L a b o r a t o r y j n e a s p e k t y

o z n a c z a n i a b i l i r u b i n y

F u n k c j e w ą t r o b y

1. Funkcje metaboliczne

1. Metabolizm węglowodanów

• Izomeryzacja różnych cukrów prostych (fruktoza, galaktoza, mannoza) w glukozę

• Przemiany węglowodanów w procesie glikolizy, cyklu pentozowego, glikogenezy i glikogenolizy

• Glukoneogeneza - ciąg przemian prowadzący do syntezy glukozy z materiału niewęglowodanowego (mleczan, pirogronian, glicerol, większość aminokwasów)

2. Metabolizm białek i aminokwasów

• Synteza i rozkładanie białek

• Synteza białek z aminokwasów pochodzących z jelita cienkiego, z rozpadu białek własnych i syntezy endogennej

• Białka syntetyzowane w wątrobie to: białka osocza - albuminy i globuliny (z wyjątkiem immunoglobulin)

Białka transportowe (nośnikowe): albumina, hemopeksyna, białka transportujące lipidy (apolipoproteiny), haptoglobina, transferyna, ceruloplazmina, globulina wiążąca turoksynę, prealbumina

Białka - układu krzepnięcia: protrombina, czynniki (V, VII, IX, X), plazminogen, antytrombina III, fibrynogen

Białka - inhibitory enzymów proteolitycznych i białka ostrej fazy: alfa1-antytrypsyna, alfa2-makroglobulina, orozomukoid, białko C-reaktywne, fibrynogen, haptoglobina, fibrynogen

• Przemiana azotu pochodzącego z białek i wytwarzanie mocznika

3. Metabolizm lipidów

• Dostarcza endogennego cholesterolu

• Wytwarza enzym acylotransferazę lecytynowo-cholesterolową (LCAT), która katalizuje estryfikację cholesterolu głównie w osoczu

• Synteza lipoprotein o bardzo małej gęstości (VLDL) - TG

• Synteza i całkowity rozkład lipoprotein o dużej gęstości (HDL)

• Katabolizm LDL

4. Wytwarzanie kwasów żółciowych

• Synteza kwasów żółciowych w komórkach wątrobowych z cholesterolu (kwas cholowy, kwas chenodezoksycholowy)

• Obecne w żółci kwasy dezoksycholowy i litocholowy są produktami bakteryjnej przemiany w jelicie endogennych kwasów żółciowych

• W żółci kwasy żółciowe występują w formie połączeń z glicyną lub tauryną jako sole żółciowe

5. Metabolizm bilirubiny

6. Metabolizm hormonów

• Redukcja grup ketonowych w cząsteczce progesteronu powoduje inaktywację hormonu, przemienia go w związek polarny dobrze rozpuszczalny w wodzie i wydalany z moczem

2. Funkcje detoksykacyjne (odtruwające)

Przemiany biochemiczne katalizowane przez układy enzymatyczne (reakcje utlenienia - hydroksylacja) prowadzące do detoksykacji, zachodzą w siateczce śródplazmatycznej komórek wątrobowych, która tworzy tzw. frakcję mikrosomalną. Tutaj dochodzi do inaktywacji lub zmniejszenia aktywności biologicznej i toksycznej związków.

Detoksykacja 2 fazy:

I faza - utlenienie lub redukcja i hydroliza związku

Utlenienie katalizowane przez układ enzymatyczny hepatocytów - głównie cytochrom P-450 oraz reduktaza cytochromu c współdziałająca z NADPH+H⁺

Faza I ma na celu przekształcenie związków

II faza - sprzęganie z kwasem glukuronowym, siarkowym, octowym, glutationem lub metioniną lub metylacja

Powstałe produkty reakcji są na ogół dobrze rozpuszczane w wodzie, tracą zdolność rozpuszczania w lipidach i nie wchłaniają się w kanalikach nerkowych - wydalane są z moczem lub żółcią

Związki pochodzenia egzo- i endogennego

1. Bilirubina

• Bilirubina wchodzi w cały cykl przemian mający na celu jej detoksykację

Bilirubina powstająca głównie w układzie siateczkowo - śródbłonkowym (śledziona) w wyniku rozpadu hemoglobiny transportowana jest w połączeniu z albuminami do wątroby

W wątrobie ulega sprzęganiu z kwasem glukuronowym, częściowo z glicyną i tauryną

Zestryfikowana bilirubina, głównie w postaci diglukuronianu jest czynnie wydalana do żółci, ulegając dalszym przemianom do sterkobilinogenu w przewodzie pokarmowym

Bakterie jelitowe katalizują hydrolizę glukuronianów i powstanie urobilinogenu i sterkobilinogenu

Część urobilinogenu resorbowana do krwi wydala się z moczem

Sterkobilinogen utleniany do sterkobiliny wydala się z kałem

2. Amoniak

• Detoksykacja amoniaku poprzez przekształcenie do nietoksycznego mocznika w cyklu ornitynowym.

• wytwarzany w przebiegu metabolizmu aminokwasów i działania bakterii jelitowych na białka

• Amoniak wywiera toksyczne działanie na centralny system nerwowy.

3. Leki i trucizny

• Sulfonamidy, antybiotyki, hormony, barbiturany, fenacetyna, amfetamina, fenobarbital, kodeina i inne działają szkodliwie na pewne mechanizmy fizjologiczne zwłaszcza przy przedawkowaniu

• W przypadku trucizn działają bardzo szkodliwie na czynności życiowe organizmu

• Są to w większości związki organiczne - aromatyczne lub heterocykliczne, apolarne lub małopolarne o charakterze słabych elektrolitów, trudno rozpuszczających się wodzie, a dobrze w substancjach lipidowych

• Modyfikacja leków i trucizn polega na przemianach metabolicznych prowadzących do wytworzenia ich metabolitów w celu zwiększenia polarności i rozpuszczalności w wodzie, co umożliwia wydalanie ich przez nerki lub z żółcią

• Przemiany te (zachodzące w wątrobie) polegają na wprowadzeniu w cząsteczkę leku lub trucizny grup funkcyjnych o charakterze polarnym

• W metabolizmie leków bierze udział zespół cytochromu P-450

4. Alkohol etylowy

• Przekształcany w wątrobie pod wpływem dehydrogenazy alkoholowej i aldehydowej do kwasu octowego, wykorzystywanego w licznych procesach metabolicznych

5. Środki barwiące i konserwujące stosowane w przemyśle spożywczym i zawarte w pokarmach

6. Zanieczyszczenia środowiska - wody i powietrza

• Składniki dymów fabrycznych i gazów spalinowych - (węglowodory aromatyczne)

3. Funkcje wydzielnicze - z żółcią wydzielane są:

1. Bilirubina - produkt przemiany hemoglobiny

2. Kwasy żółciowe

3. Cholesterol

4. Funkcje magazynujące

1. Magazynowanie węglowodanów w postaci glikogenu

2. lipidy

3. białka

4. żelazo

5. miedź

6. witaminy

P r z e m i a n a h e m o p r o t e i n -

b a r w n i k i ż ó ł c i o w e

Do hemoprotein należą:

Hemoglobina - krwinki czerwone, zawiera 4 pierścienie hemu z żelazem (Fe²⁺)

mioglobina - mięśnie, 1 pierścień hemu

cytochromy - występuja we wszystkich tkankach, przenoszą elektrony w reakcjach oksydoredukcyjnych

1. Układ siateczkowo - śródbłonkowym śledziony - wychwyt i rozpad starych erytrocytów, uwolnienie hemoglobiny

Dobowe niszczenie erytrocytów wynosi ok. 1%

2. Wiązanie hemoglobiny z haptoglobiną osocza

3. Układ siateczkowo - śródbłonkowy (wątroby, śledziony i szpiku kostnego) - wychwyt hemoglobiny związanej z haptoglobiną i degradacja do haptoglobiny, globiny, żelaza i biliwerdyny (zielony barwnik) przechodzącą w:

wolną bilirubinę α (nie związaną, nie sprzężoną, nierozpuszczalną w wodzie)

Ok. 7,5 g hemoglobiny rozpada się w ciągu doby i powstaje ok. 250 mg bilirubiny

Katabolizm pierścienia hemowego mioglobiny i cytochromów jest źródłem ok. 10% wytwarzania dobowego bilirubiny.

4. W 90% transportowana jest w postaci kompleksu z albuminami do wątroby-

wolna bilirubina β, nie sprzężona, pośrednia.

Ten rodzaj bilirubiny występuje we krwi osób zdrowych

Połączenie to jest na tyle trwałe, że zapobiega przechodzeniu przez kłębki nerkowe i pozwala na swobodną dyfuzję przez ścianę naczyń włosowatych wątroby (zatoki).

Stężenie bilirubiny we krwi wynosi 3,5 - 17 μmol/l (0,2 - 1 mg/dl, jest wypadkową 2 prcesów wytwarzania w UŚŚ i wychwytywania przez komórki wątrobowe.

5. W wątrobie ulega sprzęganiu z kwasem glukuronowym, częściowo z glicyną, tauryną, jonem siarczanowym w reakcji katalizowanej przez UDP-glukuronozylotransferazę (urydynodifosfoglukuronozylotransferazę)

6. Powstaje bilirubina γ, związana, sprzężona, bezpośrednia, rozpuszczalna w wodzie,

którą stanowią dwuglukuroniany (ok. 75% sprzężonej bilirubiny) i monoglukuroniany.

Sprzężone połączenia bilirubiny odznaczają się lepszą rozpuszczalnością w wodzie i są łatwiej wydalane z organizmu

7. We krwi bilirubina związana (sprzężona) występuje częściowo w postaci wolnej, a częściowo jest związana z albuminą - tzw. bilirubina δ (delta).

Czas półtrwania bilirubiny δ jest wielokrotnie dłuższy niż bilirubiny wolnej, sprzężonej. Po usunięciu przeszkody w drogach żółciowych frakcja bilirubiny δ pozostaje nadal podwyższona przez dłuższy czas, a stężenie wolnej postaci bilirubiny związanej szybko się obniża. Różnicowanie tych dwu postaci bilirubiny może być przydatne do bieżącej oceny stopnia zamknięcia dróg żółciowych.

8. Bilirubina związana ulega sekrecji do kanalików żółciowych i wchodząc w skład żółci przechodzi do jelit

9. W jelitach ulega przemianom pod wpływem enzymów bakteryjnych katalizujących hydrolizę glukuronianów i poprzez stadium mezobilirubiny i mezobilirubinogenu przekształcana jest w związki zwane sterkobilinogenami (sterkobilinogen) i urobilinogenami (urobilinogen)

10. Sterkobilinogen (bezbarwny) utleniany do sterkobiliny (barwna urobilina nadająca kałowi zabarwienie) wydala się z kałem. Zamknięcie dróg żółciowych powoduje zablokowanie tej przemiany i stolec jest bezbarwny (acholiczny)

11. Część urobilinogenu resorbowana z jelita dostaje się do krążenia wrotnego i do wątroby

12. W wątrobie większość wchłoniętego urobilinogenu zostaje przekształcona w bilirubinę i ponownie wydalona z żółcią (krążenie jelitowo - wątrobowe barwników żółciowych)

13. Niewielka część urobilinogenu ulega wydaleniu z moczem jako urobilina

Obliczanie frakcji bilirubiny

Bilirubina pośrednia = bilirubina całkowita - bilirubina bezpośrednia

Bilirubina delta = bilirubina całkowita - bilirubina nie sprzężona - bilirubina sprzężona

Bilirubina noworodków = bilirubina nie sprzężona + bilirubina sprzężona

M e t a b o l i z m b i l i r u b i n y

Hemoglobina + haptoglobina

Układ siateczkowo- śródbłonkowy wątroby,

śledziony, szpiku kostnego

Bilirubina wolna α,

nie sprzężona, nie związana

Krew

Kompleks Bilirubina wolna

+ albumina = Bilirubina β, pośrednia

Wątroba

Sprzęganie z kwasem glukuronowym

Wewnątrzkomórkowa bilirubina γ,

Sprzężona - związana, bezpośrednia

We krwi łączy się z albuminą tworząc bilirubinę δ

Wątroba

Bilirubina sprzężona - kanaliki żółciowe -

Bilirubina w żółci

Krew

krążenia

mezobilirubina wrotnego

Jelito -

redukcja enzymy bakteryjne

mezobilirubinogen

Sterkobilinogen = Urobilinogen

Kał Mocz

Sterkobilina Urobilina

H i p e r b i l i r u b i n e m i e

• zwiększone wytwarzanie bilirubiny, której ilość przekracza możliwość jej wychwytywania i metabolizmu przez wątrobę,

• uszkodzenia wątroby,

• niewydolność wątroby

• upośledzenie odpływu żółci z dróg żółciowych

1. Hiperbilirubinemie nabyte

Żółtaczka fizjologiczna noworodków

• Niedojrzałość komórek wątroby do wychwytywania bilirubiny, układów enzymatycznych wątroby do procesu glukuronizacji bilirubiny pochodzącej z nadmiernego rozpadu erytrocytów (hemolizy) zawierających hemoglobinę płodową.

• Stan przejściowy z przewagą bilirubiny niesprzężonej mogącej przenikać barierę krew - mózg, gdy jej wartość przekroczy ilość wiązaną przez albuminę, tzn. 340-428 μmo/l (20-25 mg/dl).

• Następstwem toksycznego działania bilirubiny jest żółtaczka jąder podkorowych mózgu.

Żółtaczka mechaniczna

• Zablokowanie dróg żółciowych - zastój żółci (cholestaza)

• Wzrost stężenia bilirubiny we krwi z przewagą sprzężonej

• Obecność dużej ilości bilirubiny w moczu. Z moczem może wydalać się jedynie bilirubina sprzężona, która nie jest połączona z białkami jeżeli zostanie przekroczony próg nerkowy wynoszący 34,2 μmol/l bilirubiny sprzężonej.

• Brak sterkobilinogenu w kale (odbarwienie kału)

• Brak urobilinogenu w moczu

Żółtaczka w przebiegu wirusowego zapalenia wątroby (WZW)

• Uszkodzenie hepatocytów - upośledzony wychwyt bilirubiny wolnej.

• Przechodzenie bilirubiny sprzężonej zamiast do żółci do płynu pozakomórkowego i do krwi.

• Wzrost stężenia bilirubiny wolnej i sprzężonej w krwi.

• Obecność bilirubiny w moczu.

• Wzrost stężenia urobilinogenu we krwi.

• Zwiększone wydalanie urobilinogenu z moczem.

Żółtaczka hemolityczna

• Wzmożona hemoliza - uwalnianie dużej ilości hemoglobiny - substratu dla bilirubiny.

• Przekroczona zdolność wątroby do wychwytywania i przekształcania bilirubiny.

• Umiarkowany wzrost stężenia bilirubiny wolnej we krwi.

• Zwiększone wydalanie urobilinogenu z moczem.

• Znacznie zwiększone wydalanie sterkobilinogenu z kałem.

2. Hiperbilirubinemie wrodzone

Zespół Gilberta

• Występuje u ok. 5 % osób.

• Prawidłowa funkcja wątroby.

• Zaburzenie transportu wolnej bilirubiny z krwi do komórki wątrobowej.

• Zmniejszenie aktywności wewnątrzwątrobowej UDP-glukuronozylotransferazy bilirubiny katalizującej proces sprzęgania bilirubiny wolnej z kwasem glukuronowym.

• W 60% przypadków zwiększona hemoliza erytrocytów i skrócony czas ich przeżycia.

• We krwi wzrost stężenia bilirubiny wolnej, nie sprzężonej.

Próby:

1. Barbituranowa - żółtaczka ustępuje pod wpływem kilkudniowego podawania fenobarbitalu (luminal 6x na dobę po 0,015g - indukowanie aktywności UDP-glukuronozylotransferazy.

2. Ograniczenie podaży kalorii do 400 kcal/dobę co przejściowo nasila żółtaczkę (test głodowy).

Zespół Criglera-Najjara

• Zaburzenie dziedziczone jako cecha autosomalna recesywna typ I i autosomalna dominująca typ II.

• Typ I (ciężka postać) - całkowity brak aktywności UDP-glukuronozylotransferazy (brak enzymu) katalizującej powstawanie glukuronidów.

• Wzrost stężenie bilirubiny wolnej w surowicy do wartości 340 μmol/l i więcej (> 20 mg/dl).

• Typ II (postać lżejsza) - stężenie bilirubiny wolnej w surowicy nie przekracza 340 μmol/l (6-20 mg/dl).

Zespół Dubina-Johnsona

• Zaburzenie dziedziczone jako cecha autosomalna recesywna.

• Wychwyt i przekształcanie bilirubiny w komórkach prawidłowe.

• Upośledzone wydzielanie bilirubiny do żółci w wyniku wrodzonego upośledzenia układu transportującego.

• Odwrócenie kierunku transportu bilirubiny sprzężonej i jej przechodzenie do krwi.

• We krwi przewaga wzrostu stężenia bilirubiny sprzężonej nad nie sprzężoną.

• Całkowita bilirubina od 5 - 20 mg/dl.

• Wzrost stężenia bilirubiny delta (δ)

• Obecność bilirubiny w moczu.

• Zwiększone stężenie urobilinogenu w moczu.

• U chorych próba z bromosulfoftaleiną (BSP) - dwuszczytowa krzywa wydzielania, u zdrowych po 45 min od dożylnego podania BSP stwierdza się mniej niż 5 % barwnika.

Zespól Rotora

• Zaburzenie wydalania

• Przewaga bilirubiny sprzężonej

• Wzrost stężenia bilirubiny delta (δ).

• Wydalanie z moczem koproporfirynogenu.

Konflikt grup krwi

• Dochodzi do pojawienia się wysokiego stężenia bilirubiny nie sprzężonej we krwi, która rozpuszczalna w tłuszczach przechodzi przez barierę krew - mózg.

• Odkładanie się bilirubiny w jądrach mózgu i rdzenia kręgowego objawia się porażeniem mózgowym, niedorozwojem umysłowym, ubytkami słuchu, co określa się jako encefalipatia bilirubinowa.

L a b o r a t o r y j n e r ó ż n i c o w a n i e ż ó ł t a c z e k

Różnicowanie	Żółtaczka miąższowa	Żółtaczka hemolityczna	Żółtaczka mechaniczna
Bilirubina w surowicy	Umiarkowanie zwiększona	Umiarkowanie zwiększona	Znacznie zwiększona
Próba Van den Bergha	Dwufazowa	Pośrednia	Bezpośrednia
Bilirubina w moczu	Umiarkowanie zwiększona	Bez zmian	Znacznie zwiększona
Urobilinogen w moczu	Znacznie zwiększony	Umiarkowanie zwiększona	Brak
Bilirubina i sterkobilinogen w kale	umiarkowanie zwiększone	Znacznie zwiększone	Brak
Fosfataza zasadowa w surowicy	Bez zmian	Bez zmian	Znacznie zwiększona
Próba tymolowa	Dodatnia	Ujemna	Ujemna
Stosunek albuminy/ globuliny	Znacznie zmniejszony	Bez zmian	Bez zmian

Hiperbilirubinemie

Z przewgą bilirubiny nie sprzężonej	Z przewagą bilirubiny sprzężonej
Żółtaczka hemoityczna Żółtaczka noworodków Zespół Gillberta Zespół Criglera-Najjara	Żółtaczka mechaniczna Zespół Dubina-Johnsona

P r ó b y c z y n n o ś c i o w e w d i a g n o s t y c e

c h o r ó b w ą t r o b y:

1. Próba z bromosulfoftaleiną (BSP)

Podaje się dożylnie BSP w ilości 5 mg/kilogram masy ciała.

U osób zdrowych po 45 min od podania BSP we krwi stwierdza się mniej niż 5% barwnika.

Próba jest bardzo czuła, wykrywa niewielkie uszkodzenie czynności wątroby.

2. Test z zielenią indocyjaninową - podobna czułość i wartość diagnostyczna jak test z BSP.

M e t o d y o z n a c z a n i a b i l i r u b i n y.

1. Próba van den Bergha

• Rozróżnianie 2 form bilirubiny, reakcja zachodzi w wodzie.

• Bilirubina sprzężona, rozpuszczalna w wodzie reaguje z kwasem sulfanilowym dając czerwono-fioletowe zabarwienie (odczyn dodatni, tzw. bezpośredni - bilirubinę określa się jako bezpośrednią).

• Bilirubina wolna, nie sprzężona, połączona z albuminą daje dodatnią reakcję Van den Bergha po dodaniu do środowiska alkoholu (metanol), który powoduje rozbicie połączenia z albuminą (tzw. odczyn pośredni - bilirubinę określa się jako pośrednią).

• Surowica normalna, nie zawierająca sprzężonej bilirubiny daje tylko odczyn pośredni.

2. Oznaczanie bilirubiny metodą kolorymetryczną

Jendrassika Grofa.

• Wykorzystanie reakcji van den Bergha. Bilirubina reaguje z dwuazowym kwasem sulfanilowym, który tworzy pochodne azowe dające w środowisku obojętnym różowo - czerwone zabarwienie.

• W metodzie oznacza się bilirubinę całkowitą (Bilirubina pośrednia + bilirubina bezpośrednia). Surowice poddaje się działaniu benzoesanu kofeiny (rozbija połączenie z albuminą), przeprowadza się reakcję dwuazowania bilirubiny.

• Alkalizacja środowiska zmienia zabarwienie pochodnych azowych na żółtozielone, co jest korzystniejsze dla celów analitycznych.

3. Metoda Malloya i Evelyna

• Oparta o reakcję van den Bergha.

Próba tymolowa

Zasada:

Surowica dodana do buforu weronalowego nasyconego tymolem powoduje zmętnienie roztworu. Istnieje korelacja pomiędzy zwiększoną ilośćią gama-globulin i bata-lipoprotein a stopniem zmętnienia roztworu, który mierzy się kolorymetrycznie.

---