TRANSFORMACJA ROŚLIN
1907, Science, Smith i Townesend
-przyczyną powstawania tumorowatych narośli na szyjce korzeniowej (tumorogeneza, rak szyjki korzeniowej) niektórych gatunków roślin jest Agrobacterium tumefaciens-wolno żyjąca bakteria glebowa gram-ujemna lub Agrobacterium rhizogenes, który wywołuje powstawanie obfitej masy korzeni włosowatych.
Kluczowym odkryciem dla zrozumienia mechanizmu powstawania tumorów było stwierdzenie obecności dużego pozachromosomalnego DNA w formie plazmidu w komórce bakterii.
Plazmid Ti(tumor inducingplasmid) -180-220 tys. par zasad, A. tumefaciens
Plazmid Ri(rootsinducingplasmid) -A. rhizogenes
Skutkiem infekcji jest przeniesienie fragmentu plazmidu Ti do komórki roślinnej, w wyniku podziałów tej komórki powstaje tumorowata narośl.
Fragment przenoszony do komórki to T-DNA(transferedDNA) -około 20 tyspz, jest włączany do genomu jądrowego komórki roślinnej. Konsekwencją włączenia T-DNAdo genomu komórki roślinnej jest przestawienie jej metabolizmu na potrzeby patogena.
Transformowane komórki roślinne:
1.rozpoczynają nieograniczoną biosyntezę znacznych ilości auksyn i cytokinin, które stymulują niekontrolowaną proliferację i powstanie tumoru.
2.dodatkowo wytwarzane sąmetabolity (pochodne aminokwasów, głównie argininy) np. oktopinalub nopalina(opiny), które wykorzystywane są przez bakterie jako źródło węgla i azotu.
MECHANIZMY MOLEKULARNE
Plazmidy stanowią bardzo ważny dla życia bakterii, dodatkowy pozachromosomalny nośnik informacji genetycznej, który decyduje o dużej ich zmienności i potencjale adaptacyjnym.
Plazmid Ti występuje w komórkach Agrobacterium w niewielkiej liczbie kopii (1-2), może być przenoszony z jednej komórki do drugiej na drodze koniugacji.
Plazmidy Ti zawierają geny biosyntezy i katabolizmu opin, które stały się podstawa klasyfikacji szczepów bakterii.
U różnych szczepów A.t. występują identyczne onkogeny:
1. Gen syntezy cytokininy: ipt-gen izopentynylotransferazy
2. Geny biosyntezy auksyn:
iaaM-gen monooksygenazytryptofanu
iaaH-gen hydrolazy indoliloacetoamidu
Region T-DNA jest ograniczony sekwencjami granicznymi (LB i RB), które tworzą odwrócone powtórzenia 25 pz i są przenoszone do komórki roślinnej wraz z genami w obszarze T-DNA.
Za proces przenoszenia T-DNA odpowiedzialne są:
1.geny zlokalizowane w REJONIE WIRULENCJI (vir) plazmidu,
2.geny chv na chromosomie bakteryjnym.
Geny z regionu vir są zgrupowane w operony oznaczone literami od A do R, z których każdy koduje od jednego do kilku genów.
Etapy transferu T-DNA z A. tumefaciens do komórki roślinnej:
1.Chemotaksja -uwolnienie podczas zranienia rośliny pochodnych fenolowych i cukrów, a także zakwaszenie środowiska, co prowadzi do indukcji genów regionu wirulencji (vir) plazmidu Ti,
2. Adhezja -kontakt komórki bakteryjnej z komórką roślinną. W procesie tym biorą udział adhezyny bakteryjne (polisacharydy zewnątrzkomórkowe, fibryllecelulozowe oraz białko zwane rhicadhezyną), a także adhezyjny roślinne (np. zmodyfikowane pektyny, białka wiążące cukry -lektyny).
3. Rozpoznanie prawej sekwencji granicznej i przecięcie jednej nici T-DNA(„dolnej”), przyłączenie białka virD2 do końca 5'nici T,
4. Opłaszczenienici ssDNA przez białka virE2,
5. Transport przez błony komórek,
6. Transport do jądra komórkowego gospodarza.
białko vir -charakterystyka
-virA -Ulega konstytutywnej ekspresji, tworzy kompleks z virB, który uruchamia ekspresję pozostałych genów wirulencji. Kompleks ten ulega indukcji pod wpływem roślinnych substancji fenolowych (acetosyringon, allkohol koniferolowy, kwas ferulowy, inne prekursory lignin). Białko virA zlokalizowane jest w błonie bakterii i działa jako receptor substancji fenolowych.
-virB -Ulega konstytutywnej ekspresji, jest uruchamiane przez virA i działa jako aktywator transkrypcji.
-virD1-Wycinanie z plazmidu Ti jednoniciowego odcinka DNA (ssDNA), aktywność topoizomerazy(rozplecenie helisy DNA).
-virD2 -Wycinanie z plazmidu Ti jednonicioweg oodcinka DNA, aktywność endonukleazy(przecięcie dolnej nici obszaru T-DNA od strony 5', bliżej RB), umożliwia również transport nici T do jądra komórki roślinnej dzięki posiadaniu tzw. sygnału lokalizacji jądrowej (NLS).
-virC1 -Powinowactwo do specyficznej sekwencji wzmacniającej E o nazwie overdrive, warunkującej optymalne wytworzenie ssDNAi umożliwiającej rozpoznanie przez virD2 prawej sekwencji granicznej.
-virE2 -Białka te opłaszczają ssDNA (funkcja ochronna podczas transportu przed działaniem enzymów nukleolitycznych), posiadają również domenę NLS.
-virB -virB4, virB8, virB9, virB10, virB11 są zlokalizowane w błonie bakteryjnej i pośredniczą w transporcie nici T.
-virF -Działa w komórce roślinnej, bierze udział w aktywacji systemu proteolitycznego komórki gospodarza virH Detoksyfikacja:
-VirH1 -oksydaza typu P450, VirH2 - demetylazafenolowych induktorów np. acetosyryngonu(AS)
-virM, L, K, J, F, P, R, D3, D5, E3 -Inne białka vir o mniej istotnych funkcjach
Transformacja roślin
-poza odcinkiem T-DNA żadna inna część plazmidu Ti nie jest przenoszona do komórki roślinnej,
-żaden z genów regionu T-DNA nie uczestniczy w przenoszeniu tego fragmentu i nie jest niezbędny do efektywnej transformacji.
Skonstruowano tzw. szczepy rozbrojone.
Bakterie te zawierają plazmidy z usuniętym oryginalnym T-DNA, a zachowują wszystkie niezbędne funkcje do przeniesienia „nowego”T-DNA tzn. region viri geny chv, dzięki czemu można przenosić zamiast natywnego T-DNA dowolne geny, bez wywoływania efektów ubocznych tzn. narośli lub korzeni włosowatych.
Układ ten nazwano binarnym:
-plazmid binarny-nie ma regionu vir, a w T-DNA są nowe geny,
-plazmid pomocniczy -rozbrojony plazmid Ti (bez T-DNA, z regionem vir).
WEKTOR = przewoźnik
Konstrukcja genowa -odpowiednio przygotowany odcinek T-DNA metodami inżynierii genetycznej.
Wyprowadzenie roślin z komórek transformowanych nie różni się zasadniczo od typowej procedury regeneracji, wyłączając przypadki tzw. Zmienności somaklonalnej.
Rośliny transgeniczne zregenerowane tą droga poza nową cechą związaną z wprowadzonym nowym genem, niczym nie różnią sięod materiału matecznego.
Selekcja
Selekcja tkanki transgenicznej polega na dodaniu do pożywki odpowiedniego czynnika selekcyjnego (antybiotyk, herbicyd). Niestransformowane komórki nie rozwijają się lub zamierają.
-Gen fosfotransferazy neomycynowej nptII- odporność na antybiotyki aminoglikozydowe np. neomycyna, kanamycyna, genetycyna. Fosfotransferaza inaktywuje te antybiotyki na drodze fosforylacji.
-Gen fosfotransferaz higromycyny- hpt
-Gen acetylotransferaza fosfinotrycyny bar -odporność na herbicyd Basta lub Bialofos (detoksyfikacja fosfinotrycyny). Fosfinotrycyna (czynnik aktywny tych herbicydów) hamuje syntezę glutaminową. W wyniku przerwania łańcucha przyswajania azotu nagromadza się w komórkach toksyczny amoniak.
Geny reporterowe Są odpowiedzialne za kodowanie produktów, które łatwo wykrywa się prostymi technikami enzymatycznymi lub histochemicznymi.
-Gen uidA -kodujący β-glukuronidazę(GUS). Enzym ten ma zdolność rozkładu wiązania glukuronidowego, które występuje w syntetycznym substracie x-glukuronidzie. W wyniku jego rozpadu powstaje glukuronidi indoksyl, który pod wpływem tlenu dimeryzuje do niebieskiego barwnika indygo.
-Gen LUC -lucyferaza
-Gen GFP
-Gen YFP
-Gen RFP
METODY WPROWADZANIA GENÓW
I. Transformacja pośrednia:
1. Transformacja z użyciem Agrobacterium tumefacienslub rhizogenes,
-z wykorzystaniem kultur invitro,
-bez wykorzystania kultur invitro.
II. Transformacja bezpośrednia:
1 Transformacja protoplastów -polega na umieszczeniu protoplastów w roztworze plazmidowego DNA i spowodowanie jego przeniknięcie do wnętrza komórki. Dodanie PEGu powoduje zmianę właściwości fizyko-chemicznych błony komórkowej -zostaje zwiększona jej półprzepuszczalność. Umieszczenie protoplastów w zmiennym polu elektrycznym o określonej długości trwania i częstości mikroimpulsów powoduje powstanie w błonie komórkowej mikroporów. Gatunki jednoliścienne: kukurydza, pszenica, jęczmień, ryż
2 Mikrowstrzeliwanie (particlebombardment) -polega na wprowadzeniu cząsteczek metali pokrytych DNA, z bardzo dużą prędkością (rzędu kilkuset metrów/s) do komórek. Prędkość tę uzyskuje się w specjalnie skonstruowanych aparatach. Czynnikiem przyspieszającym jest proch strzelniczy (rzadziej) lub hel. Po raz I wykorzystano tę metodę w 1987 r do transformacji cebuli. Gatunki jednoliścienne: wszystkie gatunki zbóż, trzcina cukrowa i tulipan
Problemy merytoryczne ważne dla rozwoju transgenicznej hodowli roślin:
1. Warsztatowe
-poznanie zasad gwarantujących optymalną ekspresję transgenów dla poszczególnych cech (miejsce insercji, jakośćelementów konstrukcji, stabilność ekspresji, warunki wzrostu pokolenia T0, wyciszanie ...),
-rozwój metodyki transformacji (miejscowo-specyficzna rekombinacja, usuwanie genów markerowych, znaczący wzrost wydajności i prostoty transformacji),
-czy niezależne wprowadzenie kilku różnych transgenów do tego samego biorcy rodzi nowe uwarunkowania w ich ekspresji,
-opracowanie wydajnych metod transformacji organelli komórkowych.
2. Ogólne
-jak wpłynie na wartość diety powszechna obecność określonego białka nieżywieniowego w jej składzie.
Enzym PAT (acetylotransferazafosfinotrycyny) acetylujecząsteczki glufosynatutak, że nie zakłócająone metabolizmu komórki i roślina staje siętolerancyjna na herbicyd.
Pierwsza generacja transgenicznych odmian roślin uprawnych (1995-2005)
Podstawowymi zaletami tych odmian są:
-zwiększone plonowanie
-zmniejszone zużycie środków chemicznych
-zmniejszone zanieczyszczenie gleby i środowiska
-oddziaływanie prozdrowotne w wyniku zmniejszonej zawartości pestycydów i/lub toksyn
Druga generacja transgenicznych odmian roślin uprawnych (2005-2015)
Cechy:
-Odporność na herbicydy, szkodniki i patogeny;
-tolerancja na suszę, zasolenie, metale ciężkie i temperaturę;
-poprawiona wartość odżywcza (białka, tłuszcze, witaminy, składniki mineralne);
-poprawiona zdolność przechowalnicza owoców i warzyw;
-poprawiony smak i zapach;
-eliminacja alergenów;
-szczepionki, białka dla medycyny ludzkiej;
-farmaceutyki;
-fitoremediacja
Trzecia generacja transgenicznych roślin uprawnych (2015 i później).
Cechy:
•zmiana architektury rośliny;
•kształtowanie czasu kwitnienia, jakości, wielkości, oraz liczby owoców i nasion;
•poprawa wydajności fotosyntetyczneji przyswajania składników pokarmowych;
•wykorzystanie heterozji i apomiksji.
Rośliny transgeniczne z Bt:
-Roślinożerne owady są jedną z głównych przyczyn obniżania plonów roślin uprawnych.
-Stosowanie środków owadobójczych, wiąże się z wysokimi kosztami ekonomicznymi oraz zanieczyszczeniem środowiska.
Jednymi z pierwszych roślin transgenicznych, które pojawiły się na rynku, były rośliny zawierające geny kodujące owadobójcze toksyny izolowane z powszechnie występującej bakterii Bacillusthuringiensis(Bt):
-w latach 1995 -1996 -kukurydza, bawełna oraz ziemniak
-w 1999 r. blisko 24% światowej uprawy kukurydzy oraz 5% światowej uprawy bawełny zawierało transgen toksyny Bt(GOULD 2000).
Zyski finansowe wynikające z uprawy odmian roślin transgenicznych są znaczące.
Prognozy ISAAA (ang. International Servicefor theAquisition for Agri-Biotech Applications), wskazują na wzrost zysków wynikających z uprawy roślin transgenicznych z 3 mld dolarów w 2000 r. do 8 mld i 25 mld dolarów odpowiednio w latach 2005 i 2010.
Ryzyko ekologiczne.
Jednym z potencjalnych zagrożeń wynikających z uprawy roślin Btjest nieznany efekt działania toksyny na owady nie będące bezpośrednimi szkodnikami roślin uprawnych, zwłaszcza, jeżeli organizmy te żywią się szkodnikami i są pożyteczne z rolniczego punktu widzenia.
Bacillus thuringiensis:
-gram-dodatnia bakteria zdolna do wytwarzania spor,
-bytuje w wielu środowiskach, takich jak np. gleba czy rośliny i w odróżnieniu od innych gatunków Bacillus,
-podczas sporulacji wytwarza parasporalne kryształy.
Kryształy składają się z jednej lub kilku δ-endotoksyn lub białek kryształowych (CRY) o masie około 130 kDa. Toksyny te należą do dużej i wciąż nie w pełni poznanej rodziny białek homologicznych -dotychczas zidentyfikowano ponad 130 genów kodujących te białka.
Toksyny Bt zabijają dorosłe owady i ich gąsienice należące do rzędów:
-motyle (Lepidoptera),
-dwuskrzydłe (Diptera),
-chrząszcze (Coleoptera).
Owady wrażliwe mają receptor w błonach komórkowych, pośredniczący w transporcie toksyny do wnętrza komórek.
W alkalicznym środowisku ich przewodu pokarmowego, wytwarzana przez bakterie protoksyna(130 kDa) ulega proteolizie, z wytworzeniem produktu (70 kDa) paraliżującego owada.