Ćwiczenie 2.

Otrzymywanie ekstraktów bezkomórkowych.

I ) Metoda mechaniczna

Zadanie 1.1. Otrzymywanie ekstraktów bezkomórkowych z wykorzystaniem dezintegratora.

Materiały: drożdże piekarskie , bufor Tris 50mM pH 7.0.

1. Porcję drożdży piekarskich (10g) zawiesić w 50 ml wody destylowanej, dokładnie wymieszać i odwirować (5 min w 4000 rpm) w temperaturze 4^oC.

2. Osad zawiesić w małej ilości schłodzonego buforu. Umieścić w lodzie.

3. Naczynie dezintegratora wypełnić do około połowy szklanymi kulkami, uprzednio schłodzonymi. Następnie przenieść do niego zawieszone w buforze komórki i dopełnić buforem prawie do pełna. Naczynie ochronne wypełnić lodem. Aparat zabezpieczyć sprężynami.

4. Cykl dezintegracji trwa 3 min.

5. Po zakończeniu dezintegracji przenieść ekstrakt komórkowy do cylindra miarowego (zanotować objętość uzyskanego ekstraktu).

6. Do dwóch probówek wirówkowych przenieść po 5 ml ekstraktu i odwirować fragmenty komórek przez 5 min w 6000 rpm. W powstałym ekstrakcie bezkomórkowym sprawdzić stężenie białka.

II) Metoda chemiczna

Zadanie 1.2. Otrzymywanie ekstraktów bezkomórkowych przy użyciu detergentu - Tween 80.

Materiały: drożdże piekarskie , bufor tris 50mM pH 7.0.

1. Porcję drożdży piekarskich (10g) zawiesić w 50 ml wody destylowanej, dokładnie wymieszać i odwirować (5 min w 4000 rpm) w temperaturze 4^oC.

2. Osad zawiesić w 50 ml buforu i umieścić w kolbce.

3. Dodać odpowiednią ilość czynnika dezintegrującego - Tween 80, tak by stężenie końcowe detergentu w kolbce wynosiło 1%.

4. Kolbki inkubować przez 20 minut na wytrząsarce w temperaturze 30°C.

5. Po tym czasie, w dwóch probówkach wirówkowych zawierających po 5 ml ekstraktu, odwirować fragmenty komórek przez 5 min w 6000 rpm i w powstałym roztworze sprawdzić stężenie białka metodą Bradford'a.

III. Metoda fizyczna

Zadanie 1.3. Otrzymywanie ekstraktów bezkomórkowych poprzez zastosowanie szoku temperaturowego.

Materiały: drożdże piekarskie, bufor tris 50mM pH 7.0,

1. Porcję drożdży piekarskich (10g) zawiesić w 50 ml wody destylowanej, dokładnie wymieszać i odwirować (5 min w 4000 rpm) w temperaturze 4^oC.

2. Komórki drożdży zawiesić w 10 ml buforu Tris i przenieść do plastikowego pojemnika.

3. Zawiesinę mikroorganizmów wstawić do zamrażarki na ok. 15 min.

4. Po tym czasie zawiesinę szybko rozmrozić w łaźni wodnej (50˚C).

5. Następnie roztwór, schłodzony do temperatury pokojowej, ponownie zamrozić.

6. Po całkowitym zamrożeniu, ponownie przeprowadzić procedurę rozmrażania.

7. Odwirować, w dwóch probówkach wirówkowych zawierających po 5 ml ekstraktu, fragmenty komórek przez 5 min w 6000 rpm i w powstałym ekstrakcie bezkomórkowym sprawdzić stężenie białka.

Metoda Bradforda

1. Sporządzenie krzywej standardowej

1. Przygotować wzorcowy roztwór albuminy o stężeniu 1mg/ml

2. Następnie sporządzić 1 ml roztworu albuminy o stężeniu 0.2mg/ml w probówce eppendorfa.

3. W kolejnych probówkach eppendorfa umieścić 1 ml odczynnika Bradforda i kolejno roztwory albuminy 5μl, 10μl, 15μl, 20μl, 30μl, 50μl

4. Po upływie 5 min mierzyć przy 595nm wobec próby kontrolnej zawierającej tylko 1 ml odczynnika.

5. Oznaczyć białko metodą Bradforda i wykreślić krzywą standardową.

2. Oznaczanie ilości białka metodą Bradforda.

Odczynnik Bradforda:

100mg błękitu Coomasie Blue G rozpuszczono w 50ml 95% etanolu, następnie dodano 100ml 85% kwasu fosforowego i uzupełniono do objętości 1litra wodą destylowaną.

Wykonanie:

W próbówkach eppendorfa umieścić 1 ml odczynnika Bradforda a następnie dodawać odpowiednie ilości badanego roztworu (albo 5, 7, 10, 15, 20 μl albo 10, 20, 30, 40 ,50 μl) dokładnie wymieszać Następnie zmierzyć ekstynkcję przy 595nm wobec próby kontrolnej .

Mikrobiologia przemysłowa

1

---