Działanie odległe trucizn

• takie działanie ksenobiotyków, którego efekt pojawia się po pewnym okresie latencji, po kilku dniach, miesiącach, latach.

Działanie odległe trucizn może dotyczyć:

1. Organizmu bezpośrednio narażonego

1. Dochodzi wtedy często do przerostu nowotworowego

2. Następnego pokolenia

1. Genotoksyczne (najważniejsze, decyduje o dużym niebezpieczeństwie działania odległego trucizn)

2. Embriotoksyczne

3. Teratogenne

Działanie odległe trucizn, to:

1. Działanie mutagenne

2. Karcynogenne

3. Teratogenne

1. Mutacje genowe = punktowe (= MUTAGENEZA)

Zmiany w obrębie zasad: transwersja, tranzycja, insercja, delecja

2. Mutacje chromosomowe (=KLASTOGENEZA)

Zmiany w obrębie nukleotydów: inwersja, delecja, translokacja

3. Mutacje genomowe (=ANEUPLOIDACJA)

Dotyczą ploidalności komórek, np.: monosomia, trisomia (np. 21 pary)

Typy związków mutagennych

brak związków specyficznych, wywołujących konkretną mutację, na ogół są to mutacje punktowe i chromosomowe

• Czynniki alkilujące

Bardzo silne mutageny; metylują lub etylują zasady, głównie guaninę

Iperyt, tlenek etylenu, DMS, nitrozomocznik

• Analogi zasad (bardzo częste)

Wchodzą w miejsce zasad do kwasów nukleinowych.

2-aminopuryna, 5-bromouracyl, 7-hydroksycytozyna

• Czynniki doprowadzające do deaminacji zasad

HNO₃

Przykłady związków ulegających deaminacji i produkty:

Cytozyna uracyl

Adenina hipoksantyna

Guanina ksantyna

• Czynniki powodujące powstawanie dimerów

UV

• Czynniki powodujące zmianę fazy odczytu

Wnikają między zasady i rozluźniają połączenia między nimi

Barwniki akrydynowe (oranż akrydyny), barwniki anilinowe

• Czynniki działające pośrednio przez zakłócenie mitozy

Wodzian chloralu nierównomierny podział chromosomów między 2 potomne komórki

Eter

Hg pęknięcie chromosomów - wykazuje 1000x silniejsze działanie od kolchicyny

Kofeina,

Hydroksylamina przerwanie ciągłości chromatyny

• Czynniki indukujące system SOS

UV, promieniowanie jonizujące, bromouracyl

Kancerogeneza

Stanowi 70-80% wszystkich przypadków chorób nowotworowych, jest uwarunkowana środowiskowo.

Kancerogeneza chemiczna

Grupy związków

(trudna klasyfikacja ze względu na dużą ilość związków)

• Nieorganiczne

Sole arsenu, chromu, niklu, kadmu

• Organiczne

Benzen, α2-naftyloamina, chlorek winylu, policykliczne węglowodory aromatyczne

• Substancje złożone

sadze, smoła, oleje mineralne

• Związki naturalne

aflatoksyny, nitrozaminy, mikotoksyny - najsilniejsze kancerogeny zwłaszcza aflatoksyna B1 (uważa się, że 1 cząsteczka jej wystarczy aby wywołać działanie kancerogenne). Dla tej mikotoksyny przykładowy okres latencji wygląda następująco:

Pstrąg jest bardzo wrażliwy na tę substancję, już narażenie na 1/10 μg powoduje raka wątroby w ciągu 5 dni!!

Inne to ochratoksyny wywołujące przede wszystkim raka nerek

Benzo(a)piren z jarmużu

Podział kancerogenów:

1. Kancerogeny pierwotne

Związki które bezpośrednio oddziaływują z DNA po wniknięciu do organizmu, doprowadzają do kancerogenezy

2. Prokancerogeny = biokancerogeny

Muszą być wcześniej zmetabolizowane aby uzyskały zdolność do kancerogenezy, np. aflatoksyna B1 metabolizm do formy epoksydowej

3. Kokancerogeny same nie inicjują procesu nowotworzenia, wzmagają działanie

4. Promotory powyższych

Klasa	Podklasa	Działanie	Przykłady
Genotoksyczne	1. Kancerogeny pierwotne	Reakcja bezpośrednia z DNA	Rodniki nadtlenkowe, Ni, Be, Cd, Co, chromiany, krzemiany, epoksydy
		2. Prokancerogeny	Reakcja z DNA po aktywacji BIOKARCYNOGENU	Aminy aromatyczne, nitrozaminy, CH-aromatyczne, CH-policykliczne, CCl4, chlorek winylu, aflatoksyna
	Epigenetyczne	3. Kokancerogeny	Wzmagają działanie 1 i 2 przy jednoczesnej obecności	SO2, azbest, katechol, etanol
		4. Promotory	Wzmagają działanie 1 i 2 podane po związkach 1 i 2	Estry forbolu, kwasy żółciowe, sacharyna, estradiol

Możemy mówić o pewnej specyficzności działania, np.:

• Aflatoksyna B1 głównie rak wątroby

• Ochratoksyny głównie rak nerek, pęcherza moczowego

• DMNA (dwumetylonitrozoamina) rak wątroby, pęcherza moczowego

• Kadm nerki

• Arsen skóra

• Benzen szpik

Działanie teratogenne

anomalia strukturalna i czynnościowa, wrodzona ale w przypadku toksykologii poprzez działanie teratogenne rozumiemy anomalie wrodzone, ale nie uwarunkowane genetycznie

Zmiany teratogenne mogą powstawać na różnych etapach rozwoju organizmu.

Związki działające Związki nie mające działania

GENOTOKSYCZNIE GENOTOKSYCZNEGO

Komórki Komórki zarodka i Płód Organizm matki

Rozrodcze płodu

Anomalie rozwojowe Anomalie strukturalne i Nie dziedziczone Zaburzenie homeostazy

i dziedziczące się czynnościowe nie dziedziczące organizmu (np.: zmiana

(nie dla toksykologii) się w ukrwieniu niedotle-

nienie płodu

Przy ocenie toksyczności poszczególnych związków biorąc pod uwagę toksykologie i toksykokinetykę mówimy, że:

Teratogen - związek doprowadzający do anomalii morfologicznych lub czynnościowych tylko wtedy, gdy działa w okresie organogenezy (formowania narządów).

(zastosowano taka definicję, aby można było sklasyfikować związki i ujednolicić klasyfikację)

Np.:

Etylenonitrozomocznik

Działa na

Organizm dorosły Okres organogenezy

Kancerogenny Teratogenny

Thalidomid - miał działać p/wymiotnie i poprawiać samopoczucie podczas ciąży, jednak okazało się, że prowadzi do zmian rozwojowych

W Niemczech zachodnich w 1959 roku zanotowano 17 przypadków, w 1960 126 a w 1961 477.

Fokomegalia

20% działania między 21-26-35 dniem

1. dzień - ucho zewnętrzne

24-27 dzień - ramiona

27-29 dzień - nogi

29-36 dzień - kciuki

koniec wrażliwości po 36 dniach

Działanie teratogenne ponadto wykazują:

Witamina A ( wysokich dawkach prowadzić może do anomalii trzewioczaszki, funkcji serca, kośćca - podobnie jak etanol), witamina B, androgeny, estrogeny, insulina, etanol, tiuram, karbacyl (bardzo silne działanie teratogenne), związki magnezu a także witamina C.

Podsumowanie:

Działanie genotoksyczne

Ekspozycja na efektywne mutacje

Indukcja mutacji

Somatyczne komórki płciowe

dorosły zarodek, płód

Nowotworzenie Teratogeneza Letalne, Przenoszone

nieprzenoszone genetyczne zmiany

Toksykometria

Zajmuje się oceną niebezpieczeństwa, oceną ryzyka, jakie istnieje w związku z narażeniem na ksenobiotyk.

Cele:

• Wykrycie szkodliwego działania substancji

• Jakościowa i ilościowa charakterystyka tego działania

• Ustalenie przyczyny śmierci

• Ocena stopnia ryzyka

• Wyjaśnienie mechanizmów działania toksycznego

• Opracowanie postępowania, które pozwoli zapobiec rozwojowi działania toksycznego (złagodzić lub przerwać działanie już występujące)

• Ocena najwyższego dopuszczalnego stężenia danego związku w środowisku / produkcie pokarmowym / paszy

• Wydawanie orzeczeń dotyczących dopuszczenia środka do obrotu / produkcji

Zakres badań:

zgodnie z aktualnym stanem wiedzy

~ badania wymagają odpowiedzialności za wyniki od osób je przeprowadzających

W latach 60 w związku z rosnącą produkcją ksenobiotyków powstały wymogi badań, jakie związek musi spełnić aby zostać zarejestrowany.

• Zwierzęta doświadczalne

• Gatunek (co najmniej 3 gatunki, z czego 1 to nie gryzoń)

• Płeć (badania na obu płciach)

• Wiek (zwierzęta młode, rosnące)

• Droga narażenia i czas

Droga narażenia - zastosowanie; czas - toksyczność ostra / chroniczna

• Warunki higieniczno-sanitarne pomieszczeń

Badania najczęściej w warunkach sterylnych

• Pasza

Badania toksyczności:

określenie stopnia toksyczności

Badanie toksyczności ostrej

podostrej wszystkie związki

chronicznej

Badanie działania kancerogennego

mutagennego działanie odległe

teratogennego

W zależności od wyników powyższych wykonuje się badania specyficzne:

Badanie działania neurotoksycznego

embriotoksycznego

uczulającego

Badanie wpływu na rozrodczość i potomstwo

+ dodatkowe badania, zwłaszcza ostatnio, ekotoksyczności związków

Zasady:

Badanie toksyczności ostrej (A-DL₅₀)

Działanie w ciągu 24-48 godzin, młode zwierzęta (4 grupy po 6 sztuk)

• wielkość dawki w grupach zwiększa się w postępie geometrycznym (1,2,4...)

• najniższa dawka nie może powodować śmierci

• ksenobiotyk wprowadzony bezpośrednio do żołądka (w postaci roztworu lub zawiesiny)

• zwierzęta głodzone 10-12 h

• pokarm podany po 3-5 h

Określa się liczbę zwierząt padłych w ciągu 48h

Resztę obserwuje się przez 2 tygodnie

Wylicza: A-DL₅₀ [mg/kg m.c.]

(nie należy zapominać, że prowadzi się także grupę kontrolną otrzymującą jedynie rozpuszczalnik, w jakim zawieszono ksenobiotyk lub nie otrzymującą niczego)

CEL: !!!

To NIE TYLKO stwierdzenie śmierci zwierząt!!!

• Ustalenie DL₅₀ przybliżonej i przybliżonej dawki tolerowanej

• Wyniki pozwalają na klasyfikacje trucizn

• Poznanie sposobu działania trucizny co pozwala ukierunkować dane badanie

• Wstępna kliniczna ocena zatrucia, określenie przyczyny śmierci

ORAZ:

• Wyliczenie wskaźnika względnej skuteczności odtrutek (posługując się obserwacjami dodatkowej grupy zwierząt, której oprócz ksenobiotyku była podawana również odtrutka)

Relative efficiency index

Np.:

A-DL₅₀ g/kg

Etanol 10,000

NaCl 4,000

DDT 0,100

Tubokuraryna 0,0005

Dioksyna 0,000001

Toksyna botulinowa 0,00000001

Toksyczność kumulacyjna (C-DL₅₀)

Wielokrotne, codzienne podanie wysokich dawek (24 dni)

Metoda Lima:

Pierwsza dawka = 9% A-DL₅₀

Co 4 dni dawkę zwiększa się 1,5x

Współczynnik kumulacji: (na podstawie doświadczenia)

Jeżeli:

C-DL₅₀ < A-DL₅₀ kumulacja trucizny w organizmie, ALE taka sama sytuacja będzie przy kumulacji działania

C-DL₅₀ > A-DL₅₀ powstanie tolerancji na truciznę

C-DL₅₀ = A-DL₅₀ brak kumulacji, brak tolerancji

Wyznaczenie współczynnika Km pozwala na ocenę:

• skutków ekspozycji przedłużonej

Znajomość Km jest pomocna przy ustaleniu współczynnika bezpieczeństwa przy ekstrapolacji wyników na człowieka

Toksyczność podostra = „test 90 dniowy”

4-5 tygodniowe szczury, 4 grupy (60 sztuk)

Ksenobiotyk podawany z paszą codziennie

Dawka tak ustalona, aby:

Najmniejsza - brak zmian

Największa - zmiany, ale nie śmierć

Czas trwania:

1/10 czasu życia zwierzęcia

szczury 2-3 miesiące (stąd nazwa „test 90 dniowy”)

psy 8 miesięcy

Po 14, 28, 90 dniach badania: moczu, krwi, narządów, tkanek

CELE:!!!

• określenie narządu docelowego działania

• określenie charakteru zmian i ich odwracalności lub nieodwracalności

• ustalenie dawki NOEL / NOAEL

• czy substancja kumuluje się

• czy i w jakiej dawce jest tolerowana

• ustalenie różnic międzypłciowych i międzygatunkowych

• określenie zakresu dawek do badania działania przewlekłego lub innych specjalistycznych badań (np.: toksykologii rozrodu)

Toksyczność chroniczna:

Czas trwania - całe życie (?)

Praktycznie:

Szczury 2 lata

Psy, świnie 5-7 lat

Szczury: młode 4-5 tygodniowe (3 grupy po 100)

Dawki:

Najniższa - nie wywiera działania

Najwyższa - najniższa działająca

Pośrednia

Badanie:

Po 6, 12, 18, 24 m-cach: neurologiczne, biochemiczne, histologiczne, A-P

W celu dokładniejszego prowadzenia badań należy określić wskaźnik konwersji pokarmu stanowiący stosunek przyrostów masy ciała do spożycia paszy. Zmiany tego wskaźnika obserwowane są już w momencie kiedy badana substancja wykazuje działanie toksyczne, które jeszcze nie jest manifestowane objawami klinicznymi.

Badanie toksyczności chronicznej pozwala na:

• ustalenie NDD, NSD

• NOAEL

• ADI

• Narządów krytycznych

• Zależność dawka-efekt

• Ustalenie współczynnika bezpieczeństwa przy ekstrapolacji wyników na człowieka

Badanie działania kancerogennego i mutagennego:

Badania krótkoterminowe działania mutagennego

Szybkie testy skriningowe

Mutacje postępowa drożdże, grzyby

Mutacje powrotne bakterie

Reperacja DNA komórki zwierzęce

Indukcja SOS hodowla komórkowa

! Bardzo ważna jest ich zgodność z wynikami testów in vivo

Jeżeli zostało stwierdzone, że badany związek wykazuje działanie genotoksyczne - to ta informacja już go eliminuje z dalszych badań i rejestracji.

• Testy Ames'a (1975r.)

Mutanty Salmonella typhimurium

Szczep LT2

Ilościowa ocena rewersji mutacji w obrębie operonu histydynowego

• Możliwa ocena działania pierwotnych kancerogenów

• Test Ames'a zmodyfikowany + mikrosomy

• Możliwa ocena działania prokancerogenów

• Kokarcynogeny - NIE

• Promotory - NIE

Długoterminowe badania kancerogenezy

Zwierzęta: szczury, myszy, złote chomiki

Swoista podatność w/w zwierząt na nowotwory:

Nowotwory wątroby myszy

Nowotwory pęcherza moczowego chomiki

Guzy podskórne szczury

Płeć: obie

Wiek: ?

4-5 tygodni - szczury

Dawki:

Co najmniej 3

Najniższa - nie powinna wywoływać zmian

Najwyższa - nie powinna w istotny sposób wpływać na przeżycie zwierząt

Podawanie:

Codziennie z paszą lub wodą

Doświadczenie kończy się uśpieniem i dokładnym badaniem nie dotyczącym jedynie nowotworzenia, ale badaniem kompleksowym (jak w chronicznej)

Substancję należy uznać za wywołującą działanie rakotwórcze jeżeli:

• istotny wzrost ogólnej liczby nowotworów

• istotny wzrost liczby nowotworów w określonym narządzie / tkance

• wcześniejsze pojawienie się nowotworów w grupie doświadczalnej w stosunku do grupy kontrolnej

• dodatnią korelację między wielkością narażenia a liczba nowotworów (?)

W każdym przypadku jeżeli stwierdzimy, że dany czynnik wywołuje działanie toksyczne lub karcynogenne to zawsze na końcu należy zrobić dodatkowe doświadczenia w celu ustalenia dawki nieszkodliwej.

Badanie działania teratogennego:

Szczury Chomiki Króliki

Grupa doświadczalna

K 1/5 1/50 1/250 LD₅₀

Podawanie badanego czynnika codziennie w okresie organogenezy

Dawki:

1/20 i 1/500 DL₅₀

80% cesarskie cięcie przed fizjologicznym okresem porodu

20% normalny poród i obserwacja do 3 m-ca

USTALIĆ DAWKĘ NIESZKODLIWĄ!

Pomiary i obserwacje:

Matki: masa ciała, spożycie paszy i wody, liczba płodów żywych i martwych, liczba późnych i wczesnych resorpcji, liczba ciałek żółtych

Płód: anomalie strukturalne i morfologiczne, masa ciała, długość ciała, długość ogona, masa płodu z łożyskiem

50% płodów z każdego miotu do badań

• szkieletu

• narządów miąższowych

Należy tu brać pod uwagę spontaniczne wady rozwojowe oraz dużą śmiertelność prenatalną!

Cele badań toksykologicznych:

Ocena ryzyka wynikającego z narażenia na dana substancję.

• Toksyczność ostra

• Ocena ryzyka przy zatruciu ostrym, skutki tego zatrucia i możliwość terapii

• Toksyczność chroniczna

• NOAL

• ADI

• Badanie działania odległego

• Ocena ryzyka przy długotrwałym narażeniu na dana substancję

• Przewidywanie skutków tego narażenia

• Ocena ryzyka w odniesieniu do specyficznych układów lub funkcji organizmu (narządy, tkanki krytyczne)

Wyznaczenie koncentracji ksenobiotyku, który przy codziennym narażeniu przez całe życie (zwierząt, ludzi) nie wywoła ujemnych skutków zdrowotnych.

Wyniki badań toksykometrycznych stanowią:

• podstawę do dopuszczenia danego związku (preparatu) do stosowania

• podstawę do wydania orzeczeń dotyczących produkcji, dystrybucji i zastosowania różnych substancji

• podstawę do ustalenia poziomów ekspozycji

Poniższy tekst pani Profesor odradziła przepisywać...

Zaakceptowanie ryzyka jako miary bezpieczeństwa oznacza też zaakceptowanie faktu, iż niebezpieczeństwa nie można wyeliminować całkowicie - opcja zerowa nie jest możliwa.

Podstawowym wysoce subiektywnym kryterium podjęcia decyzji jest poziom ryzyka, który jesteśmy w stanie (lub musimy) zaakceptować, zależny od poziomu materialnego rozwoju społeczeństwa i preferencji społecznych

Poziom ekspozycji:

NEL no effect level brak efektu szkodliwych

NOEL no observable effect level brak zauważalnych efektów szkodliwych

NOAEL no observable adverse effect level brak dających się zaobserwować skutków

działania szkodliwego

Współczynnik ten określany jest w mg/kg paszy, każdy z nich znaczy to samo ale najbardziej aktualny (i do zapamiętania) jest NOAEL. Określa się go podczas badań chronicznych i podchronicznych - patrz wcześniej.

LOAEL lowest observed adverse effect level

Przy narażeniu codziennym dochodzi do pojawienia się efektów (ale przy najniższej dawce). Określany w mg/kg paszy.

MRL maximum residue limit (leki, pestycydy)

Maksymalny poziom pozostałości w tkankach roślin i zwierząt (leków i pestycydów)

MCL maximum contaminant level (woda)

ADI acceptable daily intake

Obliczany na podstawie NOAEL, MCL oraz MRL. Określa dopuszczalne dzienne spożycie w mg/kg masy ciała

Np.:

Jeżeli ADI = 2 mg/kg m.c. codziennie można pobierać 2 mg/kg m.c. danego związku, przez całe życie bez efektów szkodliwych. Określany podczas badań toksyczności chronicznej oraz wszystkich parametrów odległych.

NDS najwyższe dopuszczalne stężenie (środowisko pracy, 8h/dzień, 40h/tydzień)

NDSch najwyższe dopuszczalne stężenie chwilowe (również środowisko naturalne)

Punktem wyjścia do wyznaczenia ADI jest wartość NOAEL jak również MCL i MRL.

NOAEL x spożycie (kg/kg m.c.)

ADI =

Współczynnik bezpieczeństwa

Współczynnik bezpieczeństwa: 10 - 10000 (w zależności od charakteru związku)

Określane w mg/kg m.c.

Rzeczywiste dzienne dopuszczalne spożycie:

ADI x masa ciała / dzienne pobranie produktu (kg x 2,5)

Zawsze bierzemy NOAEL od gatunku najbardziej wrażliwego:

NOAEL x 0.05 (szczur) lub 0.02 (pies) kg/kg m.c.

ADI =

Współczynnik bezpieczeństwa

Gdy:

Szczury NOAEL = 100 mg/kg paszy

Psy NOAEL = 50 mg/kg paszy

To ADI dla człowieka:

50 x 0,02

ADI= = mg/kg m.c. = 0,01 mg

100

Razem rzeczywiste dzienne dopuszczalne spożycie:

ADI x m.c. / dzienna dawka (kg x 2,5)

Uznawany nawet za kancerogen pierwotny bo przyspiesza proliferację komórek

Najwyższa dopuszczalna dawka

Najwyższe dopuszczalne stężenie

Tox 5

- 12 -

---