ęęłęóChromosomowe DNA :

Lizozym (osłabienie polimerów w ścianie kom)+ EDTA(kompleksuje Mg(2+), zapobiega trawieniu DNA przez DNazy kom) + SDS (detergent, interkaluje błony komórkowe ), należy to odwirować, potem jest ekstrakcja fenolem (strącenie białek), dodanie RNAzy. Następnie trzeba to wszystko zagęścić, wykorzystujemy tu precypitację DNA etanolem.

Plazmidowe DNA :

Analogicznie jak w etapie pierwszym, ale należy działać ostrożniej. Dodaje się Lizozym + EDTA i sacharozę (izotoniczność środowiska). Powstają sferoplasty. Następnie dodawany jest Triton X-100 jako delikatny detergent, by nie uszkodzić plazmidowego DNA, lizat komórki jest odwirowywany. W klarownym roztworze pozostaje plazmidowe DNA.
Należy to DNA chyba jeszcze oczyścić od zwykłego DNA, RNA i białek- można to zrobić przez denaturację alkaliczną lub wirowanie w gradiencie CsCl.

Fagowe DNA :
Fagi są dostępne w płynie hodowlanym z zainfekowanymi bakteriami. Aby uzyskać duże wydajności należy zaindukować przejście fagów do fazy litycznej (lub używa się w ogóle fagów, które są pozbawione genu cI czyli są od razu w fazie litycznej). Wystarczy to odwirować (osad bakteryjny się usuwa). A fagowe DNA się uzyskuje poprzez deproteinizację fagowego kapsydu.

ęęłęóRACE (rapid amplification of cDNA
ends)=
Technika umożliwiająca otrzymanie pełnej długości sekwencji,gdy znany jest tylko fragment

ęęłęóOptional DNA - to DNA które można wyciąć bez żadnych konsekwencji i wpływu na cykl lityczny faga lambda !!

ęęłęóGene targeting - czyli wyłączanie genów. Po co? Żeby móc określić funkcję nieznanego genu tzn jego produktu!

ęęłęó1. czego sie uzywa do znakowania dna gdy uzywany jest fragment klenowa.
2. pytanie o nukleaze s1, do czego sluzy, jakie ma wlasciwosci.
3. pytanie pierwsze, dotyczace tego rysunku:
- czy wystepuja polilinkery,
- czy wystepuja dwa rozne markery,
4. podac najlepsza temperature do PCR gdy podana jedna nic,
5. jaki produkt powstanie, gdy strawimy dna nukleaza ktora tworzy lepkie konce, a pozniej potraktujemy to s1, a nastepnie bal31

ęęłęó1) jak transformowano bakterie pBR322 (chyba) otrzymano 108 kolonii. Ile otrzymamy jak transformujemy bakterie plazmidem z insertem o dl. (chyba) 2000pz.
2) Ktory enzym jest przede wszystkim odp. za utrate fragmentu 5' sekwencji cDNA
3) Ktory z procesow nie dotyczy techniki primer extension

ęęłęóbylo cos jeszcze o transformacji bakterii.
o ile pamietam to cos bylo o szalce o srednicy 12 cm, i do jednych bakterii dodano plazmid z genem opornosci na (bodajze) ampicyline i odrazu wysiano na pozywke zawierajaca tenze antybiotyk, a drugie bakterie zmieszano z plazmidami, inkubowano jakis tam czas i dopiero wysiano na pozywke z tym antybiotykiem

ęęłęó
1.Charakterystyka wektora(tylko rysunku nie ma hehheheheh)
a)wektor może być użyty do przygotowania biblioteki genomowej
b) zawiera geny markerowe
c)może replikować w komórkach bakteryjnych w sposób charakterystyczny dla plazmidów
d)zawiera COS –pakowanie do wektora
e)zawiera polilinker(sekwencje wielokrotnego klonowania)

2.Nukleaza SI
a)może być użyta do lokalizacji sekwencji intronowych
b)może degradować DNA i RNA i powstaja produkty posiadajace sekwencje P-5’
c)DNA:DNA,RNA:RNA i DNA:RNA sa odporne na działanie tego enzymu
b)jest egzonukleazą
e)używana do odtrawiania fragmentów kw.nukleinowych ,które maja forme pojedynczej nici

3.Który ze zwiazków może byz użyty jako substrat do enzymatycznego znakowania izotopem P32 fragmentu DNA o końcach tępych?
a) dATP znakowany P32 w pozycji g
b) ATP znakowany w pozycji a
c) dGTP znakowany w pozycji a
d) [g-P32] -ATP
e) [a-P32]-dATP

4.Wektor plazmidowy poddano linearyzacji enzymem EcoRI został uzyty do ligacji z DNA powstałym w wyniku hybrydyzacji dwóch syntetycznych oligonukleotydów. Syntatyczny ds.DNA został tak zaprojektowany iż posiada konce identyczne z końcami wektora(EcoRI).Mieszanine poligacyjna poddano transformacji komórki bakteryjne i wylano je na podłoze zawierajace odpowiedni dla wekrota antybiotyk. Które z podanych ponizej twierdzen sa nieprawdziwe?
a)pośród powstałych klonów można było zaobserwować klony zawierajace wektor pozbawiony insertu
b )pośród powstałych klonów można było zaobserwować klony zawierajace rekombinowany wektor z wbudowanym jednym fragmentem
c)pośród powstałych klonów można było zaobserwowac wektor zawierajacy wiecej niż jeden fragment
d)ligacji jednego fragmentu i czasteczki wektora towarzyszy powstanie 4ch wiazań fosfodiestrowych
f) ligacji jednego fragmentu i czasteczki wektora towarzyszy powstanie 2ch wiazań fosfodiestrowych

5. Dwie próbki E.coli poddano transformacji plazmidem zawierajacym gen AmpR (opornośc na ampicylinę).Do pierwszej próbko dodano niewielka ilośc pozywki i wylano na podłoze.do drugiej również dodano niewielka ilosc pozywki i wylano na podłoze,inkubowano przez 30 min w 37’C.:
a) szalka z próbką I:300 klonów i szalka z próbka II :300 klonów
b) szalka z próbką I:300 klonów i szalka z próbka II :25 klonów
c) szalka z próbką I:30 klonów i szalka z próbka II :400 klonów
d) szalka z próbką I:0 klonów i szalka z próbka II :300 klonów
e) szalka z próbką I:3000 klonów i szalka z próbka II :30 klonów

6.Dla elektroforezy nie jest prawdą:
a)superzwinięte czasteczki DNA wędruja szybciej niż liniowe
b)cząsteczki DNA obdazone ładunkiem ujemnym wędrują do elektrody dodatniej
c)mieszanian fragmentów Dna jest rozdzielana tym ekektywniej im któtsze sa fragmenty
d)małe cząsteczki Dna wedruja najczescoej szybciej niż wieksze [przy załozeniu ze stosunek ładunku do masy jest bardzo podobny dla różnych DNA
e)cząsteczki o długości 302 i 303 pz mogą być rozdzielane

7.Enzym restrykcyjny ClaI rozpoznaje sekwencje ATŻCGAT i trawi wiazanie fosfodiestrowe pomiedzy resztami TiC.enzym restrykcyjny TagI rozpoznaje sekwencje TŻCGA:
a)ktotsze fragmenty DNA generowane przez enzym sa końcami komplementarnymi
b) fragmenty powstałe po trawieniu enzymami sa tylko w czesci komplementarne
c)ClaI i TagI sa izoschizomerami
d)dowolne fragmenty powstałe po trawieniu ClaI i TagI mogą być ligowane i następnie trawione ClaI
e)dowolne fragmenty powstałe po ligowaniu produktu trawienia ClaI i TagI mogą być trawione TagI

8.Klon może być użyty jako substrat do radioaktywnego znakowania fragmentu DNA przy wykorzystaniu fragmentu Klenowa polimerazy I DNA:
a)dATP znakowany P32 w pozycji g
b)ATP znakowany w pozycji a
c) dGTP znakowany w pozycji a
d)[g-P32] -ATP
e)[a-P32]-dATP

9.Przy pomocy techniki primer extension mozna mapowac 5’ koniec transkryptu.w tym celu mozna tez posłużyc sie techniką wykorzystujaca nukleazę SI.która z podanych ponizej informacji nie ma miejsca przy primer extension?:
a)....
b)denaturacja DNA i elektroforeza
c)hybrydyzacja
d)wariant tej techniki może być uzyty do mapowania 3’ końca,reakcja przy udziale rekombinowanego enzymu
e) ....

10.Zakładajac ze polimeraza Tagi nie traci aktywnosci ani nie ulega rozkładowi,substraty PCR można powiedziec ze dov\celowa sekswncja Dna jest powielana po n-cyklach:
a) n2 cyklach
b) 2n cyklach
c) n razy
d) n2n razy
e) 2n-2 razy




11.Który z podanych wektorów jest najmniej przydatny do sekwencjonowania genomu ssaczego?:
a)YAC
b)BAC
c)wektor bedacy pochodną faga l
d)kosmid
e)wektor plazmidowy

12.spośród podanych temperatur wybrac która z najwiekszym powodzeniem da wydajne otrzymanie produktów PCR przeprowadzajac dla startera 5’ GGTAATCGGTTAGGCTCC3’:
a)56’C
b)72’C
c)59’C
d)55̵ 7;C
e)żadna


13.Który z podanych czynników istotny dla jednej z metod pozwalajacych an otrzymanie cDNA jest głównym winowajcą odpowiedzialnymza brak cDNA inf reprezentujacej 5’ koniec transkryptu:
a)5’AGCAATGG3’
3’TCGT5’
b)5’AGCAATGG3’
3’ACC5’
c)5’AGCAATGG3’
3’TCGTTACC5’
d)5’AGGAA3’
3’TCGTTACC5’
f) nie wiadomo


14.Wektor plazmidowy zawiera gen markerowy odpowiedajacy za odpornośc na erytromycynę(EryR) i gen markerowy odpowiedzialny za opornośc na ampicylinę.Gen AmpR został przecięty enzymem restrykcyjnym a powstały w ten sposób plazmid połączono z fragmentem 1000pz o końcach komplemantarnych do wektora.Które z ponizsych fenotypów maja komórki transformowane:
a)niewrażliwe na ampicylinę & niewrazliwe na erytromycynę
b) niewrażliwe na ampicylinę & wrazliwe na erytromycynę
c) wrażliwe na ampicylinę & wrazliwe na erytromycynę
d) wrażliwe na ampicylinę & niewrazliwe na erytromycynę
e)nie wiadomo

15.Kolista cząsteczka Dna posiada n-miejsc restrykcyjnych EcoRI.ile fragmentów DNA powstanie po całkowitym jej strawieniu?
a)n-1
b)n
c)n+1
d)2n-1
e) zależy od liczby powtórzeń

16.w analizie Southern fragment sekwencji genu z drożdzy zostal uzyty jako sonda do analizy fragmentow powstałych w wyniku trawiania EcoRI DNA genowowego z jalpa. Na autoradiogramie zaobserwowano zadioaktywne pasmo odpowiedajace fragmentowi DNA o dłudości 4 kb.Oznacza to ze:
a)gen jalpa ma 4kb
b)gen japla jest taki jak gen drozdzy
c)gen japla jest obcy w preparacie poddanym analizie
d)gen japla jest obecny w 4ch kopiech w genomie
e) gen japla ma taka sama sekwencje jak gen drożdzy

ęęłęóW metodzie selekcji przez komplementację transformanty są białe - powstaje tylko niekompletny fragment, powiedzmy LacZ' (bis), B-galaktozydazy. Komórki transformowane 'pustym' wektorem są niebieskie - insert nie rozrywa genu LacZ'. Komórki nietransformowane giną pod wpływem Amp.

ęęłęó1) jak transformowano bakterie pBR322 otrzymano 108 kolonii. Ile otrzymamy jak transformujemy bakterie plazmidem z insertem o dl. (chyba) 2000pz.

odp. mniej bo im mniejsza cz. DNA tym lepiej bakteria ją łyknie (z insertem jest wiekszy niz sam plazmid)

2) Ktory enzym jest przede wszystkim odp. za utrate fragmentu 5' sekwencji cDNA

ja dalam polimeraza DNA I , bo odwrotna transkryptaza ma starter komplementarny do AAAAAA na 3' koncu mRNA a jak ona juz zrobi ta cz. DNA to pol.DNA I moze miec problem ze starterem

5-------------------------------AAAAAAAAAAA3 mRNA
_________TTTTTT (starter dla odw. transkryptazy)


5---------------------------------AAAAA3 (RNA)
3---------------------------------TTTTT5 (1szy DNA)
^^^ tu jest problem wlasnie (a to robi pol. DNA)

3) Ktory z procesow nie dotyczy techniki primer extension

tu nie pamietam co bylo

1.Charakterystyka wektora(tylko rysunku nie ma hehheheheh)
a)wektor może być użyty do przygotowania biblioteki genomowej
b) zawiera geny markerowe
c)może replikować w komórkach bakteryjnych w sposób charakterystyczny dla plazmidów
d)zawiera COS –pakowanie do wektora
e)zawiera polilinker(sekwencje wielokrotnego klonowania)

ja tu mialam inne odpowiedzi i bez rysunku nie wiem o co chodzi

2.Nukleaza SI
a) może być użyta do lokalizacji sekwencji intronowych tak
b) może degradować DNA i RNA i powstaja produkty posiadajace sekwencje P-5’ tak
c) DNANA,RNA:RNA i DNA:RNA sa odporne na działanie tego enzymu tak
b) jest egzonukleazą NIE - endo!
e) używana do odtrawiania fragmentów kw.nukleinowych ,które maja forme pojedynczej nici tak

3.Który ze zwiazków może byz użyty jako substrat do enzymatycznego znakowania izotopem P32 fragmentu DNA o końcach tępych (ja pamietam ze tu bylo dodane ze chodzi o zn. 5')?
a) dATP znakowany P32 w pozycji g
b) ATP znakowany w pozycji a
c) dGTP znakowany w pozycji a
d) [g-P32] -ATP
e) [a-P32]-dATP

to sie robi kinaza polinukleotydowa wiec moze byc jakikolwiek ale zeby byw pozycji GAMMA, bo to kinaza i ona nie wbudowuje do lancucha tylko przenosi tą grupe PO4 co jest najdalej cukru

nie ma chyba roznicy czy to bedzie dATP w pozycji gamma czy ATP bo one i tak maja chyba taka sama energie
wiec d i a

4.Wektor plazmidowy poddano linearyzacji enzymem EcoRI został uzyty do ligacji z DNA powstałym w wyniku hybrydyzacji dwóch syntetycznych oligonukleotydów. Syntatyczny ds.DNA został tak zaprojektowany iż posiada konce identyczne z końcami wektora(EcoRI).Mieszanine poligacyjna poddano transformacji komórki bakteryjne i wylano je na podłoze zawierajace odpowiedni dla wekrota antybiotyk. Które z podanych ponizej twierdzen sa nieprawdziwe?
a)pośród powstałych klonów można było zaobserwować klony zawierajace wektor pozbawiony insertu tak bo mogle sie sam zamknac
b )pośród powstałych klonów można było zaobserwować klony zawierajace rekombinowany wektor z wbudowanym jednym fragmentem tak
c)pośród powstałych klonów można było zaobserwowac wektor zawierajacy wiecej niż jeden fragment tak bo jak to oligonukleotyd (krotki) i ma takie same wszystkie konce to moze tak byc
d)ligacji jednego fragmentu i czasteczki wektora towarzyszy powstanie 4ch wiazań fosfodiestrowych tak (po 2 wiazana na kazdej nici a to bylo dsDNA)
f) ligacji jednego fragmentu i czasteczki wektora towarzyszy powstanie 2ch wiazań fosfodiestrowych nie

5. Dwie próbki E.coli poddano transformacji plazmidem zawierajacym gen AmpR (opornośc na ampicylinę).Do pierwszej próbko dodano niewielka ilośc pozywki i wylano na podłoze.do drugiej również dodano niewielka ilosc pozywki i wylano na podłoze najpierw bez antybiotyku ,inkubowano przez 30 min w 37’C a potem na antybiotyk.:

na pierwszej na pewno bedzie mniej niz na 2 bo opornosc na ant. daje produkt genu a nie sam gen wiec komorka musi miec czas na zrobienie tego bialka co daje opornosc

a) szalka z próbką I:300 klonów i szalka z próbka II :300 klonów NIE
b) szalka z próbką I:300 klonów i szalka z próbka II :25 klonów NIE
c) szalka z próbką I:30 klonów i szalka z próbka II :400 klonów MOZLIWE, ZAKŁADAJĄC ZE SAME SIE TEZ MOGA ZMUTOWAC, ZWLASZCZA ZE TO MNIEJ NIZ 10% ALE NIE DAM SOBIE ZA TO GLOWY UCIAC
d) szalka z próbką I:0 klonów i szalka z próbka II :300 klonów TO JEST NA PEWNO OK
e) szalka z próbką I:3000 klonów i szalka z próbka II :30 klonów NIE

6.Dla elektroforezy nie jest prawdą: (chyba zalezy w jakim żelu )
a)superzwinięte czasteczki DNA wędruja szybciej niż liniowe prawda
b)cząsteczki DNA obdazone ładunkiem ujemnym wędrują do elektrody dodatniej prawda
c)mieszanian fragmentów Dna jest rozdzielana tym ekektywniej im któtsze sa fragmenty prawda
d)małe cząsteczki Dna wedruja najczescoej szybciej niż wieksze [przy załozeniu ze stosunek ładunku do masy jest bardzo podobny dla różnych DNA] prawda
e)cząsteczki o długości 302 i 303 pz mogą być rozdzielane dla agarozowego nie prawda, bo to do duzych cz. jest i musza miec duza roznice masy, a dla poliakryloamidowego prawda
Lanii (19:47)
7.Enzym restrykcyjny ClaI rozpoznaje sekwencje AT CGAT i trawi wiazanie fosfodiestrowe pomiedzy resztami TiC.enzym restrykcyjny TaqI rozpoznaje sekwencje T CGA:
ClaI : AT CGAT TaqI : T CGA
TAGC TA AGC T
^^ i to sie pewnie rozjedzie
a)ktotsze (chyba wystające raczej) fragmenty DNA generowane przez enzymy sa końcami komplementarnymi TAK
b) fragmenty powstałe po trawieniu enzymami sa tylko w czesci komplementarne W CAŁOŚCI KOMPLEMENTARNE
c)ClaI i TagI sa izoschizomerami IZOKAUDAMERAMI (TWORZĄ TAKIE SAME KOCE LEPKIE, IZOSCHIZOMERY TNA TĘ SAMĄ SEKWENCJĘ ALE NIE KONIECZNIE TAK SAMO)
d)dowolne fragmenty powstałe po trawieniu ClaI i TagI mogą być ligowane i następnie trawione ClaI NIE bo przy Taq za T lub A moze być cokolwiek a przy Cla musi byc ATCGAT
e)dowolne fragmenty powstałe po ligowaniu produktu trawienia ClaI i TagI mogą być trawione TagI tak

8.Klon może być użyty jako substrat do radioaktywnego znakowania fragmentu DNA przy wykorzystaniu fragmentu Klenowa polimerazy I DNA: (TO JEST BEZ SENSU BO KLON TO NIE SUBSTRAT DLA NICZEGO, ALE DLA POLMERAZY KLENOWA SUBSTRATEM DO ZNAKOWANIA SĄ dNTP ZNAKOWANE W POZ. ALFA - są wbudowywane do łancucha dlatego alfa - najblizej cukru)
a)dATP znakowany P32 w pozycji g
b)ATP znakowany w pozycji a
c) dGTP znakowany w pozycji a OK
d)[g-P32] -ATP
e)[a-P32]-dATP OK

10.Zakładajac ze polimeraza Tagi nie traci aktywnosci ani nie ulega rozkładowi,substraty PCR można powiedziec ze dov\celowa sekswncja Dna jest powielana po n-cyklach:
2 ^ (n-2) bo 2 pierwsze są bezuzyteczne

11.Który z podanych wektorów jest najmniej przydatny do sekwencjonowania genomu ssaczego?:
a)YAC
b)BAC
c)wektor bedacy pochodną faga l
d)kosmid
e)wektor plazmidowy (-- ten najmniej przydatny bo najmniej miesci

12.spośród podanych temperatur wybrac która z najwiekszym powodzeniem da wydajne otrzymanie produktów PCR przeprowadzajac dla startera 5’ GGTAATCGGTTAGGCTCC3’:
a)56’C
b)72’C
c)59’C
d)55̵ 7;C
e)żadna

Tm=4*(ilość G +ilość C) +2*(ilość A + ilość T)
temp. hybrydyzacji jest o 1-2 st. niższa do Tm
tu chyba bylo 55 st ale przelicz sobie bo nie wiem czy ta sama sekwencja byla w obu gr.

13.Który z podanych czynników istotny dla jednej z metod pozwalajacych an otrzymanie cDNA jest głównym winowajcą odpowiedzialnymza brak cDNA inf reprezentujacej 5’ koniec transkryptu:
a)5’AGCAATGG3’
3’TCGT5’
b)5’AGCAAT GG3’
3’ACC5’
c)5’AGCAATGG3’
3’TCGTTACC5&# 8217;
d)5’AGGAA3’
3’TCGTTACC5’
f) nie wiadomo

tu chyba kolezanka pomylila pytanie z odpowiedzią, bo odpowiedz na to pytanie jest w 1), a odpowiedzi są do tego gdzie najpierw starwiono DNA jakims e.r. co daje 5'konce lepkie a potem trawiono Bal31 i S1 wiec konce na pewno beda tepe (Bal31 i S1 sie o to postaraja), ale kij wie czy to nie byl hak i czy nie chodzi o odpowiez ze nie wiadomo bo nie wiadomo jaka byla sekwencja poczatkowa

14.Wektor plazmidowy zawiera gen markerowy odpowiedajacy za odpornośc na erytromycynę(EryR) i gen markerowy odpowiedzialny za opornośc na ampicylinę.Gen AmpR został przecięty enzymem restrykcyjnym a powstały w ten sposób plazmid połączono z fragmentem 1000pz o końcach komplemantarnych do wektora.Które z ponizsych fenotypów maja komórki transformowane: (insercyjan inaktywacja AmpR w rekombinowanych plazmidach, ja pamietam ze w pytaniu chodzilo nie o transformowane po prostu, tylko transformowane rekombinowanym)
a)niewrażliwe na ampicylinę & niewrazliwe na erytromycynę (-- to jest ok przy transformowanych wektorem NIErekombinowanym (samoligacja)
b) niewrażliwe na ampicylinę & wrazliwe na erytromycynę
c) wrażliwe na ampicylinę & wrazliwe na erytromycynę
d) wrażliwe na ampicylinę & niewrazliwe na erytromycynę (-- to jest ok przy transformowanych wektorem rekombinowanym
e)nie wiadomo
Lanii (20:10)
15.Kolista cząsteczka Dna posiada n-miejsc restrykcyjnych EcoRI.ile fragmentów DNA powstanie po całkowitym jej strawieniu?
a)n-1
b)n OK bo kolista, jak jest liniowa to jest wtedy n+1
c)n+1
d)2n-1
e) zależy od liczby powtórzeń

16.w analizie Southern fragment sekwencji genu z drożdzy zostal uzyty jako sonda do analizy fragmentow powstałych w wyniku trawiania EcoRI DNA genowowego z jalpa. Na autoradiogramie zaobserwowano zadioaktywne pasmo odpowiedajace fragmentowi DNA o dłudości 4 kb.Oznacza to ze:
a)gen jalpa ma 4kb NIE, bo nie wiadomo czy to caly gen czy jego fragment
b)gen japla jest takisam jak gen drozdzy NIE, mogą miec wspolne sekwencje ale ne musza byc cale takie same
c)gen japla jest obcy (NIE OBCY YLKO OBECNY BYŁO !!!) w preparacie poddanym analizie jesli obecny to ok - TU JESZCZE BYLO NAPISANE ZE GEN CZEGOŚTAM JALPA I TO JEST WAZNE BO GEN KODUJACY TO SAMO BIALKO Z DROZDZY BYL SONDĄ, GENY KODUJACA BIAŁKA Z TEJ SAMEJ RODZINY MAJĄ CZĘSTO PODOBNĄ SEKWENCJĘ (SEKWENCJE WSPOLNE) W ROZNYCH ORGANIZMACH
d)gen japla jest obecny w 4ch kopiech w genomie bez sensu zupelnie
e) gen japla ma taka sama sekwencje jak gen drożdzy no niby prawda ZAWIERA taka sama sekwencje ale nie zaznaczylam tego bo to brzmi tak jakby mial CAŁĄ sekwencję taka samą

ęęłęóDokładny wzór na ilość produktu po PCR to:

N=N'*((1+Y)^n)

gdzie N' - to ilość cząsteczek matrycy
n - ilość cykli
Y - efektywność polimerazy (od 0 do 1)

(miałam to na laborce)
Zakładając, że mieliśmy 1 matrycę oraz wiedząc z treści, że polimeraza nie traci aktywności (czyli efektywność=1), wzór upraszcza się do 2^n! Zresztą to jedyny wzór, jaki Endrju podał na wykładzie - więc nad czym tak debatować.

ęęłęóZ moich notatek:
Nukleaza S1:
- endonukleaza
- preferuje pojedyńcze nici
- substraty: DNA, RNA
- produkty 5'-p(Np)n-N

Bal 31:
zaliczana do end, ale zachowuje siejak egzonukleaza
Rzeczywista:
- endonukleaza
- substrat:ssDNA
- produkty:5'-p(Np)n-N
Pozorna:
- egzonukleaza
- substrat:dsDNA
- produkty: 5'-NMP

ęęłęóZ tego, co widzimy Bal31 działa tak samo jako S1, ale potrafi dodatkowo degradować liniowe dupleksy

ęęłęóBal31 - katalizuje degradację ssDNA, liniowego dsDNA i RNA do 5'-mononukleotydów.

Liniowe dupleksy DNA:DNA i RNA:RNA są degradowane jednocześnie od końców 5' i 3' (z obu stron odtrawiane są mononukleotydy).

Bal31 jest także endonukleazą, która przecina nicki i regiony ss dupleksów DNA:DNA i RNA:RNA.



Rzecz o nukleazie S1, z podręcznika 'Genomes 2':

Nukleaza S1 - enzym degradujący ssDNA i RNA.

Nie ma wpływu na DNA:DNA, RNA:RNA, DNA:RNA.

Degraduje jednak regiony jednoniciowe (np. nicki) ww. dupleksów.

Jednym słowem, degraduje wszystko, co jednoniciowe.

ęęłęóByła poprawna odpowiedź. Bowiem powiedziane zostało, że najpierw działano endonukleazą S1, która odtrawiła lepkie końce, a następnie ten dwuniciowy kompleks był nadtrawiany enzymem Bal31 (działa tak jak egzonukleaza symetrycznie odtrawiająca nukleotydy zarówno od 3' jak i 5' końca DNA). W wyniku tego powstał zatem fragment o końcach tępych

ęęłęóWektor trawiony jest przez EcoR1 (to chyba chodziło o faga lambda) i wstawiany jest do środka fragment 20 kbp:
a) mogą ze sobą ligować
b) dłuższy o 20 kbp
c) dłuższy o 40 kbp
d) łysinka zawiera cały genom wektorów
e) ?

do pytania wyzej- ęłęówektor był na pewno substytucyjny i chodzilo o to że nie wejdzie więcej niż 20 kbp więc wektor nie będzie dłuzszy o 40 kbp, najwyzej o 20 kbp, sam genom faga też nie moze być bo one są tak konstruowane ze sie nie zapakuje i takich łysinek nie będzie też, a ostatniej odpowiedzi nie pamietam

ęęłęóFagemidy : najprościej rzecz ujmując plazmidy, które zawierają miejsce replikacji faga M13. Stosuje się je dlatego, że do samego faga M13 można wklonować bardzo małe fragmenty, chodzi o zwiększenie długości insertów. Aby mogło dojść do ich pakowania, należy nadkazić hodowlę fagami M13. A ssDNA jaki dzięki temu uzyskujemy możemy użyć np. dla celów sekwencjonowania metodą dideoksy.

Miejsca cos- skrót od cohesive sites , miejsca jednoniciowe w genomie faga lambda, umożliwiają tworzenie kolistej cząsteczki faga lambda, która jest konieczna do integracji z genomem. Poza tym mają duże znaczenie przy replikacji i pakowaniu faga lambda.

Kosmidy : plazmidy, które zawierają miejsca cos. Tym razem zależy nam na tym, żeby zwiększyć pojemność fagów lambda. Tak naprawdę, zauważono, że DNA , które zawiera miejsca cos może zostać pakowane do płaszcza białkowego fagów lambda np. przez pakowanie in vitro.
Wykorzystano tę własność do tworzenia kosmidów- są to małe plazmidy, nie zawierające zbędnych informacji strukturalnych o fagu lambda takich jak genów białek otoczki, genów odpowiedzialnych za cykl lizogeniczny itp. Mają tylko miejsca cos, miejsce restrykcyjne, i marker odporności na antybiotyk. Jeżeli do takiego kosmidu wklonujemy insert, to tylko jeżeli będzie on określonej długości (odpowiednio duży) zostanie upakowany do cząsteczek fagowych. Potem infekujemy takimi 'pseudofagami' komórki bakteryjne - wszystkie klony są rekombinantami, gdyż kosmidy, które uległy np. religacji są zbyt małe aby mogły być upakowane.
Oczywiście nie powstają łysinki ponieważ nie dochodzi do lizy komórek gospodarza.

ęęłęóJeżeli insertem jest syntetyczny oligonukleotyd, to wtedy powstaną dwa wiązania, bowiem on nie ma grup fosforanowych na swoich 5' końcach.

ęęłęóZ notatek z wykładu: pojemnosci w [kb]:
cosmid 40
wektor fagowy 20
ale M13 2
plazmid 8
BAC 300.
Madziu, moze byc jak najbardziej tak zligowany insert ze bedą dziury czyli nicki i wtedy mamy 2 wiazania fosfodiestrowe. Jezeli sie wczesniej 5` konca nieufosforylowalo w tym sztucznym insercie to nic sie juz z tym nie da zrobic; zostaną 2 nicki. Kinaza przenosi reszte fosforanowa z dATP na 5` koniec. pa

ęęłęóKinaza polinukleotydowa jest enzymem specyficznym dla ATP i tylko dla ATP. Żadne inne entepy albo inne deentepy nie wchodzą w grę.

Co innego Polimeraza DNA - bierze dNTP a także ddNTP. Najwyraźniej dla niej te podstawniki hydroksylowe są bez różnicy, skoro metoda Sangera działa.

ęęłęóczy ktos mi moze dac odpowiedz na to pytanie??9.Przy pomocy techniki primer extension mozna mapowac 5’ koniec transkryptu.w tym celu mozna tez posłużyc sie techniką wykorzystujaca nukleazę SI.która z podanych ponizej informacji nie ma miejsca przy primer extension?:
a)....
b)denaturacja DNA i elektroforeza
c)hybrydyzacja
d)wariant tej techniki może być uzyty do mapowania 3’ końca,reakcja przy udziale rekombinowanego enzymu
e) ....

ęęłęótu tzreba bylo wskazac nieprawidlowa odp z tego co pamietam. I zaznaczylam d bo tak mis ie wydawalo. Inne procesy maja miejsce wiec sa prawdziwe

ęęłęóNależy zaznaczyć b) i d).

B) dlatego, że 'denaturacja DNA' NIE zachodzi. Zachodzi za to denaturacja dupleksu DNA:RNA.