Metoda rozcieńczeń i obliczania NPL:
- Miano jest najmniejszą objętością badanej próby w której stwierdza się obecność chociażby jednej komórki bakterii. Komórka ta po zaszczepieniu na podłoże odżywcze rozmnaża się co staję się podstawą do obliczenia wartości miana. Jest liczbą niemianowaną i jest równe najwyższemu rozcieńczeniu, w którym stwierdza się wynik dodatni. W metodzie tej każde rozcieńczenie posiewa się w 3 powtórzeniach. Wynik końcowy oblicza się i podaje jako NPL żywych bakterii posługując się tablicami McC.
- Dla określenia NPL należy najpierw oznaczyć liczbę charakterystyczną, która skł się z 3 cyfr. Pierwsza oznacza liczbę probówek w których stwierdza się we wszystkich powtórzeniach wynik dodatni. Druga i trzecia są liczbą probówek z wynikiem dodatnim z dwóch kolejnych rozcieńczeń. Gdy wzrost nastąpił w kolejnych próbach to dodaje się je do ostatniej cyfry. Po ustaleniu liczby charakt ustala się NPL stosując tablice McC. Odczytaną z tablic cyfrę mnoży się przez wskaźnik ostatniego rozcieńczenia ze wszystkimi dodatnimi wynikami. Końcowy wynik to NPL gr coli/ml badanego ścieku.
Oznaczenie bakterii grupy coli metodą fermentacyjno – probówkową:
- Stosuje się ją do wykrywania bakterii gr coli w uzdatnionej i nieuzdatnionej wodzie do picia i potrzeb gospodarczych, w wodach powierzchniowych i ściekach chlorowanych. Wykrywanie bakterii oparte jest na zdolności tych bakterii do fermentowania laktozy z wytworzeniem kwasu i gazu. Metoda obejmuje badania wstępne w którym na podstawie wytworzonego kwasu i gazu po 24h lub 48h inkubacji wnioskuje się o obecności bakterii gr coli oraz badania potwierdzające mające na celu wykluczenie fałszywych dodatnich wyników badań przez stwierdzenie że bakterie fermentujące laktozą rzeczywiście należą do gr coli. Po badaniu okr się NPL gr coli w 100cm3 miana coli.
- Metoda skł się z kilku etapów: Badania wstępne, potwierdzające, uzupełniające i ostateczne.
*B. wstępne – Posiew odp. obj. ścieków do podłoża płynnego z laktozą i purpurą bromokrezolową (LPB) i inkubacja w temp 37 przez 24 i 48h. Do pipet wprowadza się 9cm buliony laktozowego z purpurą bromokrezolową. Probówki trzeba oznakować i sterylizować. Wprowadza się 1cm ścieku i robi rozcieńczenia dziesiętne. Próbki mogą być przetrzymywane góra 30min. Wynik dodatni to obecność gazu i zmętnienie podłoża, zakwaszenie. Przy braku po 24h inkubuje się dalej do 48. Brak gazu i kwasu po 48 to wynik ujemny. Mała ilość gazu i kwasu po 24 i 48 to wynik wątpliwy i trzeba poddać b potwierdzającym. Wynik dodatni po 24h to koniec badań.
*B potwierdzające – W celu potwierdzenia obecności gr coli w zasadzie ze wszystkich dodatnich i wątpliwych hodowli b wstępnego po 24 i 48h. Wynik dodatni fałszywy – wytworzenie kwasu i gazu przez bakterie nie należące do gr coli, czyli gram dodatnie laseczki bacillus i gram ujemne pałeczki aeromonas. Wykonuje się to badanie na pożywce Endo met posiewu powierzchniowego. Inkubacja przez 24 w 37C. Gr coli rośnie w postaci okrągłych, czerwonych kolonii z charakterystycznym połyskiem. Choćby jedna taka kolonia to wynik dodatni. Jeżeli stwierdzi się kolonie nietypowe przypominające b gr coli to robi się badania uzupełniające.
*B. uzupełniające – Czyli stwierdzenie tzw. wtórnej fermentacji laktozy, wykonanie barwienia met grama i testu na oksydazę cytochromową. Trzeba wybrać kilka kolonii z Endo i przesiać na skos agaru odżywczego. Wtórna fermentacja laktozy to używa się pożywki laktozowej ze wskaźnikiem andrade. Po posiewie inkubuje się i sprawdza obecność gazu. Zakwaszenie pożywki to wynik dodatni, brak zmian to ujemny. Barwienie Grama to bakterie które odbarwią się pod działaniem alkoholu i zabarwią ponownie barwnikiem na różowo są gram ujemnymi. Bakterie które nie odbarwią się i pozostają fioletowe są gram dodatnie co wyklucza obecność gr coli. Test na oksydazę ta sama pożywka co grama, nanosi się kilka kropel odczynnika i niebieskie zabarwienie sugeruje ze nie ma gr coli. Słabe zabarwienie lub powyżej 2min to ujemny wynik.
*B. ostateczne – Czyli wykrywanie indolu, Reakcja z czerwienią metylową, Reakcja Voges Proskauera, Zdolność wykorzystania cytrynianu jako źródła węgla.