1. Podział zmienności

   Występowanie różnic (dziedzicznych bądź nie ) między komórkami danego organizmu (zmienność wewnątrzosobnicza), osobnikamie tej samej populacji (osobnicza) lub pomiędzy populacjami (grupowa).

   Zmienność może miec charakter:

• Ciągły (zmienność fluktuacyjna), dająca się określić w jednostkach miary, np. wzrost, masa ciała IQ (można przedstawićna krzywej Queteleta),

• Nieciągły (zmienność alternatywna), np. grupa krwi Rh.

  Czynniki środowiskowe maja duży wpływ na przejawianie się niektórych cech dzidzicznych, głównie poligenicznych – ten sam zespół genowy w różnych warunkach daje różne efekty fenotypowe.

  Choroby w zależności od udziału czynników genowych i środowiskowych podzielono na 3 grupy:

• Uwaronkowane tylko genotypem (np. hemofiliaA, albinizm, zespół Downa)

• W których dużą role odgrywają oba te czynniki – choroby wieloczynnikowe (np. cukrzyca, choroba wieńcowa)

• Uwarunkowane głównie czynnikami środowiskowymi (np. dur brzuszny, pełzakowica, rzęsistkowica)

1. Rekombinacje

   Rekombinacją nzywamy każdy proces wymiany fragmentów DNA między chromosomami homologicznymi lub dwuniciowymi helisami DNA. Rekombinaty mogą pojawiać się po mejozie, mitozie lub koniugacji. Wyróżnia się rekombinację HOMOLOGICZNĄ, ZLOKALIZOWANĄ i TRANSPOZYCYJNĄ.

   Nie prowadzą do powstawania nowych alleli, ale do ich przetasowywania i powstawania nowych kombinacji genów.

   U prokaryota rekombinacje mogą nastąpic w wyniku:

• Losowego doboru koniugatów,

• Wyżej wymienionych typów rekombinacji podczas koniugacji.

  U eukaryota rekombinacje mogą nastąpić w wyniku:

• Losowej segregacji chromosomów spermatogenezie i oogenezie,

• Losowego doboru rodziców

• Losowego łączenia gamet

• Rekombinacji homologicznej (crossing over), zlokalizowanej oraz transpozycyjnej.

• Rekombinacja homologiczna (crossing over)

• U eukaryota zachodzi w wyniku symetrycznych pęknięc i ponownego połączenia się odcinków chromatyd chromosomów homologicznychpo ich wzajemnej wymianie w pachytenie i/lub diplotenie mejozy.

• Prowadzi do wymiany odcinków homologicznych między dwona chromosomami.

• Rekombinacja homologiczna w komórkach E.Coli:

• Katalizowana przez białka kodowane w genach rec.

• Kompleks białkowy RecBCD przygotowuje do rekombinacji niezbędny ssDNA (single stranded DNA – jednoniciowy DNA). Wykazuje aktywność helikazy i nukleazy – rozplata i nacina dsDNA (double stranded DNA - dwuniciowy DNA). Proces rozplatania dzięki hydrolizie ATP jest szybszy niż ponowne parowanie się zasad. Po napotkaniu miejsca „chi” zawierającego sekwencję 5’-GCTGGTGG-3’ dochodzi do nacięcia nici i powstaje ssDNA.

• Stabilizacja jednoniciowego Dna przez białko SSB (zabezpieczna przed tworzeniem przez ssDNA struktur typu spinki do włosów)

• Związanie z ssDNA białka RecA i wytworzenie przez ssDNA filamentu – spiralnie zwiniętej formy.

• Kompleks ssDNA-RecA ma zdolność parowania się z dwuniciowym DNA. Przeszukuje dsDNA w poszukiwaniu miejsc homologicznych, znajduje komplemetarne sekwencje. Nić dokonująca inwazji (przemieszczenia) wypiera starą nić i powstaje pętla D. Do tego procesu potrzebna jest energia ATP.

• Podczas owijania się jednej nici wokół drugiej powstają napięcia torsyjne znoszone przez topoizomerazę I.

• Proces wzajemnego przemieszczania nici katalizują niałka RuvA i RuvB wykorzystujące ATP.

• Połączenia typu Hollidaya rozcina nukleaza RuvC, a następnie ligaza DNA odpowiednio łączy wolne końce.

• Rekombinacja homologiczna u prokaryota odgrywa dużą rolę w naprawie DNA.

• Rekombinacja homologiczna u eukaryota – model Szostoka

• Pęknięcie obydwu nici DNA

• Crossing over prawdopodobnie zachodzi na kilka różnych sposobów, nie znamy wszystkich

• Crossing over występuje w mejozie, sporadycznie w mitozie (mitotyczny crossing over – ma znaczenie w procesach naprawy DNA)

• Konsekwencje mitotycznego crossing over zależą od lokalizacji odcinka wymiany, położenia i rozdziału centromerów chromosomów, w których zachodzi. Pojedyncza wymiana między sprzężonymi heterozygotycznymi loci (A/a i B/b) oraz rozdział centromerów do różnych biegunów komórki w czasie anafazy prowadzi do utraty heterozygotyczności w obrębie dystalnych odcinków w stosunku do centromeru i punktu wymiany. Utrata heterozygotyczności prowadzi do procesu nowotworowego.

• Na podstawie częstości crossing over można ustalic lokalizację genów nici DNA u prokaryota i na chromosomach eukaryota oraz określić ich wzajemne położenie.

• Rekombinacja zlokalizowana

• Dotyczy wymiany niehomologicznych, ale specyficznych fragmentów.

• Katalizowana przez białka rozpoznające specyficzne sekwencje zasad.

• Przykładem jest tworzenie przeciwciał i receptorów limfocytów T.

• Zmienne rejony genów łańcucha lekkiego przeciwciał powstają w wyniku połączenia genów V i J, a łańcuch ciężki w wyniku złożenia genów V, D i J.

  Geny te posiadają różnego typu sekwencje oskrzydlające ( specyficzny układ zasad w DNA składający się z: niezmiennego heptameru palindromowego, sekwencji rozdzielającej i nonameru bogatego w pary A-T). Łączą się tylko typy genów różniących się sekwencją rozdzielającą, dzikęki czemu niemożliwa jest rekombinacja pomiędzy tymi samymi typami i zawsze pwostaje układ VDJ.

• Plazmidy – koliste cząsteczki DNA, nośniki genów warunkujących odporność na antybiotyki i produkcję toksyn. Są replikonami i mogą podlegać replikacji niezależnie od replikacji DNA gospodarza.

• U prkaryota zachodzi podczas wbudowywania plazmidów do genomu bakterii. Zachodzi tylko w określonych miejscach, zawierających sekwencje umożliwiające połączenie DNA plazmidowego i gospodarza. Wymagane są do tego białka kodowane przez oba podmioty.

• Rekombinacja transpozycyjna

• Zachodzi podczas wbudowywania transpozonów w nowe miejsce genomu.

• Transpozon – ruchomy element genomu zawierający gen kodujący transpozynę, np sekwencje insercyjne – IS

• Gen transpozazy otoczony jest 20-nukleotydowymi odwróconymi powtórzeniami końcowymi.

• Wymagane jest istnienie specyficznej sekwencji w miejscu akceptorowym IS. Przy wbudowaniu ulega ona podwojeniu (IS wbudowywana jest pomiędzy). Powowduje to zwiększenie homologicznego materiału genetycznego. Taka rekombinacja może doporwadzic do delecji, inwersji bądz duplikacji genów. Wbudowanie może naruszysć ciągłość i powodowąć unieczynnienie genu.

• Gen transpozazy posiada własny promotor mogący wzmacniac ekspresję sąsiednich genów.

• Geny złożone transpozazy – zawieraja inne geny np. oporności na antybiotyki.

• U Eukaryota transpozony mają budowę podobną do retrowirusów.

1. Mutacje

   Zmiana dziedziczna powstająca w skutek zmiany genu w jego nowy allel ( genowa), zmiany struktury chromosomu (chromosomowa strukturalna), zmiany liczby chromosomów (chromosomowa liczbowa), zwielokrotnienia haploidalnego zestawu chromosomów (genomowa).

• Mutacje genowe

• Mutacją genomową nazywamy zmianę sekwencji nukleotydów w obrębie genu.

• Najprostszą mutacją genową jest mutacja punktowa.

  Występują:

• Tranzycje (substytucja) – zamiana jednej zasady purynowej lub pirymidynowej na drugą.

• Transwersj (substytucja) – zamiana zasady purynowej na pirymidynową lub odwrotnie.

• Delecje – wypadnięcie pojedynczej lub większej liczby par nukleotydów.

• Insercje – wsatwienie pojedynczej lub wiekszej liczby par nukleotydow.

• Mutacje genowe mogą prowadzić do:

• Zmiany sekwencji aminokwasów w polipeptydzie kodowanym przez gen (mutacja zmiany sensu),

• Przerwania syntezy polipeptydu przedwcześnie w wyniku powstania kodonu STOP (mutacja nonsensowna),

• Mutacji niemej jeżeli powstanie triplet synonimiczny (kodon kodujący ten sam aminokwas)

• W wyniku delecji bądż insercji ilości par nukleotydów nie bedącej trójką bądź jej wielokrotnościa następuje zmiana ramki odczytu, a co za tym idzie zmienia się sekwencja aminokwasów kodowanego białka.

• Choroby powodowane mutacjami genowymi: mukowiscydoza, fenyloketonuria, alkaptonuria, retinoblastoma, achondroplazja, neurofibromatosis, hemoglobinopatie i talasemie.

1. Mutacje chromosomowe – aberracje

   Wszelkie zmiany w liczbie bądź strukturze chromosomów, w komórkach somatycznych lub gametach, dziedziczne lub powstające de novo.

• Aberracje chromosomowe strukturalne

  Dotycza pojedynczej lub obydwu chromatyd.

  Spowodowane są przerwaniem chromatydy lub chromosomu.

  Występują:

• Inwersje – odwrócenie fragmentu chromosomu o 180 stopni. Inwersja zwierająca centromer nazywana jest EUCENTRYCZNĄ, a nie zawierająca centromeru – ACENTRYCZNĄ.

• Translokacje – przemieszczenia fragmentó chromosomó w obrebie chromosomu lub innych.

• Translokacje wzajemne – polegają na wzajemnej wymieniae odcinków chromosomów niehomologicznych. Całkowita liczba chromosomów pozostaje niezmieniona, ale zmienia sie ich budowa.

• Translokacje robertsonowskie (typu fuzji) – u człowieka dotyczą chromosomów akrocentrycznych. Dochodzi do połączenia ramion długich dwóch różnych chromosomów w rejonie centromeru (nieistotny funkcjinalnie material genetyczny na ramionach krótkich ulega utraceniu)

  Występują:

• Translokacje robertsonowskie zrównoważone – nie zmienia się ilość materiału genetycznego , a jego lokalizacja w genomie. W konsekwencji liczba chromosomów metafazowych wynosi 45. Osoba taka jest nosicielem i może przekazać je potomstwu.

• Translokacje robertsonowskie niezrównoważone – ilośćmateriału genetycznego jest powiększona o dodtkową kopie translokowanego chromosomu -> liczba chromosomów 46. Zawsze dochodzi do ujawnienia się choroby.

• Zespół Downa – wynika z translokacji robertsonowskiej niezrównoważonej

• Duplikacje

• Polegają na podwojeniu tych samych odcinków chromosomów.

• Podwojone fragmenty genów mogą występować jako bezpośrednie powtórzenia (proste powtórzenia tandemowe) lub jakos odwrócone względem siebie .

• Odegrały istotną rolę w procesach ewolucyjnych (kodowanie białek hemoglobiny)

• Delecje

• Utrata odcinka chromosomu

• Utrata części dystalnej – delecje terminalna, utrata fragmentu środkowego – delecja interstycjalna.

• Odcinki niektórych chromosomów wykazują szczególną łamliwość – kruche miejsca genomu (np. odcinek 13q chromosomu 2 – 2q13 i odcinek 27q chromosomu X). Są szczególnie wrażliwe na działanie mutagenów. Inne łamliwe miejsca – w chromosomach 6, 9, 12, 20.

• Łamliwy chromosom X – upośledzenie umysłowe meżczyzn, bezobjawowe nosicielstwo u kobiet.

• 2 grupy miejsc łamliwych: dziedziczne (rzadkie) i konstytutywne (powszechne).

• Delecje dużych fragmentów sąz reguły letalne.

• Chromosom kolisty

• Powstaje w wyniku pęknięcia i połączenia końców chromosomu.

• U człowieka powstaja najczęściej z 4, 13, 18 i X.

• Powodują występowanie licznych zaburzeń, jednak nie określonych zespołów.

• Izochromosom

• Powstaje w wyniku nieprawidłowego podziału poprzecznego centromeru chromosomu metafazowego. Składa się on tylko z połączonych ramion krótkich lub długich.

• Powoduje ubyt genów w utraconych ramionach i podwojenie w ramionach, które chromosom utworzyły.

• Aberracje chromosomowe liczbowe

  Najczęściej powstają w wyniku nierozdzielenia się par chromosomów homologicznych w czasie podziałów.

  Występują:

• Aneuploidie

• Powstają w wyniku zwiększenia bądż zmniejszenia diploidalnej liczby chromosomów o pojedyńcze chromosomy.

• Poprzez nondysjunkcję, utratę chromosomów w anafazie komórki posiadają za mało bądź za dużo chromosomów.

• W wyniku nondysjunkcji powstaja gamety nullisomiczne i disomiczne

• Nondysjunkcja mitotyczna prowadzi do powstania mozaikowatości.

• Zalicza się aberracje autosomów i chromosomów płci.’

• Powstawanie uniparentalnej disomii (UPD) – polega na opbecności u diploidalnego potomka pary chromosomów pochądzącej tylko od jednego rodzica.

• Euploidie (poliploidie)

• Zwielokrotnienie całego haploidalnego zestawu chromosomów

• Wysątpują:

• Autoploidie – garnitur chromosomów jest zwielokrotniony o ten sam zestaw chromosomów. U człowieka z reguły są letalne. Wświecie roślin sprzyjają wytworzeniu okazałych kwiatów, liści, owoców.

• Alloploidie – 2 lub więcej niehomologicznych zespołów chromosomów. Powstająna skutek podwojenia liczby chromosomów u mieszańców międzygatunkowych. Nie występuje u czlowieka.

1. Czynniki mutagenne

   Mutageny – czynniki indukujące mutacje ponad poziom mutacji spontanicznych.

   Mutacje mogą powodować kancerogenezę, teratogenezę lub smierć komórek całęgo organizmu.

   Występują:

• Czynniki fizyczne:

  - promienie X,

  - promienie alfa, beta, gamma,

  - promieniowanie kosmiczne,

  - protony i neutrony emitowane przy promieniotwórczym rozpadzie pierswiastków

  - promieniowanie niejonizujące (UVB i UVA)

• Czynniki chemiczne:

  - kwas azotowy III

  - hydroksylamina

  - związki alkilujące (sulfonian dietylowe, etylometylowe, iperyt azotowy, diepoksybutan)

  - analogi zasad azotowych (2-aminopuryna, 5-bromouracyl)

  - barwniki akrydynowe (oranż akrydynowy, proflawina, akryflawina)

  - wolne rodniki tlenowe

  - nadtlenki

  - policykliczne węglowodory aromatyczne

  - cytostatyki i antybiotyki o właściowościach cytostatycznych

  - produkty pirolizy aminokwasów

  - mykotoksyny (np. alfatoksyny)

  - środki konserwujące (azotyn sodowy)

• Czynniki biologiczne:

  -wirusy DNA (HHV, HPV) i RNA (retorowirusy)

• Mutagenne działanie związków chemicznych

• Zmiana w chemicznej budowie zasady azotowej prowadzi do zmiany par zasad w łancuchu DNA, np. dezaminacja adeniny prowadzi do wytworzenia hipoksantyny, która łączy się z cytozyną. Po 2 replikacjach para A-T zmienia się na parę C-G. Dezaminacja cytozyny prowadzi do powstania uracylu (zamiana pary C-G na A-T). Uracyl podlega naprawie w DNA skutkniem czego w jego miejsce może zostać wbudowana kompletnie inna para zasad.

• Hydroskylamina powoduje zmiane cytozyny w uracyl (konsekwencja: C->T)

• Związki alkilujące wprowadzają grupy alkoliowe w różne pozycje zasad azotowych (Głównie puryn). Najczęściej guaniny i adeniny. Alkilacja pozycji N7 guaniny osłabia jej wiązanie z pentoza i oddziela zasade od łańcucha (depurynacja). W tym miejscu może dojść do tranzycji bądź transwersji.

• Analogi zasad wprowadzane do DNA podczas replikacji powodują tranzycje i prowadzą do innych zmian w strukturze DNA.

• Barwniki akrydynowe interkalują między pary zasad powodując ich rozsunięcie, co powoduje błędy w replikacji prowadzące do delecji i insercji -> zmiany ramki odczytu.

• Wolne rodniki tlenowe uszkadzają zasady azotowe, reszty cukrowe, rozrywaja wiązania fosfodiestrowe, powodują tworzenie wiązań poprzecznych miedzy DNA i białkami chromatyny. Taki DNA indukuje powstawanie przeciwciał – znaczenie w chorobach autoimmunologicznych. Pod ich wpływem dochodzi do pęknięć DNA -> aberracji strukturalnych.

• Produkty pirolizy aminokwasów – powstają w wyniku długotrwałego smażenia lub gotowania mięs w temperaturze powyżej 150 stopni Celsjusza. Powstają heterocykliczne aminy aromatyczne o działaniu mutagennym, kancerogennym i teratogennym. Powstają w połączeniu kreatyniny, cukru i aminokwasu. Najczęściej reagują glicyna, kwas glutaminowy, tryptofan i fenyloalanina.

• Nitrozoaminy – powstają w żywności w rekacjach drugo- i trzeciorzędowych amin z azotynami. Reakcje są hamowane przez kwas askorbinowy. Czynnik nitrozujący – N-nitrozodimetyloamina i jej pochodne powstające w procesie wędzenia mięs i serów. Nitrozoaminy wymagajaą aktywatorów w procesie mutagenezy m. in. Cytochromów P-450 (nitrozyamidy nie potrzebują).

• Mykotoksyny – do najczęstszych i najbardziej kancerogennych zaliczamy alfatoksyny. Ich rozwój wiąże się z niewłaściwym przechowywaniem żywności.

• Środki konserwujące – niektóre z nich są czynnikiem nitrozującym, podczas gotowania i pasteryzowania azotyny wchodzą w reakcję z aminami i powstają nitrozoaminy.

• Inhibitory mutagenów: kwas askorbinowy, alfa-tokoferol, beta-karoteny, flawonoidy (niktóree sa antyoksydantami)

• Mutagenne działanie czynników fizycznych

• Promieniowanie jonizujące

• Promienie jonizujące zwiększają częstośc mutacji we wszytkich komórkach. Wybijają elektrony z atomów i cząsteczek, powodując ich jonizację. Jony i wolne rodniki mogą inicjować różne reakcje chemiczne. Wolne rodniki łatwo wchodzą w reakcję z DNA powodując mutacje.

• Efekt mutagenny promieniowania jonizującego zależy od ciśnienia tlenu cząsteczkowego w środowisku – więcej = częstsze mutacje.

  Długotrwałe naświetlanie małymi dawkami promieniowania jonizującego powoduje mniej mutacji niż jednorazowa duża dawka (większe możliwości naprawy DNA).

• Uszkodzenia promieniami jonizującymi: uszkodzenia wiązań fosfodiestrowych (prowadzi do peknięcia nici), modyfikacja zasad azotowych, uszkodzenia pentozy, powstanie wiązań krzyżowych DNA (sieciowanie DNA) powstanie wiązań między białkami i białkami a DNA. Prowadzą do nowotworów.

• Szczególnie wrażliwe są na nie komórki szybko dzielące się.

• Promieniowanie ultrafioletowe

• Promieniowanie ultrafioletowe ma mniejszą zdolność przenikania przez tkanki, ale jest bardzo intensywnie pochlaniane przez DNA.

• Głównym efektem jest wytwarzanie dimerów pirymidynowych (C-C, C-T a zwłąszcza dimerów tyminowych T-T)

• Dimery te powstajaą przez tworzenie wiązań kowalencyjnych pomiędzy leżącymi obok siebie pirymidynami i powodują zaburzenia w replikacji ( najczęściej tranzycje i transwersje, rzadko zmiany ramki odczytu)

1. Mechanizmy naprawy DNA

   W każdej komórce po zadziałaniu czynnika genotoksycznego następuje uruchomienie mechanizmów naprawczych. Uszkodzenia DNA przed ich naprawą są rozpoznawane przez enzymy reperacyjne. Do najważniejszych enzmów biorących udział w naprawie DNA należą:

• Polimerazy DNA jądrowe (α, β, δ, ε) i mitochondrialna (γ),

• Ligazy DNA,

• Glikozylazy DNA,

• Endonukloeazy apurynowe/ apirymidynowe – 5’ – AP i 3’ – AP,

• Białka pomocnicze

• Fotoliazy DNA

• Metylotransferaza – O⁶ – metyloguanina – DNA (MGMT).

  Naprawa w komórce może być:

• Niekompletna – dochodzi do powstania mutacji genowych lub aberracji chromosomowych,

• Kompletna

  Jeżeli enzymy nie zdołają naprawić uszkodzeńDNA , to komórka może przejść na szlak zaprogramowanej śmierci – apoptozy

  Procesy naprawy zachodza przed replikacją, w trakcie i po replikacji. Nić DNA łącząca nukleosomy (DNA łącznikowy) jest naprawiana szybciej niż ta nawinięta na nie (DNA rdzeniowy). Szybkość naprawy chromatyny aktywnej transkrypcyjnie jest wieksza niż nieaktywnej heterochromatyny.

• Naprawa DNA przez bezpośrednią rewersję uszkodzenia

  Procesy naprawy DNA obserwuje się w genoforowym, jądrowym i mitochondrialnym DNA. Mogą przebiegać jednoetapowo lub dwuetapowo.

  Proces jednoetapowy polega na bezpośredniej rewersji uszkodzenia i/lub systemie naprawy przez rekombinację. Proces dwuetapowy polega na wycięciu uszkodzenia, a następnie syntezie naprawczej.

• Metylotransferaza MGMT

• Katalizuje przeniesienie grupy alkilowej z atomu O⁶ guaniny na cysteinę znajdującą się w białku, w wyniku czego ulega nieodwracalnej dezaktywacji.

• U ludzi największy poziom aktywacji enzymu występuje w wątrobie, najniższy w komórkach prekursorowych szpiku kostnego.

• Ekspresja genu MGMT w ludzkich nowotworach jest zmniejszona o 20 – 30%.

• Występuje u wyższych żywych organizmów

• Fotoliaza

• Występuje u bakterii, grzybó, roślin, zwierząt i człowieka.

• Odpowiedzialny za fotoreaktywację ( naprawa w świetle, jasna naprawa) – rozłączanie dimerów pirymidynowych przy udziale swiatłą o długości fal 300 – 600 nm.

• Każda fotoliaza zawiera dwa chromofory, odpowiedzialne za absorbcję fotonów – metynylo-tetrahydrofolian (MTHF), albo 8-hydroxy-deazoflawina (8-HDF) i FADH^- . MTHF lub 8-HDF absorbują en. Świetlną i przekazują na FADH^- a z niej wykorzystywana jest ona do rozdzielania dimerów.

• Ligaza

• Łączy pęknięcia w łancuchu DNA

• Działą tylko na przerwy, które powstają na skutek przerwania wiązania pomiędzy grupą 5’ – fosforanową i 3’ – hydroksylową.

• Usuwanie błędnie sparowanej zasady (MMR – miss-match repair)

• Dotyczy usuwania błędów replikcyjnych, nie naprawionych przez polimerazy DNA, oraz błędów w parowaniu zasad powstających podczas rekombinacji DNA, a także w wyniku działania niektórych związkó chemicznych.

• Ważne jest ropoznanie, która z nici jest nicią prawidłową, a która nowo zsyntezowaną z błędem:

• U E. Coli w rozpoznawaniu uszkodzeń ważną rolę odgrywa stopień metylacji DNA. W sekwencjach GATC metylowana jest adenina ale NIE BEZPOŚREDNIO po replikacji dzieki czemu możliwe jest ustalenie, która z nici zaweira błąd.

• U Eukaryota rozpoznanie błędnie zsyntezowanej nici możłiwe jest dzięki przerwom w ciągłości nici potomnej. Są to przerwy między fragmentami okazaki w nici opóźnionej i miedzy miejscami starterowymi na nici prowadzącej.

• Białka uczestniczące w tym procesie kodowane są przez geny MUTATOROWE.

• Przebieg tego procesu został najlepiej poznany w komórkach E. Coli:

• Rozpoznanie miejsca pomyłki przez białko MutS ( jest ono zdolne także do wykrycia insercji i delecji obejmujących do 4 nukleotydów)

• Połączenie MutS z DNA w miejscu pomyłki i stabilizacja tego kompleksu przez białko MutL. Białko MutL odpowiada za połączenie z białkiem MutH.

• Białko MutH przyłącza się naprzeciw najbliżej zmetylowanej adeniny w nici „rodzicielskiej” i nacina nić potomną.

• Procesy wycięcia nieprawidłowej nici i dosyntezowania prawidłowej przeprowadzają:

• UvrD – helikaza II; rozkręca nić DNA w kierunku od miejsca nacięcia do miejsca do miejsca pomyłki,

• Egzonukleaza wycina błędnie sparowany fragment,

• Polimeraza DNA III dosyntezowuje odpowidnią sekwencję zasad,

• Ligaza DNA łączy nowo powstały fragment nici z niciąmacierzystą.

• U Eukaryota mechanizm nie został całkowicie poznany, przypuszcza się, że jest podobny do szlaku opisanego powyżej (brakuje homologów MutH i UvrD, wiele homologów MutL i MutS.

• Zaburzenia funkcji genów mutatorowych są przyczyną powstawania wielu nowotworów.

• Naprawa przez wycinanie zasad azotowych (BER – Base Excision Repair)

• Mechanizm wykorzystywany głównie do usuwania uracylu lub alkilowanych zasad np. 3-metyloadeniny.

• Grupa mechanizów o podobnym przebiegu, specyficznych dla każdej zasady.

• Wyróżniamy 3 etapy:

• Usunięcienieprawidłowej zasady przez specyficzną N-glikozylazę i wytworzenie miejsca apurynowego/apirymidynowego – miejsca AP.

• Nacięcie przez endonukleazę AP wiązania fosfodiestrowego powyżej miejsca AP i wytworzenie wolnego końca 3’ – OH.

• Wypełnienie miejśca AP przez polimerazę DNA.

• Róznice pomiędzy poszczególnymi typami mepchanizmu dotyczą glikozylazy specyficznej do typu nieprawidłowej zasady.

• Powstające miejsca AP są identyczne z powstałymi po spontanicznej depurynacji lub depirymidynacji. Zjawisko takie ma miejsce w wypadku 1 na 700 tysiecy zasad.

• Wycięcie miejsca AP przebiega w dwóch etapach:

• Pierwszy etap – hydroliza wiązania fosfodiestrowego po stronie 5’ miejsca AP.

• Drugi etap – wbudowanie nowej zasady, wyciannie końca 2’–deoksyrybozo-5’-fosforanowego i łączenie łancucha cukrowo – fosforanowego. Istnieją 2 drogi:

• Krótsza – wbudowanie jednej zasady z wykorzystaniem polimerazy DNA beta, usuwanie końca 2’ – deoksyrybozo – 5’ fosforanowego z wykorzystaniem deoksyrybozofosfodiestrazy DNA (dRPaza) i łączenie końców 5’ i 3’ przy pomocy ligazy. Prawdopowdobnie ta droga jest dominująca w komórkach ludzkich.

• Dłuższa – wbudowanie kilku zasad z wykorzystaniem polimerazy DNA delta albo epsilion (wymagają kofaktora PCNA – Proliferating Cell Nuclear Antigen), odcinanie zbędnego fragmentu łańcucha z wykorzystaniem DNazy IV, łączenie końców 5’ i 3’ przy pomocy ligazy.

• Naprawa przez wyciananie nukleotydów (NER – Nucleotide Excision Repair)

• Bierze on udział w usuwaniu większości uszkodzeń DNA.

• U wszystkich organizmów przebiega wg tego samego schematu:

• Rozpoznanie uszkodzenia na podstawie nieprawidłowej struktury przestrzennej cząsteczki DNA,

• Przyłączenie kompleksu białkowego w miejscu uszkodzenia,

• Podwójne nacięcie uszkodzonej nici w miejscu oddalonym o kilka nukleotydów od miejsca uszkodzenia zarówno po stronie 3’, jak i 5’,

• Usunięcie ogligonukleotydu zawierającego uszkodzenie pomiędzy nacięciami,

• Wypełnienie luki przez polimeraze DNA,

• Połąćzenie wolnych końców przy udziale ligazy.

• Przebieg procesu u E. Coli:

• Białka UvrA, UvrB i UvrC rozpoznają uszkodzenie i nacinają nić DNA.

• Dwie cząsteczki UvrA łączą się (przy udziale ATP) z UvrB tworząc kompleks UvrA₂B, który nacina nić DNA po obu stronach. Związki tego kompleksu powodują wygięcie DNA.

• Białka UvrA oddzielają się, białko UvrB silniej wiąże się z miejscem uszkodzenia., co powoduje większe odkształcenie DNA.

• Białko UvrC przyłącza się w efekcie czego dochodzi do nacięcia przez UvrB uszkodzonej nici w miejscu oddalonym ok. 4 nukleotydy w stronę 3’ od miejsca uszkodzenia. Powstająca w ten sposób zmiana konformacji helisy aktywuje UvrC do nacięcia uszkodzonej nici w miejscu oddalonym o ok. 7 nukleotydów w kierunku 5’ od uszkodzenia.

• UvrD przy zużyciu energii z ATP usuwa oligonukleotyd zawierający uszkodzenie. Jednocześnie odłączane jest białko UvrC.

• UvrB odłącza się w momencie, w którym polimeraza DNA I lub II wypełnia lukę po odłączonym polinukleotydzie.

• Na koniec ligaza łączy nacięcia.

• U Eukaryota schemat procesu jest ogólnie taki sam, natomiast liczba białek biorących udział w usunięciu nukleotydu – znacznie większa. Dokładny przebieg nie jest znany. Wiemy, że:

• Białko XPA przyłącza się w miejsce uszkodzenia DNA. Zawiera domenę dobrze łączącą sięz nieprawidłowym DNA oraz inna, dzięki której może powstać połąćzenie z białkiem replikacyjnym A – RPA (Replication Protein A). RPA jest trimerem białkowym specyficznie wiążącym się z jednoniciowym DNA, niezbędnym w procesie replikacji

• Połączenie w kompleks RPA i XPA powoduje zwiększenie ich do uszkodzonego DNA. Kompleks łączy się z czynnikiem transkrypcyjnym TFIIH ( Transcription Factor II).

• Białko TFIIH i XPA wspólnie oddziałują i przyciągają XPC i HHR23B co pomaga ustabilizować DNA i interakcje międzybiałkowe z kompleksie. W podjednostkach TFIIH występują XPB i XPD – helikazy o przeciwnych polarnościach. Rozwijają one helisę w kierunkach 5’ i 3’ od miejsca przyłączenia XPA, umożliwiając przyłączenie nukleaz XPF/ERCC1 i XPG.

• XPF/ERCC1 bacina uszkodzonąnic DNA w pobliżu rozejścia siędwuniciowego DNA na 2 nici pojedyncze. Białko XPG rozpoznaje drugie rozejście i również nacina uszkodzony łańcuch.

• Powstały oligonukleotyd w niewiadomy sposób zostaje usunięty.

• Polimeraza delta lub epsilion w obecnosci kofaktora PCNA wypełnia lukę a ligaza łączy wolne końce.

• Naprawa rekombinacyjna

• System ten bierze udział w naprawie pęknięć dwuniciowych.

• Dokładnie poznany u bakterii. U Eukaryota wyróżnia się trzy szlaki naprawy pęknięć dwuniciowych:

• Rekombinacja homologiczna

• Do odtworzenia struktury chromosomu wykorzystywany jest jego nieuszkodzony homolog

• Trawienie jednej nici w miejscu pęknięcia przez egzonukleazy aż do wytworzenia jednoniciowego odcinka z wolnym końcem 3’.

• Połączenie odcinka z nieuszkodzonym chromosomem homologicznym.

• Odtworzenie przebiegu naprawionej cząsteczki na podstawie informacji z chromosomu homologicznego.

• Dopasowanie pojedynczych nici DNA

• Białka naprawcze wykorzystują krótkie sekwencje powtórzone, znajdujące się w najbliższym sąsiedztwie pęknięcia do wzajemnego dopasowania jednoniciowych końców dwóch fragmentów DNA, a następnie ich połączenia.

• Rekombinacja niehomologiczna

• Nici niehomologicznych odcinków DNA pomiędzy pęknięciami i sekwencjami powtórzonymi, mające w obrębie pęknięcia koniec 3’, sa przemieszczane poza helisęi niszczone przez kompleks ERCC1/XPF.

• Największy udział ma kinaza zależna od DNA (DNA – PK)

• W zależności od pozycji w cyklu komórkowym dominują różne mechanizmy naprawy. Podczas faz G1 i wczesnej S przeważa rekombinacja niehomologiczna, podczas późnej S i G2 większą rolę odgrywa homologiczna.

• Odpowiedż SOS

• Uruchamiany gdy w komórce bakteryjnej powstały zbyt liczne mutacje lub zatrzymana zostałą replikacja.

• Polega na ocaleniu komórki za cenę mutacji.

• W odpowiedzi na SOS aktywuje się ok. 20 różnych genów.

• Po jego uruchomieniu komórka wstrzymuje podział co daje dodatkowy czas na na usunięcie uszkodzeń.

• Przbieg:

• Uszkodzenie DNA indukuje aktywność proteazową białka RecA.

• RecA rozkłada białka lambda i LexA blokujące geny regulonu kodującego enzymy naprawy DNA, dzieki czemu częstośc transkrypcji genów wzrasta 2 do 10 razy.

• Produkty genu UmuDC umożliwiają elongację DNA pomimo błędnego wbudowania zasady lub tuż za miejscem uszkodzenia (inaczej replikacja nie zostałąby zakończona) – naprawa ze skłonnością do błędu.

• Po naprawieniu spada poziom białka RecA -> zwiększa się poziom białęk lambda i LexA -> ponowne wyłączenie regulonu SOS.

  Naprawianie mutacji w DNA jest procesem ważnym dla zachowania prawidłowej informacji genetycznej. Do zespołów chorobowych zechujących się brakiem lub obniżeniem aktywności enzymów naprawczych należą:

• Xeroderma pigmentosum

• Zespół Blooma

• Anemia Fanconiego

• Ataxia teleangiectasia

  Obniżenie zdolności naprawy zwiększa ryzykow nowotworu i przyspiesza starzenie.

  Do substancji i czynników spowalniających naprawę należą: hipertermia, spadek poziomu ATP, palenie tytoniu, picie alkoholu, teofilina.

1. Mutacje dynamiczne (niestabilne) – ekspansja tripletów

   Mutacje wg klasycznych założeń genetycznych mają charakter stabilny, tzn. Że mutacja pojawiająca się w danym pokoleniu przekazywana jest pokoleniom kolejnym komórek. Większosć mutacji taka jest.

   Mytacje dynamiczne to takie, których ekspresja zmienia się w kolejnych pokoleniach

   Chroby:

• Zespół łamliwego chromosomu X,

• Dystrofia miotoniczna

• Pląsawica Huntingtona.

  Powstają w wyniku wydłużania się lub skracaniasekwencji DNA, prawdopodobieństwo wystąpienia mutacji zależy od długości niestabilnej sekwencji. Niesabilne sekwencje należą do tzw. sekwencji repetytywnych.

  W zależności od liczby powtórzonych trujek wyróżnia sięnosicieli bezobjawowych (premutacje) i chorych (pełna mutacja). Najczęściej są to powtórzenia zwielokrotnionch sekwencji trinukleotydowych. U chorych ta liczba potórzeń wzrasta – tzw. ekspansja tripletów. W przypadku pląsawicy Huntingtona liczba potórzeń sekwncji CAG w ramieniu krótkim chromosomu4 u osób zdrowych waha się między 4 – 35 a u chorych od 36 do 50 i więcej. Efekt może być wzmacniany z pokolenia na pokolenie.

  W chorobie huntingtona liczba powtórzeń zwiększa się tylko gdy mutacja zostanie przekazana przez ojca.

  Antycypacja – zjawisko nasilania się choroby i występowania w coraz młodszym wieku w następujących po sobie pokoleniach.

  Paradoks Shermana (łamliwy chromosom X) – prawdopodobieństwo wystąpienia choroby wśród rodzenstwa wystąpienia bezobjawowego nosiciela jest zdecydowanie mniejsze , niż wśród jego wnuków i prawnuków.

1. Mutacje spontaniczne i indukowane

   Spontaniczne – powstające samoistnie w normalnych warunkach bytowania. Najczęściej są wynikiem błędu w replikacji DNA lub zamorzutnych modyfkiacji zasad azotowych. Nie są przekazywane następnemu pokoleniu ( przy rozmnażaniu płciowym)

   Mutacje indukowane są powodowane wpływem czynników mutagennych.

   Liczba mutacji wzrasta wraz z wiekiem organizmu.

2. Mutacje letalne

   Geny letalne w stanie homozygotycznym powodują najczęściej śmierć. W stanie heterozygotycznym mogą się one utrzymywać wiele pokoleń.