REKOMBINACJE DNA
-rekombinacja genetyczna to proces wymiany fragmentów DNA między
chromosomami
homologicznymi lub dwuniciowymi helisami DNA, który prowadzi do ciągłego
przetasowywania alleli i powstawania różnych genotypów;
-gdyby nie było rekombinacji, genomy byłyby stosunkowo stabilnymi
strukturami, podlegającymi bardzo niewielkim zmianom;
-po upływie dłuższego czasu stopniowa akumulacja mutacji prowadziłaby do
niewielkich zmian w sekwencji genomu, jednak większe rearanżacje, za
które odpowiada rekombinacja, nie zachodziłyby; potencjał ewolucyjny genomu
byłby ograniczony rekombinację po raz pierwszy opisano jako proces
odpowiedzialny za zjawisko crossing-over i wymiany fragmentów DNA między
homologicznymi chromosomami podczas mejozy w komórkach eukariotycznych;
-później wykazano jej rolę w integracji DNA przenoszonego do genomów
bakteryjnych po
koniugacji, transdukcji i transformacji;
KONIUGACJA
-bezpośrednie przenoszenie genów z komórki do komórki, np. u E. Coli;
-zdolność do koniugacji nadają bakteriom geny znajdujące się w
plazmidach (plazmid F, czynnik płciowy);
-koniugacja może zachodzić tyko między komórką zawierającą plazmid F
(donorową) a
taką, która go nie zawiera (akceptorową);
-przeniesieniu ulega niewiele genów zawartych w plazmidzie F, w
większości zaangażowanych w proces koniugacji;
-czasami plazmid F może stać się integralną częścią genomu przez
rodzaj rekombinacji zwany integracją; taki zintegrowany plazmid może nadal
inicjować koniugację i przeniesienie się wraz z częścią chromosomu
bakteryjnego do drugiej komórki
TRANSFORMACJA
-sposób przenoszenia genów u innych bakterii, np. glebowych Bacillus
subtilis
-bakterie pobierają cząsteczki DNA znajdujące się w ich otoczeniu, a
pochodzące z rozpadu komórek innych bakterii;
-po wniknięciu do komórki DNA ulega często integracji z genomem
bakteryjnym przez rekombinację;
-ponieważ źródłem DNA do transformacji są obumarłe komórki
bakteryjne, uwalniające swoją treść do środowiska, DNA jest narażony na
działanie czynników mogących go uszkodzić, np. nukleaz
TRANSDUKCJA
-proces przenoszenia genów między bakteriami z udziałem wirusów
(bakteriofagów, np. bakteriofag λ)
-bakteriofagi rozmnażają się wewnątrz bakterii wykorzystując
biochemiczny aparat komórki gospodarza do wytworzenia nowych kopii wirusowego genomu i
do syntezy kapsydu wirusa
-mamnażanie się wirusa jest dla zainfekowanej komórki z reguły letalne -
komórka ulega lizie, uwalniając potomne wirusy zdolne do zainfekowania
sąsiednich komórek bakteryjnych - jest to tzw. cykl lityczny
-niektóre bakteriofagi infekując komórki bakteryjne nie ulegają
natychmiast: namnażaniu, ale wchodzą w stan uśpienia (występują jako profag), a
bakteria przechodzi wiele zwykłych podziałów komórki; w końcu profag
ponownie się uaktywnia replikując swój genom, kierując syntezą białek
kapsydu i wreszcie uwalniając się z komórki - jest to tzw. cykl lizogenny
-wyróżnia się rekombinację homologiczną, zlokalizowaną i
transpozycyjną
-u organizmów prokariotycznych rekombinacja może nastąpić w wyniku:
•losowego doboru koniugantów
•rekombinacji homologicznej, zlokalizowanej oraz transpozycji w czasie
koniugacji
-u organizmów eukariotycznych rekombinacja może nastąpić w wyniku:
•losowej segregacji chromosomów w spermatogenezie i oogenezie
•losowego doboru rodziców
•losowego łączenia się gamet
•rekombinacji homologicznej (crossing-over), zlokalizowanej i
transpozycji
REKOMBINACJA HOMOLOGICZNA (OGÓLNA)
-jest to najważniejszy w przyrodzie rodzaj rekombinacji - odpowiedzialny za
crossing-over podczas mejozy oraz integrację wprowadzanego DNA do genomów
bakteryjnych;
-aby opisać mechanizm molekularny rekombinacji opracowano model Hollidaya
-model Hollidaya dotyczy rekombinacji między dwiema homologicznymi
cząsteczkami dwuniciowymi, które mają identyczną lub prawie identyczną
sekwencję
-można go też odnieść do dwóch różnych cząsteczek mających
ograniczony wspólny obszar homologii, lub też do pojedynczej cząsteczki, która
rekombinuje sama ze sobą, gdyż zawiera dwa odrębne obszary wykazujące
wzajemną homologię
-zasadniczym elementem tego modelu jest utworzenie się heterodupleksu,
powstającego w wyniku wymiany fragmentów polinukleotydowych między dwiema
homologicznymi cząsteczkami
-heterodupleks jest początkowo stabilizowany przez komplementarne
oddziaływanie między każdą z przenoszonych nici a nienaruszonym łańcuchem
polinukleotydowym cząsteczki biorcy; jest to możliwe dzięki podobieństwu
sekwencji między obiema cząsteczkami; następnie przerwy są sklejane przez
ligazę i powstaje struktura Hollidaya
-struktura ta jest dynamiczna; możliwe jest przemieszczanie się
rozgałęzienia i wymianę dłuższych segmentów DNA, jeśli obie helisy mają zgodny
kierunek obrotu
-rozdzielenie, czyli rozłączenie, struktury Hollidaya z powrotem na osobne
cząsteczki dwuniciowe następuje poprzez przecięcie w miejscu
rozgałęzienia
-przecięcie może nastąpić w jednej z dwóch orientacji, a skutki tych
dwóch sposobów cięcia są odmienne
1.jeżeli nacięcie jest dokonane od lewej do prawej strony formy chi, to
dochodzi jedynie do wymiany krótkiego fragmentu łańcucha polinukleotydowego
między cząsteczkami; odpowiada on długości przemieszczenia się
rozgałęzienia struktury Hollidaya;
2.przecięcie z góry na dół spowoduje natomiast wzajemną wymianę nici,
w której dwuniciowy DNA zostanie wymieniony między cząsteczkami tak, że
zamienią się one końcami; taką wymianę DNA obserwujemy podczas
crossing-over;
-w jaki sposób obie dwuniciowe cząsteczki tworzą heterodupleks?
-początkowo uważano, że dwie cząsteczki ustawiają się obok siebie, po
czym w odpowiadających sobie pozycjach w każdej helisie pojawiają się
jednoniciowe pęknięcia; powstają wówczas wolne jednoniciowe końce, które
mogą się wymienić dając heterodupleks; w tym elemencie modelu nie można
było wskazać mechanizmu, który zapewniałby pojawienie się pęknięć
dokładnie w tym samym miejscu w obu cząsteczkach
-bardziej satysfakcjonujące wytłumaczenie daje modyfikacja
Meselsona-Raddinga, w której jednoniciowe pęknięcie pojawia się tylko w jednej
podwójnej helisie, a wytworzony wolny koniec dokonuje „inwazji" nienaruszonej
podwójnej helisy w homologicznej pozycji i wypiera jedną z jej nici,
tworząc pętlę D; następujące potem przecięcie wypchniętej nici w miejscu
połączenia obszaru jedno- i dwuniciowego prowadzi do powstania heterodupleksu
-rekombinacja homologiczna w komórkach E. coli katalizowana jest przez
białka kodowane w genach rec; opisano trzy systemy rekombinacji: RecBCD, RecE i
RecF
-u Eukaryota crossing-over traktuje się powszechnie jako zjawisko
ograniczone do komórek podlegających mejozie; jednak sporadycznie występuje też
somatyczny (mitotyczny) crosssing-over, który ma znaczenie w naprawie DNA
-jego konsekwencje zależą od lokalizacji odcinka wymiany oraz położenia
i rozdziału centromerów chromosomów, których dotyczy to zjawisko
-pojedyncza wymiana między sprzężonymi heterozygotycznymi loci oraz
rozdział centromerów do różnych biegunów komórki w czasie anafazy prowadzi
do utraty heterozygotyczności w obrębie dystalnych odcinków w stosunku do
centromeru i punktu wymiany; utrata heterozygotyczności prowadzi m.in. do
procesu nowotworowego
REKOMBINACJA UMIEJSCOWIONA (ZLOKALIZOWANA)
-proces rekombinacji może również zajść miedzy dwiema cząsteczkami
DNA, które mają jedynie krótki obszar o wspólnej sekwencji; jest to
rekombinacja umiejscowiona
-odgrywa istotną rolę w cyklu infekcyjnym bakteriofaga λ
-bakteriofag λ, po wprowadzeniu swego DNA do komórki E. coli może
wybrać jedną z dwóch dróg infekcji: cykl lityczny lub cykl lizogenny
-w cyklu lizogennym genom λ integruje się do chromosomu E. coli;
podlega więc replikacji za każdym razem, gdy kopiowany jest DNA E. coli i
przekazywany komórkom potomnym, tak jakby był zwykłym fragmentem genomu
bakterii;
-integracja zachodzi poprzez rekombinację między miejscami att, jednym w
genomie λ, a drugim w chromosomie E. coli, mającymi w centralnym
regionie identyczną sekwencję;
-rekombinacja zachodzi między dwiema cząsteczkami kolistymi, w rezultacie
więc powstaje jedna większa, czyli DNA faga λ integruje się do genomu
bakterii
-kolejna rekombinacja zlokalizowana między dwoma miejscami att, tym razem
zawartymi w tej samej cząsteczce, odwraca proces i uwalnia DNA faga λ,
który może teraz wejść w cykl lityczny i pokierować syntezą nowych
cząstek fagowych;
-rekombinacja jest katalizowana przez wyspecjalizowaną topoizomerazę typu
I, integrazę
TRANSPOZYCJA
-transpozycja nie jest typem rekombinacji, lecz wykorzystując rekombinacje
prowadzi do przeniesienia fragmentu DNA z jednego miejsca w genomie w inne
-charakterystyczną cechą transpozycji jest to, że przenoszony fragment
jest otoczony przez parę krótkich powtórzeń prostych, które tworzą się
podczas procesu transpozycji
-rodzaje elementów ruchomych u eukariota i prokariota można ogólnie
podzielić na trzy kategorie zależnie od mechanizmu ich transpozycji:
1.Transpozony DNA, które przenoszą się replikatywnie - oryginalny
transpozon pozostaje na miejscu, a jego nowa kopia pojawia się w innym miejscu w
genomie.
2.Transpozony DNA, które przenoszą się konserwatywnie - oryginalny
transpozon przemieszcza się na nowe miejsce w procesie wycięcia i wklejenia
3.Retroelementy, które przenoszą się za pośrednictwem kopii RNA
Transpozycja replikatywna i konserwatywna transpozonów DNA
-zgodnie z przyjętym modelem replikatywna transpozycja elementu
bakteryjnego (transpozon typu Tn3 lub bakteriofag zdolny do transpozycji) jest
inicjowana przez co najmniej jedną endonukleazę, dokonującą jednoniciowych
nacięć po obu stronach transpozonu i w miejscu docelowym, do którego zostanie
wstawiona nowa kopia
-w miejscu docelowym oba nacięcia są odległe od siebie o kilka par zasad
tak, że przecięta cząsteczka dwuniciowa ma krótkie jednoniciowe końce
5'
-ligacja tych jednoniciowych końców 5' z wolnymi końcami 3' po obu
stronach transpozonu tworzy hybrydową cząsteczkę, w której oba wyjściowe DNA
– zawierający transpozon i zawierający miejsce docelowe - są
połączone przez element ruchomy, otoczony parą struktur przypominających widełki
replikacyjne;
-synteza DNA w widełkach kopiuje element ruchomy i zmienia początkową
hybrydę w kointegrat, w którym obie wyjściowe cząsteczki DNA są wciąż
połączone
-rekombinacja homologiczna rozłącza kointegrat, oddzielając oryginalną
cząsteczkę DNA wciąż zawierająca kopię transpozonu od cząsteczki
docelowej, która teraz zawiera nową kopię transpozonu; zachodzi zatem
transpozycja replikatywna;
-modyfikacja tego procesu zmienia sposób transpozycji z replikatywnego na
konserwatywny
-zamiast syntezy DNA struktura hybrydowa jest zamieniana z powrotem na dwie
oddzielne cząsteczki DNA przez dodatkowe jednoniciowe nacięcia po obu
stronach transpozonu;
-prowadzi to do wycięcia transpozonu z wyjściowej cząsteczki i
„wklejenia" go do docelowego DNA
-jeżeli występuje to u bakterii, wówczas luka w miejscu opuszczonym przez
transpozon nie może być naprawiona i cząsteczka ta, zwykle plazmid, ulega
degradacji;
-u eukariota luka ta może być naprawiona przez system naprawy przerw
dwuniciowych