Hodowla wykład4, SGGW Rolnictwo Materiały


TRANSFORMACJA ROŚLIN

1907, Science, Smith i Townesend

-przyczyną powstawania tumorowatych narośli na szyjce korzeniowej (tumorogeneza, rak szyjki korzeniowej) niektórych gatunków roślin jest Agrobacterium tumefaciens-wolno żyjąca bakteria glebowa gram-ujemna lub Agrobacterium rhizogenes, który wywołuje powstawanie obfitej masy korzeni włosowatych.

Kluczowym odkryciem dla zrozumienia mechanizmu powstawania tumorów było stwierdzenie obecności dużego pozachromosomalnego DNA w formie plazmidu w komórce bakterii.

Plazmid Ti(tumor inducingplasmid) -180-220 tys. par zasad, A. tumefaciens

Plazmid Ri(rootsinducingplasmid) -A. rhizogenes

Skutkiem infekcji jest przeniesienie fragmentu plazmidu Ti do komórki roślinnej, w wyniku podziałów tej komórki powstaje tumorowata narośl.

Fragment przenoszony do komórki to T-DNA(transferedDNA) -około 20 tyspz, jest włączany do genomu jądrowego komórki roślinnej. Konsekwencją włączenia T-DNAdo genomu komórki roślinnej jest przestawienie jej metabolizmu na potrzeby patogena.

Transformowane komórki roślinne:

1.rozpoczynają nieograniczoną biosyntezę znacznych ilości auksyn i cytokinin, które stymulują niekontrolowaną proliferację i powstanie tumoru.

2.dodatkowo wytwarzane sąmetabolity (pochodne aminokwasów, głównie argininy) np. oktopinalub nopalina(opiny), które wykorzystywane są przez bakterie jako źródło węgla i azotu.

MECHANIZMY MOLEKULARNE

Plazmidy stanowią bardzo ważny dla życia bakterii, dodatkowy pozachromosomalny nośnik informacji genetycznej, który decyduje o dużej ich zmienności i potencjale adaptacyjnym.

Plazmid Ti występuje w komórkach Agrobacterium w niewielkiej liczbie kopii (1-2), może być przenoszony z jednej komórki do drugiej na drodze koniugacji.

Plazmidy Ti zawierają geny biosyntezy i katabolizmu opin, które stały się podstawa klasyfikacji szczepów bakterii.

U różnych szczepów A.t. występują identyczne onkogeny:

1. Gen syntezy cytokininy: ipt-gen izopentynylotransferazy

2. Geny biosyntezy auksyn:

iaaM-gen monooksygenazytryptofanu

iaaH-gen hydrolazy indoliloacetoamidu

Region T-DNA jest ograniczony sekwencjami granicznymi (LB i RB), które tworzą odwrócone powtórzenia 25 pz i są przenoszone do komórki roślinnej wraz z genami w obszarze T-DNA.

Za proces przenoszenia T-DNA odpowiedzialne są:

1.geny zlokalizowane w REJONIE WIRULENCJI (vir) plazmidu,

2.geny chv na chromosomie bakteryjnym.

Geny z regionu vir są zgrupowane w operony oznaczone literami od A do R, z których każdy koduje od jednego do kilku genów.

Etapy transferu T-DNA z A. tumefaciens do komórki roślinnej:

1.Chemotaksja -uwolnienie podczas zranienia rośliny pochodnych fenolowych i cukrów, a także zakwaszenie środowiska, co prowadzi do indukcji genów regionu wirulencji (vir) plazmidu Ti,

2. Adhezja -kontakt komórki bakteryjnej z komórką roślinną. W procesie tym biorą udział adhezyny bakteryjne (polisacharydy zewnątrzkomórkowe, fibryllecelulozowe oraz białko zwane rhicadhezyną), a także adhezyjny roślinne (np. zmodyfikowane pektyny, białka wiążące cukry -lektyny).

3. Rozpoznanie prawej sekwencji granicznej i przecięcie jednej nici T-DNA(„dolnej”), przyłączenie białka virD2 do końca 5'nici T,

4. Opłaszczenienici ssDNA przez białka virE2,

5. Transport przez błony komórek,

6. Transport do jądra komórkowego gospodarza.

białko vir -charakterystyka

-virA -Ulega konstytutywnej ekspresji, tworzy kompleks z virB, który uruchamia ekspresję pozostałych genów wirulencji. Kompleks ten ulega indukcji pod wpływem roślinnych substancji fenolowych (acetosyringon, allkohol koniferolowy, kwas ferulowy, inne prekursory lignin). Białko virA zlokalizowane jest w błonie bakterii i działa jako receptor substancji fenolowych.

-virB -Ulega konstytutywnej ekspresji, jest uruchamiane przez virA i działa jako aktywator transkrypcji.

-virD1-Wycinanie z plazmidu Ti jednoniciowego odcinka DNA (ssDNA), aktywność topoizomerazy(rozplecenie helisy DNA).

-virD2 -Wycinanie z plazmidu Ti jednonicioweg oodcinka DNA, aktywność endonukleazy(przecięcie dolnej nici obszaru T-DNA od strony 5', bliżej RB), umożliwia również transport nici T do jądra komórki roślinnej dzięki posiadaniu tzw. sygnału lokalizacji jądrowej (NLS).

-virC1 -Powinowactwo do specyficznej sekwencji wzmacniającej E o nazwie overdrive, warunkującej optymalne wytworzenie ssDNAi umożliwiającej rozpoznanie przez virD2 prawej sekwencji granicznej.

-virE2 -Białka te opłaszczają ssDNA (funkcja ochronna podczas transportu przed działaniem enzymów nukleolitycznych), posiadają również domenę NLS.

-virB -virB4, virB8, virB9, virB10, virB11 są zlokalizowane w błonie bakteryjnej i pośredniczą w transporcie nici T.

-virF -Działa w komórce roślinnej, bierze udział w aktywacji systemu proteolitycznego komórki gospodarza virH Detoksyfikacja:

-VirH1 -oksydaza typu P450, VirH2 - demetylazafenolowych induktorów np. acetosyryngonu(AS)

-virM, L, K, J, F, P, R, D3, D5, E3 -Inne białka vir o mniej istotnych funkcjach

Transformacja roślin

-poza odcinkiem T-DNA żadna inna część plazmidu Ti nie jest przenoszona do komórki roślinnej,

-żaden z genów regionu T-DNA nie uczestniczy w przenoszeniu tego fragmentu i nie jest niezbędny do efektywnej transformacji.

Skonstruowano tzw. szczepy rozbrojone.

Bakterie te zawierają plazmidy z usuniętym oryginalnym T-DNA, a zachowują wszystkie niezbędne funkcje do przeniesienia „nowego”T-DNA tzn. region viri geny chv, dzięki czemu można przenosić zamiast natywnego T-DNA dowolne geny, bez wywoływania efektów ubocznych tzn. narośli lub korzeni włosowatych.

Układ ten nazwano binarnym:

-plazmid binarny-nie ma regionu vir, a w T-DNA są nowe geny,

-plazmid pomocniczy -rozbrojony plazmid Ti (bez T-DNA, z regionem vir).

WEKTOR = przewoźnik

Konstrukcja genowa -odpowiednio przygotowany odcinek T-DNA metodami inżynierii genetycznej.

Wyprowadzenie roślin z komórek transformowanych nie różni się zasadniczo od typowej procedury regeneracji, wyłączając przypadki tzw. Zmienności somaklonalnej.

Rośliny transgeniczne zregenerowane tą droga poza nową cechą związaną z wprowadzonym nowym genem, niczym nie różnią sięod materiału matecznego.

Selekcja

Selekcja tkanki transgenicznej polega na dodaniu do pożywki odpowiedniego czynnika selekcyjnego (antybiotyk, herbicyd). Niestransformowane komórki nie rozwijają się lub zamierają.

-Gen fosfotransferazy neomycynowej nptII- odporność na antybiotyki aminoglikozydowe np. neomycyna, kanamycyna, genetycyna. Fosfotransferaza inaktywuje te antybiotyki na drodze fosforylacji.

-Gen fosfotransferaz higromycyny- hpt

-Gen acetylotransferaza fosfinotrycyny bar -odporność na herbicyd Basta lub Bialofos (detoksyfikacja fosfinotrycyny). Fosfinotrycyna (czynnik aktywny tych herbicydów) hamuje syntezę glutaminową. W wyniku przerwania łańcucha przyswajania azotu nagromadza się w komórkach toksyczny amoniak.

Geny reporterowe Są odpowiedzialne za kodowanie produktów, które łatwo wykrywa się prostymi technikami enzymatycznymi lub histochemicznymi.

-Gen uidA -kodujący β-glukuronidazę(GUS). Enzym ten ma zdolność rozkładu wiązania glukuronidowego, które występuje w syntetycznym substracie x-glukuronidzie. W wyniku jego rozpadu powstaje glukuronidi indoksyl, który pod wpływem tlenu dimeryzuje do niebieskiego barwnika indygo.

-Gen LUC -lucyferaza

-Gen GFP

-Gen YFP

-Gen RFP

METODY WPROWADZANIA GENÓW

I. Transformacja pośrednia:

1. Transformacja z użyciem Agrobacterium tumefacienslub rhizogenes,

-z wykorzystaniem kultur invitro,

-bez wykorzystania kultur invitro.

II. Transformacja bezpośrednia:

1 Transformacja protoplastów -polega na umieszczeniu protoplastów w roztworze plazmidowego DNA i spowodowanie jego przeniknięcie do wnętrza komórki. Dodanie PEGu powoduje zmianę właściwości fizyko-chemicznych błony komórkowej -zostaje zwiększona jej półprzepuszczalność. Umieszczenie protoplastów w zmiennym polu elektrycznym o określonej długości trwania i częstości mikroimpulsów powoduje powstanie w błonie komórkowej mikroporów. Gatunki jednoliścienne: kukurydza, pszenica, jęczmień, ryż

2 Mikrowstrzeliwanie (particlebombardment) -polega na wprowadzeniu cząsteczek metali pokrytych DNA, z bardzo dużą prędkością (rzędu kilkuset metrów/s) do komórek. Prędkość tę uzyskuje się w specjalnie skonstruowanych aparatach. Czynnikiem przyspieszającym jest proch strzelniczy (rzadziej) lub hel. Po raz I wykorzystano tę metodę w 1987 r do transformacji cebuli. Gatunki jednoliścienne: wszystkie gatunki zbóż, trzcina cukrowa i tulipan

Problemy merytoryczne ważne dla rozwoju transgenicznej hodowli roślin:

1. Warsztatowe

-poznanie zasad gwarantujących optymalną ekspresję transgenów dla poszczególnych cech (miejsce insercji, jakośćelementów konstrukcji, stabilność ekspresji, warunki wzrostu pokolenia T0, wyciszanie ...),

-rozwój metodyki transformacji (miejscowo-specyficzna rekombinacja, usuwanie genów markerowych, znaczący wzrost wydajności i prostoty transformacji),

-czy niezależne wprowadzenie kilku różnych transgenów do tego samego biorcy rodzi nowe uwarunkowania w ich ekspresji,

-opracowanie wydajnych metod transformacji organelli komórkowych.

2. Ogólne

-jak wpłynie na wartość diety powszechna obecność określonego białka nieżywieniowego w jej składzie.

Enzym PAT (acetylotransferazafosfinotrycyny) acetylujecząsteczki glufosynatutak, że nie zakłócająone metabolizmu komórki i roślina staje siętolerancyjna na herbicyd.

Pierwsza generacja transgenicznych odmian roślin uprawnych (1995-2005)

Podstawowymi zaletami tych odmian są:

-zwiększone plonowanie

-zmniejszone zużycie środków chemicznych

-zmniejszone zanieczyszczenie gleby i środowiska

-oddziaływanie prozdrowotne w wyniku zmniejszonej zawartości pestycydów i/lub toksyn

Druga generacja transgenicznych odmian roślin uprawnych (2005-2015)

Cechy:

-Odporność na herbicydy, szkodniki i patogeny;

-tolerancja na suszę, zasolenie, metale ciężkie i temperaturę;

-poprawiona wartość odżywcza (białka, tłuszcze, witaminy, składniki mineralne);

-poprawiona zdolność przechowalnicza owoców i warzyw;

-poprawiony smak i zapach;

-eliminacja alergenów;

-szczepionki, białka dla medycyny ludzkiej;

-farmaceutyki;

-fitoremediacja

Trzecia generacja transgenicznych roślin uprawnych (2015 i później).

Cechy:

•zmiana architektury rośliny;

•kształtowanie czasu kwitnienia, jakości, wielkości, oraz liczby owoców i nasion;

•poprawa wydajności fotosyntetyczneji przyswajania składników pokarmowych;

•wykorzystanie heterozji i apomiksji.

Rośliny transgeniczne z Bt:

-Roślinożerne owady są jedną z głównych przyczyn obniżania plonów roślin uprawnych.

-Stosowanie środków owadobójczych, wiąże się z wysokimi kosztami ekonomicznymi oraz zanieczyszczeniem środowiska.

Jednymi z pierwszych roślin transgenicznych, które pojawiły się na rynku, były rośliny zawierające geny kodujące owadobójcze toksyny izolowane z powszechnie występującej bakterii Bacillusthuringiensis(Bt):

-w latach 1995 -1996 -kukurydza, bawełna oraz ziemniak

-w 1999 r. blisko 24% światowej uprawy kukurydzy oraz 5% światowej uprawy bawełny zawierało transgen toksyny Bt(GOULD 2000).

Zyski finansowe wynikające z uprawy odmian roślin transgenicznych są znaczące.

Prognozy ISAAA (ang. International Servicefor theAquisition for Agri-Biotech Applications), wskazują na wzrost zysków wynikających z uprawy roślin transgenicznych z 3 mld dolarów w 2000 r. do 8 mld i 25 mld dolarów odpowiednio w latach 2005 i 2010.

Ryzyko ekologiczne.

Jednym z potencjalnych zagrożeń wynikających z uprawy roślin Btjest nieznany efekt działania toksyny na owady nie będące bezpośrednimi szkodnikami roślin uprawnych, zwłaszcza, jeżeli organizmy te żywią się szkodnikami i są pożyteczne z rolniczego punktu widzenia.

Bacillus thuringiensis:

-gram-dodatnia bakteria zdolna do wytwarzania spor,

-bytuje w wielu środowiskach, takich jak np. gleba czy rośliny i w odróżnieniu od innych gatunków Bacillus,

-podczas sporulacji wytwarza parasporalne kryształy.

Kryształy składają się z jednej lub kilku δ-endotoksyn lub białek kryształowych (CRY) o masie około 130 kDa. Toksyny te należą do dużej i wciąż nie w pełni poznanej rodziny białek homologicznych -dotychczas zidentyfikowano ponad 130 genów kodujących te białka.

Toksyny Bt zabijają dorosłe owady i ich gąsienice należące do rzędów:

-motyle (Lepidoptera),

-dwuskrzydłe (Diptera),

-chrząszcze (Coleoptera).

Owady wrażliwe mają receptor w błonach komórkowych, pośredniczący w transporcie toksyny do wnętrza komórek.

W alkalicznym środowisku ich przewodu pokarmowego, wytwarzana przez bakterie protoksyna(130 kDa) ulega proteolizie, z wytworzeniem produktu (70 kDa) paraliżującego owada.



Wyszukiwarka

Podobne podstrony:
Hodowla wykład6, SGGW Rolnictwo Materiały
HODOWLA IIcz. egzaminu, SGGW Rolnictwo Materiały
HODOWLA Icz. egzaminu, SGGW Rolnictwo Materiały
Fitopatologia cw.4, SGGW Rolnictwo Materiały
finanse i bankowość, SGGW Rolnictwo Materiały
Biochemia 1 spr, SGGW Rolnictwo Materiały
Przykładowe+pytania+egzaminacyjne Rolnictwo2013, SGGW Rolnictwo Materiały, Botanika Materiały do egz
Ekonomia-egzamin, SGGW Rolnictwo Materiały
Fitopatologia ćw2, SGGW Rolnictwo Materiały
Biochemia 6 kolokwium, SGGW Rolnictwo Materiały
Meteorologia, SGGW Rolnictwo Materiały
Botanika, SGGW Rolnictwo Materiały
Szczegółowa uprawa kolokwium, SGGW Rolnictwo Materiały
Ogólna uprawa I sem, SGGW Rolnictwo Materiały
Ogólna uprawa, SGGW Rolnictwo Materiały
Biochemia 1 kolokwium, SGGW Rolnictwo Materiały
mikrobiologia zywnosci, SGGW Rolnictwo Materiały
Hodowla wykład5, studia rolnictwo, semestr 5

więcej podobnych podstron