Mikotoksyny i mikotoksykozy

Zanieczyszczenie mikotoksynami surowców, produktów spożywczych i pasz stanowi obecnie podstawowy problem toksykologii żywności.

• Powszechne skażenie surowców i produktów spożywczych mikotoksynami

• Niemożliwość kontrolowania zawartości MTX we wszystkich surowcach i produktach spożywczych (kosztowna analityka)

• Olbrzymia stabilność MTX i ich oporność na działanie czynników fizycznych i chemicznych

• Nieznany (w wielu przypadkach) mechanizm działania toksycznego ( brak terapii specyficznej)

• Niedostatecznie rozpoznane ryzyko zagrożenia

• Brak terapii zatruć MTX

• Brak (wyłączając aflatoksyny) regulacji prawnych dotyczących najwyższych dopuszczalnych zanieczyszczeń MTX pasz i produktów spożywczych

Mikotoksyny def.:

Wtórne metabolity grzybów niższych syntetyzowane podczas wzrostu przy zapewnieniu odpowiednich warunków środowiska.

Substrat	Pierwotny metabolit	Wtórny metabolit
Octan melonian	Związki wielopierścieniowe	Aflatoksyny, ochratoksyny, patulina, cytrynina, sterigmatocystyna, zearalenon
Mewalonian	Terpeny, sterydy	Fumagilina, trichoteceny, fusarenon, wenukacyna
Pirogronian, mleczan	Metabolity cyklu TCA	Rubratoksyny
Aminokwasy		Fumitremogeny, paspalitrem, alkaloidy ergotaminowe (~sporysz)

Mikotoksyny mogą być zatrzymywane w grzybach lub uwalniane do środowiska ważne przy szacowaniu ryzyka zagrożenia.

Obecność pleśni nie jest równoznaczna z obecnością mikotoksyn!

Brak pleśni nie jest równoznaczny z brakiem mikotoksyn!

Do organizmu zwierząt i ludzi przedostają się drogą pokarmową lub inhalacyjną.

Aspekty narażenia na działanie mikotoksyn

1. Działanie specyficzne

Charakterystyczne dla danej MTX lub określonej grupy MTX

Chodzi głównie o specyficzność narządową

2. Działanie niespecyficzne

Dotyczy wszystkich MTX

1. Bardzo silne działanie immunotoksyczne gwałtowne załamanie odporności organizmu

2. Działanie odległe

1. Mutagenne

2. Kancerogenne

3. Teratogenne

Czynniki wpływające na wzrost pleśni i produkcję MTX

1. Wilgotność

2. Temperatura

3. Dostęp tlenu

4. pH

5. Inne

Podłoże (stan chemiczny, stan fizyczny np. ziarno uszkodzone jest bardziej podatne na infekcję grzybiczą)

Właściwości genetyczne pleśni (są tysiące grzybów niższych, ale tylko część z nich produkuje związki toksyczne)

Wilgotność:

W zależności od stopnia zapotrzebowania na wilgotność wyróżniamy:

• Grzyby występujące w warunkach polowych

Wilgotność optymalna 22-25%

Ziarna zbóż, inne trawy, inne rośliny

Fusarium (!)

Altenaria

Cladosporium

Helmintosporium

• Grzyby występujące w paszach przechowywanych

Wilgotność optymalna 13-18%

Rozwijają się na nasionach przechowywanych

Aspergillus

Penicillium

• Grzyby gnilne

Wilgotność optymalna 20-25%

Fusarium graminearum

Temperatura:

Ogólnie pleśnie rozwijają się w temperaturze 20-30°C

Ale rozwój niektórych pleśni możliwy jest w szerokim zakresie 0-60°C

Od temperatury zależy tempo wzrostu grzybów i rodzaj produkowanych metabolitów, np.:

Maksymalna produkcja toksyn przez Fusarium zachodzi w temperaturze bliskiej 0°C

Maksymalna produkcja kwasu penicylowego przez Penicillium zachodzi w temperaturze 1-10°C

pH:

• Optymalne pH dla produkcji ochratoksyn to wartość 5,6

• Patulina w pH 3,6 2,94 mg/g

• Zearalenon w pH 7,0 2,21 mg/g

Specyficzność działania w odniesieniu do narządów

1. Hepatotoksyczne

2. Nefrotoksyczne

3. Neurotoksyczne

4. Wpływające na układ hormonalny

5. Dermatotoksyczne

6. Kardiotoksyczne

7. Trichoteceny (wpływają na funkcję różnych narządów)

8. Różne

Ad.1.

Aflatoksyny, rubratoksyny, sterigmatocystyna, luteoskyryna, cyklochlorotyna, fomopsyna, sporidesmina

Ad.2.

Ochratoksyny, cytrynina, oosporeina

Ad.3.

Penitretemy i inne tremogenne, patulina, satratoksyna, alkaloidy sporyszu (ergotaminowe), moniliformina ( fumonizyny), lolitremy, paspalitrem, slaframina

Ad.4.

Zearalenon (estrogenne), alkaloidy ergotynowe

Ad.5.

Toksyna T-2, stachybotrytoksyna

Ad.6.

Cyteowirydyna, moniliformina

Ad.7

Toksyna T-2, deoxyniwalenon (womitotoksyna) DON, satratoksyna, alkaloidy sporyszu

Podział biorący pod uwagę siłę działania odległego

• Mutagenne / karcynogenne

Aflatoksyny, fumonizyny, gryzeofulwina, ochratoksyna A, luteoskyryna, T-2, sterigmatocystyna

• Teratogenne

Ochratoksyna A, patulina, aflatoksyna B₁, T-2

• Immunotoksyczne

Aflatoksyny, ochratoksyna A, cytrynina, rubratoksyna, patulina, trichoteceny, gliotoksyna

Aflatoksyny

Aspergillus sp.

Aspergillus flavus

1. parasiticus

1. clavatus

Penicillium puberulum

Jest to pierwsza wykryta MTX, wykryta w Wielkiej Brytanii po masowych upadkach drobiu

Występowanie aflatoksyny

Arachidy	20-36000 ppb (μg/kg)
Nasiona bawełny	300000 ppb
Kukurydza	3-500 ppb
Zboże	10-400 ppb
Mleko (M1)	50-500
Wysłodki buraczane
Zielonki

Doskonałym substratem do produkcji aflatoksyny jest chleb.

Rozwijają się przy wilgotności 14%

Duże zagrożenie w krajach tropikalnych

Grupy:

1. Aflatoksyny B fluoryzują w świetle UV na niebiesko

2. Aflatoksyny G fluoryzują w świetle UV na zielono

+ metabolity

Podstawowy Aflatoksyna M₁ (wynik metabolizmu G i B)

Aflatoksyna P₁, Q₁

Aflatoksikon (rezerwa toksyczności w organizmie)

• Związki policykliczne, nienasycone

• Dwa pierścienie kumarynowe wykazują działanie zaburzające krzepnięcie krwi

• Połączone z pierścieniami furanowymi

Kinetyka:

Wchłanianie - słabo rozpuszczalne w wodzie, duża lipofilność, wszystkie drogi

Dystrybucja - kumulacja w wątrobie, pozostałości w mm. szkieletowych, nerkach, tkance tłuszczowej

Wątroba 1,6 - 8 ppb T½org. - lata…

520 ppb

Metabolizm:

• Demetylacja

• Hydroksylacja

• Epoksydacja

• Koniugacja z UDPGA (również z glutationem)

Metabolizm B₁

Aktywacja Detoksykacja

Aflatoksyna B₁

P-450 P-450

Epoksydacja Hydroksylacja (P₁)

Demetylacja (Q₁, M₁)

B₁-epoksyd Q₁, P₁, M₁ (mleko!!!)

(kancerogen pierwotny)

Redukcja

Inicjacja kancerogenezy Sprzęganie z UDPGA

(Łączenie się z am-kw,

powinowactwo do kwasów nukl.)

Wydalanie: żółć, mleko, mocz, jaja

Aflatoksikon

Wydalanie - przede wszystkim do żółci

Z żółcią 60% (recyrkulacja)

Z moczem 20%

Do mleka ~1,5%

Liniowa zależność między ilością MTX B₁ pobraną a poziomem aflatoksyny M1 w mleku.

Mechanizm działania aflatoksyn:

• Hamowanie syntezy DNA (hamowanie aktywności polimerazy)

• Hamowanie syntezy RNA

• Obniżenie syntezy białka

• Hamowanie transportu elektronów

• Obniżenie zawartości glikogenu

• Spadek poziomu glutationu

• Działanie immunosupresyjne

• Działanie hamujące proces krzepnięcia krwi

• Silne działanie hepatotoksyczne

Oraz

• Działanie uszkadzające na lizosomy (wyciek enzymów)

• Działanie uszkadzające mitochondria

Objawy:

Zatrucia ostre:

• Nagła śmierć

Zatrucia podostre:

• Wybroczynowość

• Żółtaczka

Zatrucia chroniczne:

• ↓ apetytu

• ↓ wykorzystania paszy

• ↓ tempa wzrostu

• ↓ produkcji

• Zmiany charakterystyczne dla anemii

• Zaburzenia procesu krzepnięcia, wybroczynowość

• Powiększenie jamy brzusznej

• Zmiany charakterystyczne dla żółtaczki

• Poronienia

Zmiany biochemiczne mające znaczenie diagnostyczne:

• ↑ aktywności GOT i GPT w osoczu

• ↑ aktywności fosfatazy alkalicznej

• ↑ aktywności LDH, GLDH

• ↑ poziomu Bb w osoczu

• ↓ poziomu białka w osoczu (to co może być charakterystyczne)

Diagnoza na podstawie zawartości MTX w paszy i we krwi!!!

Terapia:

• Brak specyficznej

• Usunąć zanieczyszczoną paszę

• Dieta niskotłuszczowa, niskowęglowodanowa z ↑ zawartością białka lekkostrawnego + prekursory glutationu (cysteina acetylocysteina), witamina A i E oraz selen.

• ZAPOBIEGANIE!!!!

Post mortem:

• Zmiany w wątrobie zależne od stopnia narażenia na MTX

• Powiększenie wątroby

• Żółte zabarwienie

• Zmiany nekrotyczne

• Fibroza

• Marskość

• Występowanie guzów

• Powiększenie pęcherzyka żółciowego

• Hyperplasia przewodu żółciowego

• Krwotoczne zapalenie żołądka i jelit

• Wybroczynowość

• Krwotoki podskórne

• Wybroczyny w płucach, nadnerczach, nerkach

• Zmiany w innych narządach

• Zmiany degeneracyjne istoty szarej mózgu i rdzenia kręgowego (owce, bydło)

Toksyczność:

A DL₅₀ B₁ mg/kg m.c.

Królik 0,3

Kot 0,55

Świnia 0,62

Pies 0,5-1,0

Szczur m.ż. 7,2-17,9

Owca 1,0

Kaczki 0,5

Kaczęta 0,03

Pstrągi 0,10

Działanie kancerogenne

μg/kg paszy (100 dni)	Rak wątroby	Czas wystąpienia
0	0/18	-
1	2/22	104
5	1/22	93
15	4/21	96
50	20/25^Θ	82
100	28/28^Θ	54

Aflatoksyny są najbardziej aktywnymi hepatokancerogenami

Dawki związków doprowadzające do kancerogenezy

Związek	Dawka μg/dzień
Żółcień masłowa	9000
DMNA	750
Aflatoksyna	10

U pstrągów aflatoksyna B₁ podawana w dawce 4 ppb doprowadza do raka wątroby w ciągu 5 dni.

DL₁₀₀ dla ludzi dla aflatoksyny B₁ = 10 mg

Szacowane dopuszczalne spożycie FRANCJA

AFB₁ 0,67 μg/kg m.c./dzień

AFM₁ 0,70 μg/kg m.c./dzień

Szacowane dzienne spożycie

AFB₁ Dorośli 1,6 ng/kg m.c./dzień

Dzieci 4,5 ng/kg m.c./dzień

AFM₁ Dorośli 0,098 ng/kg m.c./dzień

Dzieci 0,52 ng/kg m.c./dzień

Proponowane tolerowane poziomy zanieczyszczeń w produktach dla dzieci

Mleko 0,05 μg/kg

Ser 0,10 μg/kg

Koncentraty mleczne max 5,00 μg/kg

Wymagania w zakresie MTX

Najwyższe dopuszczalne zawartości AFB₁ μg/kg (ppb)

Pasze pełnoporcjowe dla:

Bydła, owiec, kóz 50

Trzody chl., drobiu 30

Laktacja 5

Cielęta, jagnięta, prosięta 10

Inne 10

Pasze uzupełniające dla:

Bydła, owiec, kóz 50

Trzody chl., drobiu 30

Inne 10

Orzeszki ziemne, orzechy kokosowe, nasiona bawełny, kukurydza 200

Rubratoksyna A B

Penicillium rubrum

Penicillium purpurogenum

DL₅₀ p.o. 400-450 mg/kg m.c.

i.p. 3,5 mg/kg m.c.

Mniej toksyczna od aflatoksyny

Działanie:

Immunosupresyjne, hepatotoksyczne, teratogenne

Nie wykazano działania kancerogennego, ale zwiększają działanie kancerogenne aflatoksyn

Hamują aktywność i obniżają zawartość P-450

Hamują polimerazę RNA i DNA

Zaburzają transport elektronów

Dezintegracja rybosomów

Hamują ATP-azę

Działanie hepatotoksyczne

Spontanicznych zatruć nie stwierdza się

Zatrucia doświadczalne:

Objawy:

• Anoreksja

• Odwodnienie

• Żółtaczka

• Biegunka

• Depresja

Post mortem:

• Wybroczyny w różnych narządach:

• Wątroba, nerki, płuca, śledziona, przewód pokarmowy (u koni również w mózgu)

• Zmiany zwyrodnieniowe w wątrobie

• Zmiany nekrotyczne śledziony

Sporidesmina (A H)

Pythomyces chartarum

Czynnik etiologiczny egzemy pyska u bydła i owiec, a także zwiększonej wrażliwości na światło.

Nowa Zelandia, Australia, Środkowa Afryka, ale także Europa.

Czynnik i ryzyko:

Zwierzęta - przede wszystkim przeżuwacze (owce, bydło)

Warunki klimatyczne - jesień bardzo wilgotna po gorącym, suchym lecie

W przypadku narażenia owiec zatrucia u 70%

W przypadku narażenia bydła około 50%

Przypadki śmiertelne 15-20% u owiec

Działanie:

• Hepatotoksyczne

• Uszkodzenie nabłonka przewodów żółciowych

• Zapalenie przewodu żółciowego

• Zatrzymanie wydzielania żółci

• Egzema pyska

• Uczulenie na światło (zaburzenia w metabolizmie w wątrobie, niemożność metabolizowania chlorofilu)

Objawy:

Żółtaczka, stany zapalne skóry wynikające z uczulenia na światło, czasami objawy encefalopatii wątrobowej; anoreksja; otępienie; letarg; drgawki

Wyraźne zmiany w wątrobie zmiany barwy na ciemnożółtą, często fibroza

Wskaźniki biochemiczne i testy przydatne w diagnostyce:

• Test z BSP

• Aktywność γ-glutamylotransferazy

Post mortem:

Ostre:

• Obrzmiała, marmurkowa wątroba

• Hiperplazja przewodów żółciowych

Chroniczne:

• Fibroza wątroby

• Wątroba twarda, obkurczona

• Lewy płat zwykle ulega całkowitej atrofii

Przy działaniu tej MTX dochodzi do ↑ możliwości hepatocytów do kumulacji miedzi.

wikłanie zatrucia tą MTX przez działanie toksyczne miedzi

+ gwałtowny spadek zawartości cynku

Terapia:

• Brak specyficznej

• Antybiotyki

• Antyhistaminowe

• Zn (6g Zn/100 L H2O) przez 28 dni 30 mg/kg m.c./dzień ALE uwaga na działanie toksyczne Zn

Sterigmatocystyna

Aspergillus bipolaris

Aspergillus nidulans

Aspergillus versicolor

Zboża, przetwory zbożowe, ziarna kawy, agrest, winogrona

DL₅₀ 120-160 mg/kg m.c.

Luteoskyryna i cyklochlorytyna

Penicillium islandicum

Marskość i rak wątroby (hepatopatie u ludzi w Azji zjadanie „żółtego ryżu” choroba „żółtego ryżu”

Fomopsyna

Phomopsis leptostromiformis rossiana

Głównie motylkowe (łubin - zatrucie tą MTX dawniej określano mianem lupinozy)

Mechanizm działania nieznany

Zatrucia bydła (głównie krowy cielne lub tuż po wycieleniu)

Zaburzenia metaboliczne przejawiające się silną ketozą

Po kilku tygodniach od narażenia:

• Anoreksja

• Depresja

• Gwałtowne osłabienie

• Objawy żółtaczki

Upadki zwierząt w ciągu kilku dni

• Czasami miopatie

Post mortem:

Wątroba ciemnożółta lub pomarańczowa; fibroza wątroby; przerost kanalików i przewodów żółciowych; wybroczyny podśluzówkowe i podskórne

Ochratoksyna (A, B, C)

Ochratoksyna A (OTA) dwa pierścienie kumarynowe

Penicillium verrucosum

Penicillium ochraceus

Aspergillus ochraceus, sulphureus, ostanius, sclerotoricum

Ziarna zbóż, kawa, kakao, winogrona, soki, rodzynki, wino

Optymalne warunki rozwoju:

Penicillium sp. temp. 20-30°C wilgotność 30%

Aspergillus sp. temp. 5-10°C wilgotność 16%

Duże zagrożenie w Europie, w tym w Polsce!

Są to powszechne pleśnie glebowe + ziarna zbóż, produkty spożywcze

	Występowanie	Zawartość μg/kg
Zboża Kanady, Danii	56%	20-27000
Zboża Polskie	6%	50-200

Pozostałości w produktach pochodzenia zwierzęcego:

Nerki (trzoda chl.) Dania 2-70 μg/kg (80%)

Szwecja 2-25 μg/kg (25%)

Korelacja między zawartością ochratoksyn w paszy a ich pozostałościami w tkankach:

Nerki 0,86

Wątroba 0,82

Tłuszcz 0,78

Mięśnie 0,40

Ochratoksyna A

DL₅₀

Szczur p.o. 20-22 mg/kg m.c.

Psy 0,3 mg/kg m.c. - ostra toksykoza, przy niższych dawkach działanie chroniczne (gł. nefrotoksyczne)

Kaczęta 0,13-0,17 mg/zwierzę = DL100

Owca 1 mg/kg m.c. i.v. - śmierć w ciągu 12-24h

Przeżuwacze charakteryzują się opornością na ochratoksyny. Przy narażeniu p.o. rzadko działanie nefrotoksyczne ulegają hydrolizie przez m/o w przedżołądkach

Kinetyka:

Dobrze rozpuszczalne w rozpuszczalnikach polarnych. Ich sole rozpuszczalne w H₂O, szybkie wchłanianie wszystkimi drogami

Dystrybucja:

Kumulacja w nerkach, wątrobie, tk. tłuszczowej, mięśniach

T½ krótki: nerki 7-9 tygodni; wątroba 3 tygodnie; mięśnie 2 tygodnie

Wydalanie:

Z moczem ~80%

Praktycznie nie przechodzą do mleka (chyba, że bardzo ↑ dawka)

Obecne w żółtku jaja - pozostałości po 60-80 dniach od narażenia

Mechanizm działanie:

Działanie nefrotoksyczne:

• Martwica proksymalnej części kanalików nerkowych

• Zwłóknienie śródmiąższowe części korowej nerki

• Stwardnienie i zanik kłębuszków nerkowych

Działanie hepatotoksyczne:

• Proliferacja gładkiego ER z objawami zwyrodnienia szklistego

Zaburzenia metabolizmu węglowodanów:

• Hamowanie układów fosforylujących

• Konkurencja o kinazę fosforylazy 6 z cAMP

• Gwałtowny spadek glikogenu w wątrobie a ↑ w sercu

• ↑ poziomu glukozy we krwi

• ↓ Gl-6P

• ↓ aktywności syntetazy glikogenu

• Hamowanie oddychania mitochondrialnego (↓ zawartości ATP)

• Uszkodzenie mitochondriów

• Zaburzenia homeostazy wapnia

Działanie immunosupresyjne, mutagenne, kancerogenne, teratogenne (głównie twarz, układ kostny, serce)

Ochratoksykoza świń

200 μg/kg paszy przez 2-3 m-ce

• Poliuria

• ↑ zapotrzebowania na płyny

• Glikozuria

• Proteinuria

• Aminoaciduria

• Biegunki

• Zahamowanie wzrostu

Post mortem:

• Nerki powiększone (o 25%)

• Blade lub zielonobrązowe

• Zmiany szkliste w kanalikach

• Zmiany szkliste kłębuszków

• Postępująca atrofia kłębuszków

• Zwłóknienie śródmiąższowe

• Zmiany w wątrobie (zwyrodnienie tłuszczowe)

Ochratoksykoza ptaków

Jednodniowe pisklęta, kaczęta

0,2 mg/kg paszy ostry przebieg

• Biegunka

• Krwawe wybroczyny w nerkach i w wątrobie

• Powiększenie nerek i wątroby (x2)

• Zmniejszenie grasicy i torebki Fabrycjusza

• Powiększenie i rozszerzenie kłębków

• Podwyższenie poziomu kwasu moczowego

Starszy drób (4 mg/kg paszy - 20 dni)

• Skaza moczanowa

• Ostra nerczyca

• Uszkodzenie szpiku kostnego (dramatyczny spadek liczby limfocytów)

• Martwica węzłów chłonnych

• Stany zapalne żołądka i jelit

Nioski (0,5 mg/kg paszy)

• ↓ produkcyjności jaj

• Niska wylęgowość jaj

Ochratoksykoza ludzi

„Bałkańska endemiczna nefropatia”

+ rak nerek i pęcherza

Średnie dzienne spożycie OTA (μg/kg m.c.)

0,02 - 1,9 u ludzi w Europie

Raport FAO / WHO Marzec 1999

Główne źródła ochratoksyn w pokarmie:

• Ziarna zbóż

Sok grejpfrutowy

Czerwone wino

Kawa

Kakao

Orzechy

Suszone owoce

• Nerki zwierząt

Krew trzody chlewnej

Regulacje prawne:

Propozycje:

ADI

Kanada 1,5-5,7 ng/kg m.c./dzień

UE 1,5 ng/kg m.c./dzień

MRL

UE mniej niż 5 μg OTA/kg

TDI

UE, JECFA 5 ng/kg m.c./dzień

Określone dzienne pobranie OTA w UE

0,7-4,6 ng/kg m.c./dzień

Dla ułatwienia MTX

Aflatoksyny - najsilniejszy znany biokancerogen

^Θ Dodatkowo kancerogeneza płuc

Tox 12[1]

- 1 -

---