Ćwiczenie nr 2

Temat: Otrzymywanie 1 - fosforanu α - D - glukopiranozy przez fosforolizę skrobi.

Grupa V:

Adamus Agnieszka Bensz Wojciech Botor Konrad Burdzik Edyta Idzik Jan Jarosz Aldona Jonak Katarzyna Kołoczek Aleksandra Kuderski Przemysław Kurowski Tomasz Kurpas Monika Paliwoda Justyna Polański Krzysztof

Biotechnologia,

semestr V

Automatyka

Data wykonania ćwiczenia: 2.11.2010 r.

Data oddania sprawozdania: 16.11.2010 r.

1. Cel ćwiczenia:

Otrzymanie 1-fosforanu-α-D-glukopiranozy w wyniku enzymatycznej fosforolizy skrobi.

2. Sprzęt:

• cylinder miarowy 250 ml,

• kolumny szklane 5/60, 2 x 2.5/46,

• lejek zwykły i do sączenia pod próżnią,

• zlewki i kolby stożkowe,

• sączki,

• zestaw do sączenia pod próżnią,

• pH-metr,

• bagietka,

• waga analityczna.

3. Materiał i odczynniki:

• bufor fosforanowy (0.8 M) o pH = 6.7 (250 ml),

• skrobia rozpuszczalna,

• octan magnezu czterowodny,

• 14% r-r amoniaku (8N),

• Dowex 50 WX 8, 20-50 mesh, zdolność wymienna 1.9 mvala/ml,

• Amberlyst A-26, 0.3-1.0 mm, zdolność wymienna 1.1 mvala/ml,

• 5% r-r HCl,

• 5% r-r NaOH,

• 5% r-r KOH,

• metanol,

• woda destylowana.

4. Przebieg doświadczenia:

Grupa otrzymała wcześniej przygotowaną mieszaninę reakcyjną inkubowaną w temperaturze pokojowej (ok. 22 °C) przez 24h. W skład mieszaniny weszła skrobia rozpuszczalna (głównie postać liniowa, składająca się przeważnie z amylozy), zebrany znad osadu sok z ziemniaków, bufor fosforanowy oraz tymol. Ziemniaki zostały starte wraz ze skórką, gdyż bezpośrednio pod nią zlokalizowana jest największa ilość enzymu (fosforylazy α-glukanowej).

Inkubat podgrzano w łaźni wodnej do temperatury 95 °C. Temperaturę tą utrzymywano przez około 3 min, a następnie schłodzono do temperatury pokojowej. Podgrzanie spowodowało denaturację enzymu, w wyniku czego pojawiły się w roztworze kłaczki skoagulowanego białka.

Dezaktywowane białko, w postaci skoagulowanej, zostało usunięte poprzez sączenie na lejku z sączkiem karbowanym. Sączenie przeprowadzono w celu oddzielenia enzymu (sączenie grawitacyjne). Otrzymano 420 ml przesączu, do którego w kolejnym etapie dodano łyżką 32,25 g naważonego octanu magnezu, którego zadaną ilość (43g/800ml) przeliczono na objętość 600ml:

800 ml - 43 g

600 ml - x

x = 32,25 g

Dodawanie octanu magnezu przerwano jednak wcześniej, nie zużywając całości naważonej substancji, ponieważ wytrącił się oczekiwany szary osad na dnie zlewki. Całość wymieszano za pomocą mieszadła magnetycznego, by sól równomiernie rozpuściła się w roztworze. Dodanie octanu magnezu miało na celu usunięcie nadmiernej ilości fosforanu z roztworu.

Następnie zmierzono pH mieszaniny, które wynosiło 5.9. Mieszaninę zobojętniono. W tym celu dodano 15 ml 14% roztworu amoniaku, zmierzono pH, które nadal było kwasowe, dodano kolejne 12 ml amoniaku i po wymieszaniu otrzymano pH równe 9.3 (w sumie dodano do roztworu 27 ml amoniaku). Dodanie amoniaku spowodowało również zwiększenie trwałości produktu oraz wytrącenie fosforanu amonowo-magnezowego.

Otrzymany roztwór przesączono na lejku Buchnera w celu oddzielenia oddzielenia przesączu zawierającego fosforan α-D-glukopiranozy od osadu. Przesącz poddany został chromatografii kolumnowej na wymieniaczach jonowych.

5. Kationit:

Kolejnym punktem ćwiczenia było przygotowanie kolumny kationitowej. Kationity posiadają na powierzchni grupy o własnościach kwasowych tj. -SO₃H, -PO₃H, -COOH czy SH, które po aktywowaniu przyjmują ładunek ujemny (dzięki niemu mogą wiązać kationy).

W celu aktywacji kationitu, wprowadzono 5% HCl. Grupy kwasowe kolumny kationitowej są zdolne do wiązania się z protonami pochodzącymi z HCl. Kolumnę przemyto wodą destylowaną i obserwowano pH wycieku. Pomimo długiego czasu przemywania maksymalne pH wyniosło 3,72. Niska wartość pH mogła być spowodowana słabą sprawnością kationitu oraz świadczy ona o dużej zawartości jonów H+ znajdujących się w frakcjach.

Następnie na kationit naniesiono mieszaninę inkubacyjną. Po przelaniu całego przesączu kolumnę przemyto wodą destylowaną utrzymując tą samą szybkość przepływu. Wyciek zbierano w zlewkach w ilości po 70ml do momentu osiągnięcia wartości pH 3,0. Ze względu na dużą labilność otrzymanego fosforanu w środowisku kwaśnym, wyciek przeniesiono jak najszybciej na kolumnę anionitową.

6. Anionit

Następną częścią ćwiczenia była izolacja oczyszczonego na kationicie produktu z wykorzystaniem anionitu. Anionit to podłoże jonowymienne zawierające dodatnie grupy, które umożliwiają wiązanie anionów. Oczyszczana substancja była anionem, więc wykorzystanie anionitu było wskazane.

Przed naniesieniem mieszaniny zawierającej fosforan α-D-glukopiranozy niezbędne było aktywowanie złoża. W tym celu przemyto kolumnę 0,5 l 5% NaOH - nastąpiło związanie jonów OH- z grupami w podłożu. Następnie przez kolumnę przepuszczono 2 l wody destylowanej celem wypłukania wszystkich niepożądanych substancji, m. in. wszystkich jonów które mogły być uprzednio związane z podłożem.

Na tak przygotowaną kolumnę naniesiono mieszaninę reakcyjną uprzednio przepuszczoną przez kationit. Wybierano jedynie zlewki o niskim pH - w wyjściowej mieszaninie znajdował się szereg kationów, a niskie pH świadczyło o ich wymianie na jony H⁺. W trakcie przepływu przez anionit następowało związanie produktu z podłożem. Należy zauważyć, że oprócz 1-fosforanu α-d-glukopiranozy z anionitem wiąże się też CH3COO-, który pozostał w mieszaninie od czasu dodania octanu magnezu.

Po przepuszczeniu całości mieszaniny przez kolumnę, przepłukano ją wodą (100 ml) celem usunięcia szeregu niezwiązanych substancji, np. nierozłożonych resztek skrobi. Następnie wypłukano związane aniony przy użyciu 200 ml KOH. Dobór KOH wynika głównie z faktu, że w połączeniu z potasem 1-fosforan α-D-glukopiranozy tworzy sól zdolną do krystalizacji.

Pierwsze 70 ml cieczy, która wypłynęła z kolumny zostało odrzucone. Resztę zbierano w trzech porcjach po 70 ml i przenoszono do oddzielnych kolb, do których następnie dodawano po 70 ml metanolu celem umożliwienia krystalizacji. Należy zaznaczyć, że proporcja ta jest odmienna niż proponowana w instrukcji, jednakże taki stosunek substancji jest wystarczający do zajścia zjawiska. Po wykrystalizowaniu, dokonuje się przesączenia zawartości kolby pod zmniejszonym ciśnieniem, a następnie suszy się kryształy. Tak uzyskany produkt waży się.

7. Obserwacje i wyniki:

pH inkubatu z dodatkiem czterowodnego octanu magnezu, w trakcie ustawiania pH przy pomocy r-ru amoniaku:

• pH wyjściowe :

• pH po dodaniu pierwszej porcji r-ru amoniaku : 5.9,

• pH po dodaniu drugiej porcji r-ru amoniaku : 9.3.

8. Wnioski:

Na wydajność otrzymywania 1-fosforanu α-D-glukopiranozy przez fosforolizę skrobi wpływa wiele różnorodnych czynników, skutkiem czego trudno jednoznacznie rozgraniczyć ich wpływ na końcowy wynik doświadczenia.

Na obniżenie wydajności mogło wpłynąć użycie wody wodociągowej przy przygotowywaniu preparatu enzymatycznego:

• występujące w wodzie jony mogą zakłócać prawidłowe funkcjonowanie kolumn kationitowej i anionitowej, współzawodnicząc z jonami, których oddziaływanie z jonowymieniaczami ma decydujący wpływ na przebieg oczyszczania produktu

• w wodzie mogły być obecne jony metali ciężkich będące inhibitorami enzymów. W szczególności kationy takie jak: Fe2+, Co2+, Cu2+, Hg2+, Mn2+, Sn2+ i Zn2+ są inhibitorami fosforylazy α-glukanowej.

Wpływ na uzyskaną wydajność mogły mieć także same ziemniaki, będące źródłem enzymu. Ziemniaki zostały starte ze skórką, wykluczyć więc można straty enzymu wynikające z jej obierania (największa ilość enzymu mieści się bezpośrednio pod nią). Można przypuszczać jednak, że ziemniaki zostały niedokładnie umyte, co mogło spowodować obecność dodatkowych zanieczyszczeń w preparacie enzymatycznym (także jonów wymienionych wcześniej metali ciężkich), a co za tym idzie obniżenie wydajności na każdym kolejnym etapie reakcji.

Należy uwzględnić także, że na każdym etapie doświadczenia część produktu mogła zostawać na ściankach naczyń lub na sączkach - mieszaniny występujące w kolejnych etapach doświadczenia nie były przenoszone ilościowo do kolejnych naczyń.

Czynnikiem wpływającym na obniżenie wydajności reakcji mógł być też zbyt krótki czas inkubacji, w wyniku czego przereagowało mniej substratu.

Istotnym czynnikiem obniżającym wydajność było także to, że w trakcie przygotowywania kolumny kationowej nie osiągnięto wystarczająco wysokiego pH. Uzyskana wartość wynosiła zaledwie 3,72, przez co utrudnione było zaobserwowanie jego obniżenia w dalszym przebiegu doświadczenia, a tym samym ocenę w którym momencie należy zacząć zbierać roztwór zawierający fosforany.

9. Użyte odczynniki

(na podstawie witryny http://www.poch.com.pl/1/katalog-produktow,0,0)

1. Bufor fosforanowy (0,8M, pH=6,7) : odczynnik analityczny, nie jest klasyfikowany jako substancja niebezpieczna.

2. Skrobia rozpuszczalna : odczynnik analityczny, nie jest klasyfikowany jako substancja niebezpieczna.

3. Octan magnezu czterowodny: odczynnik analityczny, nie jest klasyfikowany jako substancja niebezpieczna.

4. 14% roztwór amoniaku (8N): odczynnik analityczny, powoduje oparzenia, działa bardzo toksycznie na organizmy wodne.

5. Dowex® 50WX8 50-100 mesh: jonowymienna żywica, zdolność wymienna 1,9 mvala/ml.

6. Amberlyst A-26, 0,3-1,0 mm: jonowymienna żywica, zdolność wymienna 1,1 mvala/ml.

7. 5% roztwór HCl: odczynnik analityczny, w użytym stężeniu nie jest klasyfikowany jako substancja niebezpieczna; stężony (od 15%) działa drażniąco na oczy, drogi oddechowe i skórę, powoduje oparzenia.

8. 5% roztwór NaOH: odczynnik analityczny, działa drażniąco na oczy i skórę, powoduje oparzenia.

9. 5% roztwór KOH: odczynnik analityczny, powoduje poważne oparzenia.

10. Metanol: odczynnik analityczny, rozpuszczalnik; wysoce łatwopalny, działa toksycznie przez drogi oddechowe, w kontakcie ze skórą oraz po połknięciu. Zagraża powstaniem bardzo poważnych, nieodwracalnych zmian w stanie zdrowia.

Rys. Fosforoliza skrobi

6

---