznego w takiej samej ilości jak w roztworze kalibrowanym→roztwór posłuży do ilościowego oznaczenia składnika w próbie badanej

Wyznaczanie współczynnika odpowiedzi i obliczanie stężeń oznaczanego składnika w próbce badanej:

• współczynnik odpowiedzi dla roztworu kalibracyjnego oblicza się ze wzoru:

$\text{rf} = \frac{s_{\text{ww}}}{s_{\text{wi}}} \bullet \left\lbrack w_{i} \right\rbrack$

• opisując ta samą zależność dla próbki badanej uzyskujemy:

$\text{rf} = \frac{s_{\text{ww}}}{s_{i}} \bullet \left\lceil i \right\rceil$→stężenie oznaczanego składnika

$\left\lbrack i \right\rbrack = \text{rf} \bullet \frac{s_{i}}{s_{\text{ww}}}$→pole powierzchni piku wzorca wewnętrznego

Gdy wzorcem jest analizowana substancja

• wykonuje się 2 chromatogramy

  • badanej próbki

  • badanej próbki do której dodano ściśle określoną ilość wzorca będącego jednocześnie oznaczaną substancją

• przyrost odpowiedzi detektora dla analizowanego składnika jest proporcjonalny do ilości dodanego wzorca

• mierzymy powierzchnię piku analitu - wzorzec A oraz innego analizowanego składnika B w próbce bez dodatku wzorca i próbce badanej

• Dla próbki bez dodatku wzorca:

$$\frac{\mathbf{m}_{\mathbf{A}}}{\mathbf{m}_{\mathbf{B}}}\mathbf{=}\frac{\mathbf{S}_{\mathbf{A}}}{\mathbf{S}_{\begin{matrix} \mathbf{B} \\ \mathbf{\ } \\ \end{matrix}}}$$

• Dla próbki z dodanym wzorcem:

$$\mathbf{m}_{\mathbf{A}}\mathbf{=}\frac{\mathbf{m}_{\mathbf{\text{wz}}}\mathbf{S}_{\mathbf{A}}{\mathbf{S}_{\mathbf{B}}}_{}^{\mathbf{*}}}{\mathbf{S}_{\mathbf{A}}^{\mathbf{*}}\mathbf{S}_{\mathbf{B}}\mathbf{-}\mathbf{S}_{\mathbf{A}}\mathbf{S}_{\mathbf{B}}^{\mathbf{*}}}$$

$$\mathbf{m}_{\mathbf{B}}\mathbf{=}\mathbf{m}_{\mathbf{A}}\frac{\mathbf{S}_{\mathbf{B}}}{\mathbf{S}_{\mathbf{A}}}\mathbf{\text{\ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ }}\frac{\mathbf{m}_{\mathbf{A}}\mathbf{-}\mathbf{m}_{\mathbf{\text{wz}}}}{\mathbf{m}_{\mathbf{B}}}\mathbf{=}\frac{\mathbf{S}_{\mathbf{A*}}}{\mathbf{S}_{\mathbf{B*}}}$$