Sprawozdanie II

Nr grupy: II
Data wykonania ćwiczenia: 20.02.2013	Tytuł ćwiczenia: Spektrofotometria UV/VIS	Data oddania sprawozdania: 08.03.2013	Zaliczenia/ocena:

1. Wstęp teoretyczny:

Do ilościowego oznaczenia subst. W próbkach biologicznych stosuje się najczęściej metody kolorymetryczne. W metodach tych reakcja chemiczna, w której substratem jest badana substancja, daje barwny produkt pochłaniający światło o okręślonej długości fali. Zgodnie z prawem Lamberta-Beera stężenie badanej substancji jest w pewnym zakresie stężeń proporcjonalne do absorbancji próbki.

A=ε*l*c

Gdy chcemy oznaczyć stężenie białka w próbce należy przygotować krzywą wzorcową , która obrazuje zależność absorbancji roztworów od różnych stężeń wzorcowego białka (najczęśćiej albumina wołowa), na którym przeprowadza się reakcję chemiczną.

Metoda Lowry'ego pozwala na oznaczenie białka nawet w stężeniu 50 μg/ml, jest więc około 20 razy bardziej czuła niż metoda biuretowa. Wiązanie peptydowe oraz aminokwasy aromatyczne reagują w środowisku zasadowym (w obecności jonów miedzi) z odczynnikiem Folina-Ciocalteu będącego mieszaniną kwasu fosforomolobdenowego oraz fosforowolframowego. Miedź (II) związana z białkiem oraz tyrozyna i tryptofan redukują powyższe kwasy do ich tlenków. Sporządzając krzywą wzorcową w oparciu o różne stężenia białka należy zdawać sobie sprawę, że w ten sposób uzyskuje się przybliżone wartości stężenia białka. Fenole, nitrofenole, a także w mniejszym stopniu puryny i pirymidyny, kwas moczowy oraz niektóre detergenty reagują z odczynnikiem Folina zwiększając natężenie barwy przygotowanych roztworów białka. Natomiast siarczan VI cynku II, siarczan VI amonu, aceton, etanol, sacharoza zależnie od stężenia białka będą obniżać intensywność barwy.

2. Cel ćwiczenia: Wyznaczenie stężenia białka w badanej próbce w oparciu o przygotowaną krzywą wzorcową zależności absorbancji od znanego stężenia roztworów tego białka.

3. Przygotowanie ćwieczenia: Ćwiczenie zostało przygotowane zgodnie z podaną instrukcją. Przygotowanie roztworów potrzebnych do sporządzenia krzywej wzorcowej zestawiono w Tab.1. Stężenie roztworu wyjściowego wynosiło 1 [mg/ml].

Przygotowanie stężeń:

- przygotowanie stężenia 0.2 mg/ml:

1mg - 1ml

0.2mg- x

x= 0.2 ml roztworu wyjściowego + 0.8 ml wody

- w pokazany sposób przeliczono także proporcje wody i roztworu wyjściowego dla kolejnych stężeń roztworów.

Tab.1. Odpowiednie objętości wody i roztworu wyjściowego pobrane w celu sporządzenia roztworów białka o znanym stężeniu i objętości 1ml.

Pożądane stężenie roztworu [mg/ml]	Objętość roztworu wyjściwoego [ml]	Objętośc wody [ml]
0	0	1
0.2	0.2	0.8
0.4	0.4	0.6
0.6	0.6	0.4
0.8	0.8	0.2
1.0	1.0	0

4. Dane pomiarowe:

Uzyskane wyniki zestawiono w tabeli 2 (Tab.2.). Policzono także średnią absorbancję próbek ze sporządzonych powtórzeń. Na ich podstawie wykreślono krzywą wzorcową.

Tab.2. Wyniki pomiaru absorbancji dla próbek wzorcowych oraz próbek badanych.

Stężenie próbki	0	0.2	0.4	0.6	0.8	1.0	Badana próbka
Absorbancja (3 powtórzenia)	0	0.1335	0.2341	0.3482	0.4488	0.5593	0.2241
				0.1473	0.2431	0.3472	0.3996	0.5769	0.2435
				0.1081	0.2558	0.3575	0.4598	0.5969	0.2419
Średnia absorbancja	0	0.1296	0.2443	0.351	0.436	0.5777	0.2365

5. Opracowanie wyników: Po sporządzeniu krzywej kalibracyjnej (Ryc.1.) wyznaczono równanie prostej, na podstawie którego obliczono stężenie białka w badanej próbce (x1). Następnie obliczono błąd bezwzględny (Δx) i błąd względny (δ). Rzeczywiste stężenie badanej próbki (x) wynosiło 350 [μg/ml].

Ryc.1. Wykres krzywej kalibracyjnej dla roztworów albuminy wołowej.

x1= (y1 + 0.01)/ 0.559 = (0.2365+0.01)/0.559 = 0.4409 [mg/ml] = 440.9 [μg/ml]

Δx= |x-x1| = |350 - 440.9| = 90.9 [μg/ml]

δ = Δx/ x = (90.9/ 350) * 100% = 0.2597 * 100% = 25.97%

6. Omówienie wyników:

Uzyskane stężenie odbiega od stężenia rzeczywistego białka w badanej próbce, które wynosiło 350 μg/ml, dlatego też błąd względny jest stosunkowo duży i wynosi 25.97%. Przyczyną tak dużego błędu mogło być niedokładne pipetowanie, co skutkowało niepowtarzalnością zmierzonej absorbancji dla kolejnych powtórzeń próbek wzorcowych. Błędy w przygotowaniu próbek są najczęstszymi przyczynami uzyskiwania wyników, które odbiegają od wartości rzeczywistych. Próbki zostały przygotowane przez kilka osób, a każda osoba posiada inne zdolnosci manulane. Przyczyną błędów mogły być także substancje obce (co zostało omówione we wstępie teoretycznym), które zmieniają wartość absorbancji roztworu właściwego. Dodatkowo stosunkowo różny czas inkubacji próbek mógł w nieznaczny sposób przyczynić się do odstępstw w pomiarze absorbancji dla kolejnych próbek i tym samym do błędu względnego.

---