Bioaktywne metabolity produkowane przez mikroorganizmy endofityczne
Wstęp: Farmaceuci i biotechnolodzy szukając nowych leków koncentrują się głównie na aktywnych substancji naturalnych. W wielu laboratoriach prowadzone są badania w tym zakresie z udziałem roślin, mikroorganizmów i organizmów morskich.
Endofity (endobionty) – drobne organizmy pasożytnicze, symbiotyczne lub komensaliczne, żyjące wewnątrz organizmów innych roślin, czyli mikroorganizmy bytujące w tkankach roślin.
Początek XXI wieku to czas zwrócenia uwagi na endofity. Aktualnie prowadzone są badania na temat biologii tych organizmów, ich taksonomii, zasad współbytowania z roślinami oraz ich ekologicznej roli.
Termin endofity uznano za obowiązujący w 1970 roku i odnosi się do mikroorganizmów, które podczas dłuższego lub krótszego okresu swojego cyklu życiowego kolonizują żywe wewnętrzne tkanki gospodarza czyli rośliny, w której bytują.
Funkcjonowanie endofitów: Endofity zaopatrują rośliny w energię, pożywki co owocuje przyspieszeniem wzrostu rośliny gospodarza. Większość endofitów ma zdecydowanie pozytywny wpływ na rozwój rośliny i jej obecność na stres wynikający np. z suszy, braku dostępu do światła, braku pożywek. Endofity stymulują wiązanie azotu przez rośliny, a najważniejszym czynnikiem jest kontrola biologiczna otoczenia tej rośliny (obrona rośliny przed patogenami).
W danej roślinie może bytować jeden gatunek endofitu, kilka lub cały zespół endofitów. Problemy metodycznie nie pozwalają przedstawić jednego stanowiska w tej sprawie. Mikroorganizmy te trudno się izoluje, a identyfikacja endofitów polega głównie na oznaczeniu sekwencji 16sRNA bezpośrednio z soku (ekstraktu) roślinnego.
Endofitami mogą być zarówno bakterie jak i grzyby. Zasiedlają wszystkie organy roślin od korzeni aż po płatki kwiatów i nasiona. Obecnie w nasionach endofity rozwijają się w kolejnej generacji rośliny.
Z badań prowadzonych nad substancjami chemicznymi uzyskiwanymi z ekstraktów roślinnych zasiedlonych i niezasiedlanych przez endofity wynika, że około 50% substancji, które mogą być wykorzystane w lecznictwie produkowane są przez rośliny. Druga połowa jest wynikiem działania endofitów. Są to wyniki szacunkowe. Problem komplikuje fakt, że stwierdzamy u kilku gatunków w wymianie informacji genetycznej. Wymiana informacji genetyczne między rośliną, a endofitem => Crossing.
Najsłynniejszy Endofit: Pastalotiopsis microspora (produkuje substancje biologicznie czynne).
Obecność tego mikroorganizmu stwierdzono w 15 różnych roślinach i ekstrakty z tych roślin poddano analizie chromatograficznej. Nie znaleziono dwóch identycznych chromatografów. Spektrum substancji biologicznie czynnej wytwarzanej przez ten mikroorganizm jest bardzo szeroki.
Możliwości przemysłowego wykorzystania endofitów:
1.Stymulacja wzrostu roślin
2. Ochrona biologiczna plantacji (zboża)
3.Przechowalnictwo żywności)
4. Fitoremediacjia
5. Medycyna ! (poszukiwanie leków przeciwnowotworowych, kardiologicznych)
Endofitom zawdzięczamy produkcję wielu związków: terpenoidy, fenole, ksantony, izokumaryny. Związki te są metabolitami specyficznymi, peryferyjnymi.
Mikrobiologiczna synteza biosurfaktantów
Biosurfaktanty to związki powierzchniowo –czynne produkowane przez bardzo dużą liczę mikroorganizmów, roślin (saponiny) oraz zwierząt (ssaków –kw.żółciowe).
Biosurfaktanty drobnoustrojowe mogą być gromadzone w komórce, związane ze ścianą komórkową, bądź wydzielone pozakomórkę. Ich synteza może zachodzić zarówno w fazie wzrostu jak i w fazie stacjonarnej. Produkowane są głównie w podłożach płynnych w obecności hydrofobowego substratu, takiego jak węglowodany czy oleje. Powodem syntezy tych związków jest ułatwienie przyswajania tych hydrofobowych substancji jako źródła węgla. Dzieje się to za sprawą specyficznej budowy biosurfaktantów. Mają budowę amfoteryczną i mają one w swej cząsteczce główkę hydrofilową i ogonek hydrofobowy: 0--------
Cząsteczka biosurfaktantu lokuje się na granicy faz hydrofobowej i hydrofilowej, powoduje emulgację związku hydrofobowego i zmniejsza napięcie powierzchniowe na granicy tych faz.
Dzięki emulgacji tworzą się mikrokrople (micele), które mogą być wchłaniane do komórek, a tym samym wykorzystanie jako źródło węgla i energii.
Istnieje drugi mechanizm przyswajania związków hydrofobowych polegający na tworzeniu makrokropli, a krople te zasiedlane są przez komórki mikroorganizmów dzięki biosurfaktantom kumulowanym na powierzchni komórek.
Podział biosurfaktantów:
1. Niskocząsteczkowe –mają zdolność obniżenia napięcia między fazowego
2. Wysokocząsteczkowe- to przede wszystkim emulgatory.
Pod względem chemicznym jedna i druga grupa biosurfaktantów obejmuje wiele grup związków i są to:
a) Niskocząsteczkowe biosurfaktanty:
- Glikolipidy, - Lipopeptydy i lipoproteiny, - Kwasy tłuszczowe, lipidy i fosfolipidy.
b) Wysokocząsteczkowe biosurfaktanty:
- Lipopeptydy i lipoproteiny, - Złożone glikolipidy, - Specjalne (Fimbrie, składniki struktur komórkowych).
Część hydrofilową stanowią węglowodany, estry; a część hydrofobową stanowią reszty kwasów tłuszczowych i fosfolipidy.
Biosurfaktanty syntetyzowane są w ramach przemian peryferyjnych i właściwa ich produkcja powinna zachodzić głównie w fazie stacjonarnej, jednakże w przypadku tych związków, które warunkują przyswajanie szerokiej gamy substratów (w tym hydrofobowych) ich synteza musi zachodzić już w fazie wzrostu.
Nie ma jednoznacznych wskazań na temat refulacji syntezy biosurfaktantów, a to z powodu różnorodności chemicznej i celów dla których są wytwarzane. Pewne ustalenia są jednak potrzebne:
Czynniki sprzyjające syntezie biosurfaktantów:
1. Podłoże płynne
2. Obecność hydrofobowego substratu (induktor)
3. Ograniczenie stężenia glukozy w podłożu (sprzężenie zwrotne, katabolizm represja)
4. Zwiększone zasolenie podłoża
5. Obecność wielowartościowych kationów
6. Dodatek specyficznych substancji (penicylina, chloramfenikol, EDTA)
7. Temperatura i pH
8. W syntezie ramnolipidów sprzyja obecność glicerolu, mannitolu i etanolu
9. Nieuporządkowane są dane dot. rodzaju źródła azotu i jego stężenia. Ten parametr zależy od biosurfaktantu.
Zdolność do efektywnej syntezy biosurfaktantu stwierdzono zarówno u drożdży (Candida), bakterii (Pseudomonas, Bacillus subtilis, B.lichenformis, Arthrobacter, Nocardia, Corynebacterium) oraz grzybów (Aspergillus, Penicillum, Fusarium)
Trzy rodzaje biosurfaktantów jest produkowanych na skalę przemysłową, choć pozostają one w dalszym ciągu droższe od syntetycznych odpowiedników. Wśród tych produktów jest ramnolipid- niskocząsteczkowy oraz emulsan i allasan.
Transformacja – przekształcenie, przeobrażenie.
Biotransformacja to jednoetapowe (rzadziej dwuetapowe) przekształcenie chemiczne egzogennych związków organicznych w strukturalnie im podobne produkty dokonywane przez żywą komórkę.
SP(S) (między enzym i komórka)
Biostransformacje - katalizowane przez enzymy reakcje chemiczne, w których następuje przekształcenie określonego(nych) fragmentu(ów) substratu. Biotransformacje u mikroorganizmów można porównać do "biokatalizatorów", które przeprowadzają przemiany prowadzące do otrzymania pożądanego produktu. Są to procesy wykorzystujące najczęściej tylko jeden enzym i nie dostarczają komórce energii ani potrzebnych związków.
Idea biotransforamcji jako bioprocesu
Biotransformacja nie jest celem działania komórki; zachodzi ona często jako proces niezależny od jej funkcji życiowych.
Biotechnolog wykorzystuje naturalny aparat enzymatyczny komórki, podstawia jej pewne związki organiczne i oczekuje, że zostaną one przekształcone zgodnie z jego przewidywaniami.
Ważne jest skojarzenie: Drobnoustrój=> Enzym => Biotransformacja
Przykłady:
Reakcja kondensacji. Podstawia się komórce egzogenny związek a komórka nieświadomie kondensuje go z naturalnym metabolitem występującym w komórce np. acetylo~SCoA. Tym egzogennym substratem może być np. anilina:
Najstarszym znanym przykładem biotransformacji jest utlenienie etanolu do kwasu octowego (produkcja octu winnego). U bakterii Acetobacter występuje bardzo silnie rozwinięta zdolność do katalizowania tej reakcji (z uwagi na dehydrogenazę alkoholową). Wydajność procesu sięga 90%.
Biotransformację mogą prowadzić:
1.Komórki wegetatywne (w fazie wzrostu)
2. Komórki wegetatywne (w fazie spoczynku)
3. Komórki drobnoustrojów immobilizowanych
4. Komórki drobnoustrojów wysuszonych
5. Formy przetrwane drobnoustrojów
Biotransformacja jest procesem (reakcją) wysoce specyficzną pod względem: kierunku, swoistości substratowej oraz stereospecyficzności.
Stereospecyficzność. Wiele enzymów rozróżnia izomery i wykazuje aktywność katalityczną wyłącznie w stosunku do jednej z odmian izomerycznych związku lub też tworzy jedynie jedną z nich, np. cis lub trans, α- lub β-, D- lub L-, itp. Klasycznym przykładem jest dehydrogenaza bursztynianowa, która przekształca bursztynian do fumaranu (odmiana trans kwasu etenodikarboksylowego-1,2).
Regioselektywność. Enzymy rozpoznają miejsce w cząsteczce związku chemicznego (np. atom węgla, grupę funkcyjną, itp.), w którym pod działaniem enzymu następuje przekształcenie właściwe dla jego specyficzności kierunkowej. Np. regioselektywna hydroliza estrów karboksylowych katalizowanych przez subtilizynę. Estry dibenzylowe kwasu asparaginowego i glutaminowego są hydrolizowane przy pierwszym atomie węgla. Natomiast estry etylowe kwasu cytrynowego i 1,2,3‑trikarboksylopropanu są hydrolizowane przy środkowym atomie węgla
1.2. Reakcje wykorzystywane w biotransformacji
Dehydrogenazy sprzężone z NAD utleniające grupę –OH (EC.1.1.1.).
Utlenienie grupy hydroksylowej do ketonowej przez 17-β-dehydrogenazę estradiolową (EC.1.1.1.62) sprzężoną z NAD.
Oksydazy (EC.1.1.3.) utleniające grupę –OH.
Odwodornienie
Duże znaczenie praktyczne w produkcji związków steroidowych ma reakcja odwodornienia w pozycji Δ1 pierścienia A. Do przekształcenia kortyzonu w prednizon (a także innych analogów kortykosteroidowych) można zastosować bakterie B.lentus lub B.sphaericus (rys.6.10.). Dzięki działaniu Δ1-dehydrogenazy 3-oxosteroidowej (EC.1.3.99.4.) w sposób wybiórczy ulega odwodornieniu wyłącznie pierścień A, a ilość reakcji ubocznych jest niewielka w porównaniu do pojawiających się podczas stosowania do tego celu innych drobnoustrojów.
Rys. 6.10. Δ1 odwodornienie kortyzonu przez B.lentus lub B.sphaericus
Redukcja
(Nie mylić z dehydrogenazą bursztynianową sprzężoną z FAD).
Transferazy
Acylacja, deacylacja
Metylacja, demetylacja
aminacja
glikozylacja
transketolizacja, transaldolizacja
Hydrolazy
Wybierane wybiórczo dla konkretnego procesu (m.in. esterazy, proteinazy, itp.)
Liazy
EC 4.1. – rozerwanie wiązania C-C (np. dekarboksylazy)
EC 4.3. – rozerwanie wiązania C-N (np. amoniakoliaza asparaginianowa – aspartaza).
Izomerazy
Izomeryzacja (np. cis, trans)
Epimeryzacja
Racemizacja
Ligazy
Syntetazy (np. amidacja –CONH2 – syntetaza asparaginianowa)