1. GLEBA- Mikroflora gleby

O rozwoju mikroorganizmów w glebie decydują części stałe, zawierające związki mineralne i substancje organiczne (ok. 50% gleby), powietrze glebowe (ok. 35%) oraz roztwór glebowy (ok. 15%). Mikroflora gleby jest bardzo bogata i stanowi najszybciej rosnący i reagujący na zmiany parametrów środowiska składnik jej biocenozy.

Drobnoustroje odgrywają w glebie dwojaką rolę:

• rozmnażają się i metabolizują materię organiczną, tworząc biomasę własnych komórek oraz nagromadzają substancje, które tworzą próchnicę,

• rozkładają i mineralizują związki organiczne, przez co wprowadzają w ponowny obieg pierwiastki niezbędne do produkcji roślinnej.

Do najpospolitszych i najczęściej występujących drobnoustrojów w glebach i na roślinach należą organotroficzne bakterie z rodzajów Bacillus, Enterobacter, Micrococcus oraz wirusy. Istotną rolę odgrywają bakterie wiążące azot atmosferyczny i prowadzące przemiany azotu mineralnego oraz organicznego, m.in. z rodzajów Nitrobacter, Pseudomonas, Serratia oraz beztlenowce Clostridium. Pod względem zawartości w glebie drugą grupę po bakteriach właściwych stanowią organotroficzne promieniowce, których przedstawiciele z rodzajów Nocardia i Streptomyces wykazują uzdolnienia do rozkładu celulozy, lignin oraz różnych połączeń aromatycznych. Szeroko rozpowszechnione w glebach uprawnych są grzyby organotroficzne, przedstawiciele klas grzybów niedoskonałych, glonowców, workowców oraz drożdże z rodziny Sąccharomycetaceae i Cryptococcaceae.

Promieniowce – są szeroko rozpowszechnione w przyrodzie, w tym także jako organizmy glebowe. Organizmy prokariotyczne tworzące rząd Gram+ bakterii. Występują licznie w glebach, kompostach czy torfie. Preferują gleby zasadowe i obojętne. W glebach dominują gatunki z rodzaju Streptomyces, które biorą udział w rozkładzie glebowej materii organicznej. Niektóre gatunki współżyją z roślinami wyższymi w procesie wiązania azotu atmosferycznego. Promieniowce wytwarzają antybiotyki, barwniki czy witaminy.

BAKTERIE Z RODZAJU CLOSTRIDIUM W GLEBIE

Sterylizacja- proces polegający na zniszczeniu wszystkich zarówno wegetatywnych, przetrwalnikowych oraz zarodnikowych form mikroorganizmów. Ogrzewanie do temperatury powyżej 100 ^oC.

Pasteryzacja – technika pasteryzacji za pomocą odpowiednio dobranego podgrzania produktów spożywczych, tak aby zniszczyć lub zahamować wzrost drobnoustrojów chorobotwórczych lub enzymów, przy jednoczesnym zahamowaniu smaku produktów i uniknięciu obniżenia ich wartości odżywczej. Głównym zadaniem pasteryzacji jest przedłużenie trwałości produktów poprzez unieszkodliwienie dorm wegetatywnych mikroorganizmów. Proces ten nie niszczy form przetrwalnikowych, ani większości wirusów. Ogrzanie do temp powyżej 70 a nie większej niż 100 ^oC.

Tyndalizacja – metoda konserwacji żywności, która polega na 3-krotnej sterylizacji przeprowadzonej co 24h.

ROZKŁAD SUBSTANCJI ORGANICZNYCH W GLEBIE

• Rozkład celulozy

POŻYWKA Z CELULOZĄ – (woda + agar + pepton + celuloza) służy do badania uzdolnień celulolitycznych mikroorganizmów. Po zalaniu płynem Lugola w przypadku hydrolizy celulozy występuje strefa przejaśnień wokół kolonii.

• Rozkład skrobi

POŻYWKA ZE SKROBIĄ – (woda + agar + pepton + skrobia rozpuszczalna) służy do badania uzdolnień amylolitycznych drobnoustrojów. W przypadku hydrolizy skrobi przez mikroorganizmy, po zalaniu płynem Lugola obserwujemy strefy przejaśnienia wokół kolonii (hydroliza skrobi do achrodekstryn, nie barwiących się z jodem, maltozą i glukozą)

• Rozkład białek

POŻYWKA Z MLEKIEM- (agar + roztwór wody z mlekiem) służy do badania uzdolnień proteolitycznych mikroorganizmów. W przypadku hydrolizy kazeiny obserwujemy przejaśnienia wokół kolonii.

• Rozkład tłuszczu

POŻYWKA Z Tween80 i CaCl₂ – (woda destylowana + pepton + agar + CaCl₂ + Tween + NaCl) służy do badania uzdolnień lipolitycznych mikroorganizmów. W przypadku zdolności mikroorganizmów do rozkładu tłuszczu obserwujemy strefy zmętnienia wokół kolonii.

1. POWIETRZE - Ocena czystości mikrobiologicznej powietrza.

Drobnoustroje w powietrzu rzadko występują w postaci wolnej, zwykle jako bioaerozole.

Bioaerozol - to układ dwu- lub trójfazowy, składający się z fazy rozpraszającej (powietrza) i rozproszonej (drobne cząsteczki płynu lub substancji stałych zawierające pyłki roślin, zarodniki grzybów, komórki bakterii, drożdży i wirusy). Drobnoustroje, przyczepione do cząstek kurzu i pyłu lub mikrokropelek płynów, mogą przebywać w powietrzu bardzo długo.

Saprofityczną mikroflorę powietrza stanowią: ziarniaki z rodzaju Micrococcus i Sarcina wytwarzające barwniki, gronkowce białe, pałeczki Alcaligenes, tlenowe laseczki przetrwalnikujące z rodzaju Bacillus.

W pomieszczeniach zamkniętych oraz w powietrzu atmosferycznym występują zarodniki grzybów strzępkowych z rodzaju Cladosporium, Penicillium, Aspergillus, Alternaria, Botrytis, czy Rhizopus i Mucor oraz drożdże Rhodotorula, Torulopsis i Candida. Liczba zarodników pleśni i komórek bakterii w powietrzu atmosferycznym zależy od sezonu, warunków pogodowych, wysokości nad poziomem morza.

Bakterie chorobotwórcze, tj. gronkowiec złocisty (Staphylococcus aureus), pałeczka ropy błękitnej (Pseudomonas aeruginosą), a także paciorkowce z rodzaju Enterococcus i Streptococcus przedostają się do powietrza z jamy nosowo-gardłowej, zakażonych ran czy bielizny szpitalnej.

Oznaczanie stopnia zakażenia powietrza

Analiza powietrza prowadzona jest w oparciu o obecność tzw. wskaźników bakteriologicznego zanieczyszczenia powietrza. Są to gatunki lub rodzaje wytypowane jako przedstawiciele mikroflory pochodzącej z określonych zanieczyszczeń – gleby, wód powierzchniowych, od ludzi i zwierząt.

Wskaźniki bakteriologicznego zanieczyszczenia powietrza:

• z przewodów oddechowych człowieka – gronkowce i paciorkowce hemolizujące Staphylococcus albus, Streptococcus salivarius, Streptococcus viridans,

• cząstkami gleby – promieniowce,

• cząstkami wód powierzchniowych – Pseudomonas fluorescens.

Powietrze- jest środowiskiem niesprzyjającym rozwojowi drobnoustrojów co nie oznacza, że mikroorganizmy tam nie występują. Drobnoustroje dostają się do powietrza z gleby, wody, powierzchni roślin, wydalin ludzi i zwierząt. W powietrzu spotyka się przedstawicieli wszystkich grup drobnoustrojów. Niektóre komórki giną w wyniku wysuszenia lub działania promieni ultrafioletowych, inne są przenoszone z prądami powietrza. Liczba drobnoustrojów w powietrzu jest jednym z ważnych mierników zanieczyszczenia atmosfery w przestrzeni otwartej i w pomieszczeniach zamkniętych. Liczba drobnoustrojów w pomieszczeniach, szczególnie o dużym zagęszczeniu ludzi i sprzętów, jest wielokrotnie większa niż w

powietrzu w miejscach odkrytych. W pomieszczeniach znajduje się szczególnie dużo drobnoustrojów chorobotwórczych wydzielanych ze śliną, przy kichaniu i kaszlu. Wyniku badań nad zawartością drobnoustrojów w powietrzu służba zdrowia uzyskuje ocenę stanu sanitarnego atmosfery.

ANALIZA MIKROBIOLOGICZNA POWIETRZA:

Metoda sedymentacyjna KOCHA (opadają tylko najcięższe) - metoda oznaczania liczby drobnoustrojów w określonej objętości powietrza ma charakter jedynie orientacyjny - nie jest metodą ilościową w ścisłym znaczeniu tego słowa. Jednak ze względu na prostotę wykonania bywa często stosowana w praktyce. W metodzie tej wykorzystuje się zjawisko opadania drobnoustrojów będących w powietrzu i osadzania się ich na przygotowanym podłożu hodowlanym. Żywe komórki drobnoustrojów, znajdują w podłożu warunki do życia, rozmnażają się i tworzą kolonie dostrzegalne przy użyciu niewielkich powiększeń, a nawet gołym okiem. Oznaczenie liczby drobnoustrojów w określonej objętości powietrza opiera się na obserwacjach z których wynika, że liczba kolonii, które wyrosły na 100 cm2 podłoża po 5-minutowym kontakcie podłoża z powietrzem równa jest w

przybliżeniu liczbie drobnoustrojów zawartych w 10 dm3 powietrza.

• Dla oznaczenia liczby bakterii z agarem odżywczym z histydyną

• Dla oznaczenia grzybów pleśniowych i drożdży z agarem brzeczkowym z chloramfenikolem

Metoda zderzeniowa z zastosowaniem próbnika MAS100 – (zasysane powietrze do środka) za pomocą pompy ssącej pobiera się próbę powietrza o określonej objętości na płytkę agarową przez wąską szczelinę lub dyszę.

OCENA CZYSTOŚCI MIKROBIOLOGICZNEJ POWIETRZA

Metoda sedymentacyjna KOCHA

$$\mathbf{X}_{\mathbf{1}\left( \mathbf{2} \right)}\mathbf{=}\frac{\mathbf{A}_{\mathbf{1(2)}}\mathbf{*\ }\mathbf{10}^{\mathbf{4}}}{\mathbf{b*k}}$$

A₁- liczba kolonii bakterii

A₂- liczba kolonii grzybów

b- powierzchnia płytki Petriego cm² (лr²)

k- współczynnik czasu ekspozycji

1. WODA- Analiza mikrobiologiczna wody wodociągowej.

Mikroflora wód nie jest jednorodna dla wszystkich środowisk. Pierwszym z czynników warunkujących jej różnorodność jest rodzaj zbiornika wodnego: jego wielkość, czy jest stojący, czy płynący, powierzchniowy czy głębinowy. Kolejnymi są czynniki abiotyczne (fizyczne i chemiczne), jak energia świetlna, temperatura, ruch wody i skład chemiczny wody, oraz czynniki biotyczne (biologiczne), wynikające ze wzajemnych współzależności organizmów.

Mikroorganizmy wskaźnikowe stanu sanitarnego wody muszą spełniać warunki:

• być stale obecne w dużych i stałych ilościach w przewodzie pokarmowym zwierząt (w tym człowieka)

• ich identyfikacja musi być bezpieczna i możliwa przez zastosowanie łatwych i tanich testów

• ich czas przeżycia w wodzie musi być dłuższy niż wszystkich mikroorganizmów chorobotwórczych

• muszą wykazywać taką samą wrażliwość na preparaty dezynfekcyjne i temperaturę pasteryzacji jak drobnoustroje chorobotwórcze

• ich liczebność powinna być proporcjonalna do stopnia zanieczyszczenia kałowego

• nie powinny rozmnażać się w wodzie

Takie warunki spełniają bakterie:

• Escherichia coli (pałeczki okrężnicy) - występuje u zwierząt (w tym człowieka) w ilości 10⁶-10⁸/g kału

• Enterokoki fekalne (Enterococcus faecium, E. faecalis) - występują u człowieka w ilości 10⁵-10⁶/g kału; są dosyć wrażliwe na warunki środowiska i często giną szybciej niż bakterie chorobotwórcze; ich obecność świadczy o świeżym zanieczyszczeniu kałem

Podczas analiz mikrobiologicznych wody niemożliwe jest badanie wszystkich organizmów chorobotwórczych, dużo łatwiej jest analizować tzw. mikroorganizmy wskaźnikowe, które dostają się do wody z wydalinami ludzkimi lub zwierzęcymi. Badania mikroflory jelitowej ustaliły stałe występowanie trzech różnych rodzajów bakterii wskaźnikowych, świadczących o kontakcie wody z fekaliami lub ściekami:

• pałeczki okrężnicy Escherichia coli,

• paciorkowców kałowych z typowym gatunkiem Enterococcus faecalis,

• beztlenowców przetrwalnikujących Clostridium perfringens.

Stwierdzenie zawartości bakterii z grupy coli powyżej normy świadczy o fekalnym zanieczyszczeniu wody, a tym samym o możliwości występowania bakterii chorobotwórczych.

ANALIZA MIKROBIOLOGICZNA WODY WODOCIĄGOWEJ

1. oznaczenie ogólnej liczby bakterii mezofilnych i psychrofilnych metodą płytkową na pożywce bulionowej.

2. Oznaczenie bakterii grupy coli w wodzie metodą filtracji membranowej. Po przefiltrowaniu wody i przemyciu filtra solą fizjologiczną umieścić go na pożywce TTC z tergitolem. (72h/32^oC)

Pożywka TTC z tergitolem (woda destylowana, sole tetrazolowe, laktoza, glukoza, tergitol, błękit bromotymolowy) zakres działania obejmuje podłoże różnicujące dla bakterii grupy coli. Podłoże początkowo zielone, po wytworzeniu kwasów z laktozy następuje obniżenie pH, co skutkuje zmianą zabarwienia pożywki na kolor żółty.

TERGITOL- hamuje wzrost bakterii Gram+

TTC- chlorek 2,3,5-trifenylotetrazolu – wskaźnik redox. Bakterie Laktoza- tworzą ciemnoczerwone zabarwienie. Jest wchłaniany do wnętrza komórki.

1. Oznaczanie liczby pałeczek Escherichia coli w wodzie metodą filtracji membranowej. Po przefiltrowaniu wody i przemyciu filtra solą fizjologiczną umieścić go na pożywce TTC z tergitolem. (72h/44^oC)

2. Oznaczenie liczby enterokoków kałowych (paciorkowce kałowe) w wodzie metodą filtracji membranowej. Po przefiltrowaniu wody i przemyciu filtra solą fizjologiczną umieszcza się go na agarze selektywnym wg Slanetz’a Bartley’a. (72h/37^oC)

Agar selektywny wg. Slanetz’a Bartley’a – (woda destylowana + pepton + ekstrakt drożdżowy, K₂HPO₄, agar, glukoza, azydek sodowy, chlorek tetrazoliowy TTC). Podłoże wybiórczo-różnikujące dla paciorkowców kałowych. Enterokoki rosną w postaci drobnych ciemnoczerwonych kolonii (redukcja TTC do nierozpuszczalnego czerwonego barwnika). Azydek sodu hamuje wzrost bakterii Gram-.

1. W przypadku wątpliwości wykonuje się posiew na podłoże Endo oraz próby biochemiczne np. na wytwarzanie indolu.

BADANIA POTWIERDZAJĄCE DLA BAKTERII GRUPY COLI :

• Badania potwierdzające należy wykonać przesiewając bakterie jałowa ezą z podłoża laktozowego na pożywkę Endo. Inkubacje należy prowadzić w temp. 37°C w ciągu 24 godzin.

Bakterie grupy coli rosną na pożywce Endo w postaci ciemnoczerwonych kolonii o metalicznym (fuksynowym) połysku. W przypadku obecności chociażby jednej takiej kolonii na pożywce Endo, wynik badania potwierdzającego należy uznać za dodatni.

• Badanie zdolności do wytwarzania przez badane bakterie indolu z tryptofanu. Probówki zawierające wodę peptonową z tryptofanem szczepi się 1 ml badanej wody bezpośrednio lub z rozcieńczenia. Po 24-godzinnej inkubacji w odpowiedniej temperaturze nanosi się po ściance kilka kropel odczynnika Kavacs’a, który w obecności indolu barwi się na czerwono-różowy.

• Określanie obecności oksydazy cytochromowej w komórkach bakterii Pseudomonas sp., Enterobacter aerogenes, Escherichia coli. Pobierany materiał biologiczny za pomocą ezy ze skosu z czystą kulturą i równomiernie rozprowadza się na części reakcyjnej paska tetrowego Bactident (R)Oxidase test. Pojawienie się po 20-60s niebieskiego zabarwienia świadczy o obecności oksydazy.

1. SUROWIEC- Naturalny układ mikroflory w surowcach pochodzenia roślinnego i zwierzęcego.

Fermentacja octowa- silne zakwaszenie środowiska, zapach kwasu octowego, obecność pałeczek octowych.

Fermentacja mlekowa- zakwaszenie środowiska, „kwaśny zapach”, obecność pałeczek lub paciorkowców mlekowych.

Fermentacja masłowa- nieznaczne zakwaszenie środowiska, gazowanie , ostry zapach kwasu masłowego, obecność ruchliwych laseczek (obserwacja w preparacie wykonanym z materiału pobranego z dna probówki).

Fermentacja alkoholowa- gazowanie, zapach alkoholu, obecność drożdży.

Proteoliza – alkalizacja środowiska spowodowana wydzielaniem amoniaku, ostry zapach amoniaku, obecność ruchliwych pałeczek oraz laseczek.

Różnice metaboliczne widoczne są w sferze metabolizmu glukozy:

Eschericha coli prowadzi fermentację kwasową:

Produkty: kwaśne : obojętne 4: 1

CO₂ : H₂ 1:1

podczas gdy Enterobacter aerogenes fermentację butandiolową:

Produkty: kwaśne : obojętne 1 : 6

CO₂ : H₂ 5 : 1

1. Ocena sanitarna warunków produkcji.

Kontrola czystości mikrobiologicznej rąk:

• Metoda wymazowa

• Metoda tamponowa

1. Oznaczenie ogólnej liczby drobnoustrojów na agarze odżywczym

AGAR ODŻYWCZY- (penton + NaCl + agar + wyciąg mięsny) jest to podstawowe podłoże namnażające.

1. Pożywka płynna BLB w celu stwierdzenia obecności bakterii grupy coli

POŻYWKA BLB- (laktoza + zieleń brylantowa + woda destylowana + pepton + ekstrakt żółci w proszku lub soli żółciowych) rozlewana do probówek z rurką Durhama. Początkowo pożywka jest zielona po inkubacji 37 ^oC jeżeli są obecne bakterie grupy coli zmienia zabarwienie żółte i gazowanie widoczne gołym okiem w rurce Durhama.

1. Pożywka wg. Burzyńskiej w celu stwierdzenia obecności paciorkowców kałowych (enterokoków)

POŻYWKA WG. BURZYŃSKIEJ – (azydek sodu + fiolet krystaliczny + purpura bromokrezolowa + woda destylowana +pepton ) wyraźna zmiana barwy pożywki z fioletowej na żółtą wskazuje, że w analizowanej próbie znajdują się paciorkowce fekalne.

Kontrola czystości mikrobiologicznej dowolnej powierzchni z zastosowaniem szablonu

Kontrola czystości mikrobiologicznej naczyń i opakowań

• Zastosowanie pożywki na naczyniach

• Metoda popłuczyn

• Metoda wymazu (bezpośrednia)

Monitoring stanu higieny dowolnej powierzchni metodą kontaktową (odciskową) z zastosowaniem testów łopatkowych.

Nie obliczamy wyrosłych bakterii/ grzybów/ pleśni, tylko porównujemy z wzorcami.

Efekt dyfuzyjny

$$\mathbf{\text{Y\ }}\left( \mathbf{\%} \right)\mathbf{= \ 100 - (}\frac{\mathbf{B}}{\mathbf{A}}\mathbf{*100)}$$

100- założenie że zanieczyszczenie mikrobiologiczne badanego obiektu przed myciem (dezynfekcją) wynosi 100%

B- stan zanieczyszczenia po myciu (dezynfekcji)

A- stan zanieczyszczenia przez myciem (dezynfekcją)

1. ŻYWNOŚĆ - Analiza mikrobiologiczna żywności.

Żywność – definicja żywności została podana w Rozporządzeniu Nr 178/2002 Parlamentu Europejskiego i Rady z dnia 28 stycznia 2002 r. w artykule 2:

• „żywność” (lub „środek spożywczy”) oznacza jakiekolwiek substancje lub produkty, przetworzone, częściowo przetworzone lub nieprzetworzone, przeznaczone do spożycia przez ludzi, lub których spożycia przez ludzi można się spodziewać.

• „Środek spożywczy” obejmuje napoje, gumę do żucia i wszelkie substancje, łącznie z wodą, świadomie dodane do żywności podczas jej wytwarzania, przygotowania lub obróbki..

Do żywności, w tym znaczeniu, nie zalicza się m. in. pasz, produktów leczniczych, kosmetyków, tytoniu i wyrobów tytoniowych, środków odurzających.

Termin "żywność" ("środek spożywczy") ma w tym znaczeniu węższy zakres niż termin "produkt spożywczy", nie wszystko, co jest spożywane przez ludzi (np. leki, wyroby tytoniowe, środki odurzające) jest żywnością

Metodyka podstawowych analiz mikrobiologicznych żywności:

1. Wysiew metodą płytkową na podłoże PCA

• Podłoże PCA –(pepton, trypton, ekstrakt drożdży, glukoza, agar bakteriologiczny) służy do oznaczenia ogólnej liczby drobnoustrojów tlenowych rosnących w 30^oC – inkubacja w 30^oC przez 72h.

1. Wysiew metodą płytkową na podłoże DRBC lub DG18

• Podłoże DRBC –(di chloran, róż bengalski , chloromfenikol) służy do oznaczenia liczby drożdży i pleśni .

• Pożywka DG18 – (glicerol, chloramfenikol, di chloran, pepton, glukoza, siarczan magnezu, fosforan potasowy) do oznaczenia liczby kserofilnych pleśni z suszonych produktów żywnościowych.

• Pożywka YGC – pożywka namnażająca. G- glukoza źródło węgla, C- , Y- ekstrakt drożdżowy źródło witamin oraz dodatek 1,5% agaru aby można było wszystko zżelować.

1. Wysiew metodą NPL do bulionu EE

• Bulion EE – (podłoże z żółcią, zielenią brylantową, glukozą) służy do oznaczenia bakterii z rodziny Enterobacteriaceae.

1. Posiew redukcyjny materiału biologicznego z hodowli na bulionie EE na płytki z agarem VRBG

• Agar VRBG – agar z fioletem krystalicznym, czerwienią obojętną, żółcią i glukozą. Służy do określenia bakterii z rodziny Enterobacteriaceae.